Abstrak— Isolasi dan identifikasi bakteri termofilik dari sumber mata air panas Songgoriti, Malang telah dilakukan di Laboratorium Kimia Mikroorganisme. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui bakteri-bakteri termofilik yang terdapat di sumber mata air panas Songgoriti dan mencari bakteri termofilik yang berpotensial untuk dikembangkan secara aplikatif. Bakteri termofilik yang diisolasi setelah inkubasi hari kedua, diberi nama isolat A,B, C dan D. Bakteri A,B dan D merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang sedangkan bakteri C merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang. Identifikasi bakteri ditentukan dengan berbagai uji, yaitu: uji oksidasi, uji fermentasi glukosa, dan uji Na+
. Menurut morfologi dan fisiologinya, isolat A, B dan D merupakan bakteri yang berasal dari genus Vibrio sp sedangkan isolat C merupakan bakteri dari genus Bacillus sp.
Kata kunci: Bacillus sp, bakteri termofilik, sumber mata
air panas, Vibrio sp,
I. PENDAHULUAN
ndonesia merupakan negara yang memiliki keadaan geografis yang sangat dimungkinkan mengandung bakteri-bakteri termofilik karena Indonesia memiliki banyak gunung berapi serta sumber air panas. Beberapa bakteri termofilik berhasil diisolasi dari berbagai sumber air panas di Indonesia antara lain bakteri termofil sumber mata air panas di Pacet (8 genus bakteri antara lain Thermus sp, Acetogenium sp, Bacillus sp, Thermodesulfobacterium sp, Thermomicobrium sp, Thermotrix sp, Pseudomonas sp, dan Sulfobacillus sp) (Asnawi, 2006). Selain itu, mikroorganisme termofilik juga berhasil diisolasi dari sumber air panas Danau Ranau Sumatera Selatan dan didapat dua isolat yang merupakan genus Bacillus sp (Muharni, 2010). Bakteri termofilik juga ditemukan dari sumur minyak bumi Jatibarang. Isolat-isolat tersebut hidup dalam kondisi oksigen yang relatif sedikit dengan suhu 40-90 °C. Isolat-isolat tersebut diinkubasi pada suhu 45 °C dan didapatkan 12 isolat. Beberapa bakteri mampu hidup dengan suhu di atas 55 °C. Isolat tersebut diidentifikasi sebagai Pseudomonas aeruginosa , P. putida ,
P. diminuta , Bacillus circulans dan Geobacillus stearothermophilus (Mustafa, 2006).
Mikroorganisme termofilik memiliki kemampuan bertahan pada suhu tinggi karena adanya enzim termostabil (Brock, 1978). Selain itu, protein yang terdapat pada sel mikroorganisme termofilik memiliki ikatan hidrofobik dan ikatan ionik yang sangat kuat. Komposisi membran sel pada bakteri termofilik tersusun oleh asam lemak jenuh sehingga dapat bersifat stabil pada suhu tinggi (Lasa & Berenguer, 1993).
Bakteri termofilik dapat dimanfaatkan dalam bidang bioteknologi karena memiliki efisiensi dalam keadaan suhu tinggi. Semakin tinggi temperatur maka semakin tinggi pula laju difusi. Selain itu, enzim pada bakteri termofilik juga mampu mengakatalisis reaksi biokimia pada suhu tinggi dan umumnya lebih stabil dari bakteri mesofilik. Enzim yang terdapat pada bakteri termofilik juga dapat dimanfaatkan pada industri antara lain enzim amylase, selulase, xilanase, kitinase dan protease (Brock, 1986). Protease dapat digunakan untuk beberapa aplikasi seperti detergen, farmasi, pengempukan daging dan proses pengolahan limbah industri (Nascimento & Martin, 2006).
Mikroorganisme termofilik di Indonesia banyak ditemukan di sumber air panas atau di daerah gunung berapi sehingga mikroorganisme tersebut biasanya hidup pada pH asam dan hidup pada daerah yang banyak mengandung belerang.
Penelitian mengenai bakteri termofilik dari Sumber Mata Air Panas Songgoriti belum banyak dilakukan. Selain itu, penelitian ini dilakukan karena daerah tersebut memiliki struktur batuan andesit dan basal yang menyebabkan adanya aktivitas geotermal yang cukup besar sehingga dimungkinan adanya bakteri termofilik . Penelitian ini dilakukan dengan cara mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri termofilik dari sumber air panas Songgoriti hingga diketahui genus dari isolat bakteri tersebut. Isolat bakteri tersebut diidentifikasi dengan menggunakan metode yang terdapat pada second edition of Bergeys Manual. Identifikasi bakteri dilakukan melalui pengamatan mikroskopis dengan metode pewarnaan gram, uji oksidasi, uji fermentasi glukosa, uji Na+ , pewarnaan spora dan uji strict anaerob.
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
TERMOFILIK DARI SUMBER MATA AIR
PANAS DI SONGGORITI SETELAH DUA
HARI INKUBASI
Maria Yuli Endah Pratita, Surya Rosa Putra*
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111
(*) Dosen Pembimbing
E-mail: srputra@chem.its.ac.id
II. METODEPENELITIAN 2.1 Pengambilan Sampel Air Panas
Pengambilan sampel dilakukan di sumber air panas Songgoriti. Pengukuran parameter fisika dan kimia dilakukan terlebih dahulu sebelum sampel air diambil. Parameter yang diamati adalah suhu dan pH. Parameter suhu diukur menggunakan thermometer yang dimasukkan ke dalam air dan dibiarkan selama 1 menit. Parameter suhu dilakukan menggunakan kertas pH meter yang dicelupkan di permukaan air. Sampel air diambil dari kolam pada kedalaman 50 cm dari permukaan air lalu dimasukkan ke dalam termos. Sampel air tersebut lalu dibawa ke Laboratorium Kimia Mikroorganisme Jurusan kimia ITS supaya dapat dilakukan isolasi.
2.2 Isolasi dan Pemurnian Bakteri
Sampel air diambil sebanyak 100µL dan ditambahkan ke dalam 10 ml media thermos broth. Setelah itu larutan tersebut diinkubasi selama 2 hari di dalam oven dengan suhu 55 °C. Setelah diinkubasi, media tersebut diambil sebanyak 10 µL dan dilakukan pengenceran hingga 10-12. Hasil pengenceran tersebut lalu diambil 10 µL dan dipindahkan ke media agar lalu diratakan dengan menggunakan stik L. Setelah itu dilakukan inkubasi selama 1 hari. Setelah itu koloni bakteri yang nampak dipindahkan ke media agar yang telah steril. Isolat Bakteri tersebut diberi nama A, B, C dan D.
2.3 Identifikasi dan Karakterisasi Isolat Bakteri 2.3.1 Pewarnaan Gram
Isolat bakteri A diambil 1 ose dan digores-goreskan pada permukaan preparat steril kemudian dilakukan fiksasi. Kristal violet sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan preparat yang terdapat lapisan bakteri tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit, preparat dibilas dengan air sampai zat warna luntur. Preparat dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, larutan iod sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan preparat tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit, preparat dibilas dengan air. Preparat dibilas dengan alkohol 96% sampai semua zat warna luntur kemudian dicuci dengan air. Preparat dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, safranin sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan preparat dan didiamkan selama 45 detik. Preparat dicuci dengan air dan dikeringkan. Preparat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 1000x. Pewarnaan diulang untuk isolat bakteri B, C dan D.
2.3.2 Uji Oksidasi
Reagen oksidasi, yaitu N,N,N,N-tetrametil-p-fenildiamin (TMPD) dituang pada kertas saring. Isolat bakteri A diambil dan digoreskan pada kertas saring tersebut. Pengambilan isolat bakteri tidak boleh menggunakan alat yang berasal dari logam (harus dari kayu atau plastik). Reaksi ditunggu selama 30 detik. Hasil positif ditandai dengan munculnya warna ungu, sedangkan hasil negatif
ditandaidengan munculnya warna merah muda. Uji diulang untuk isolat bakteri B dan D
2.3.3 Uji Fermentasi Glukosa
Isolat bakteri A diambil 1 ose dan dimasukkan ke dalam media Phenol red broth glucose lalu diaduk. Media yang telah berisi isolat, diinkubasi selama 2 hari. Perubahan warna yang terjadi diamati. Warna merah mengindikasikan tidak adanya asam, sedangkan warna kuning mengindikasikan adanya asam. Uji diulang untuk isolat bakteri B dan D
2.3.4 Uji Na+
Isolat bakteri A diambil 1 ose dan digoreskan ke dalam tabung reaksi yang berisi media uji Na+ kemudian diinkubasi 1 hari. Hasil positif ditandai dengan adanya pertumbuhan bakteri pada media Na+, sedangkan hasil negatif ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan bakteri. Uji diulang untuk isolat bakteri B dan D
2.3.5 Pewarnaan Endospora
Pewarnaan spora dilakukan untuk isolat bakteri C. Isolat bakteri c diambil sebanyak 1 ose dan digoreskan pada permukaan preparat steril kemudian dilakukan fiksasi. Preparat yang telah diberi bakteri tersebut lalu dibungkus dengan menggunakan kertas saring lalu ditetesi malachite green sebanyak 1 tetes dan didiamkan selama 4 menit. Setelah itu kertas saring dilepaskan dan preparat dibilas dengan air mengalir. Setelah itu preparat dikeringkan di atas api spiritus. Setelah preparat kering, safranin sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan preparat. Preparat tersebut kemudian didiamkan selama 5 menit. Preparat kemudian diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 1000x. 2.3.6 Uji Strict Anaerob
Isolat C diinokulasi pada media Thioglycollate agar yang
telah dipanaskan pada suhu 50°C selama beberapa menit lalu dihomogenkan. Tabung tersebut kemudian diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu 37°C.
III. HASILDANDISKUSI 3.1 Karakteristik Sampel Air
3.2 Karakterisasi Bakteri Termofilik Setelah Hari Kedua Inkubasi
Pada inkubasi hari pertama didapatkan 4 koloni bakteri sedangkan pada inkubasi hari ke-2 diperoleh 94 koloni dan dipilih 4 koloni. Inkubasi dilakukan dan pemurnian bakteri dilakukan pada media padat NA. Isolat yang diperoleh pada hari pertama diberi nama isolat S1, S2, S3, dan S4 sedangkan isolat yang diperoleh pada hari kedua inkubasi diberi nama isolat A, B, C, dan D. Identifikasi dan karakterisasi dilakukan berdasarkan metode dari referensi second edition of Bergeys Manual. Isolat-isolat yang ada ditentukan morfologinya terlebih dahulu untuk membantu uji kimia yang dilakukan selanjutnya. Uji biokimia yang dilakukan dapat ditentukan dari jenis morfologi dari isolat-isolat tersebut.
3.2.1 Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Pada pewarnaan Gram, hasil yang didapat akan ditentukan dari komposisi dinding sel pada bakteri. Pada pewarnaan Gram ini, reagen yang digunakan ada 4 jenis, yaitu kristal violet, iodin, alkohol dan safranin. Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal violet sehingga ketika diamati dengan mikroskop akan menunjukkan warna ungu sedangkan bakteri Gram negatif tidak dapat mempertahankan warna ungu dari Kristal violet tetapi zat warna safranin dapat terserap pada dinding sel sehingga pada saat dilihat menggunakan mikroskop akan memperlihatkan warna merah.Hasil pewarnaan Gram dapat digunakan untuk mengetahui bentuk morfologi dari keempat jenis isolat yaitu warna dan bentuk sel bakteri tersebut. Berdasarkan referensi second edition of Bergeys Manual, uji biokimia untuk Gram negatif adalah uji oksidasi sedangkan untuk Gram positif dapat dilakukan pewarnaan endospora.
Hasil dari pewarnaan Gram isolat A, B, C dan D dapat dilihat pada gambar 4.1.
Gambar 4.1 Hasl pewarnaan Gram Isolat A, B, C dan D
Hasil pewarnaan Gram untuk isolat A,B dan D menunjukkan bentuk sel batang (bacill) berwarna merah. Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa isolat A merupakan bakteri Gram negatif.
Hasil pewarnaan gram untuk isolat C menunjukkan bentuk sel batang (bacill) berwarna ungu. Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa isolat C merupakan bakteri Gram positif.
Setelah mengetahui Gram dari isolat-isolat A, B, C dan D maka dilakukan uji oksidasi untuk isolat bakteri Gram negatif dan pewarnaan spora untuk isolat bakteri Gram positif. Uji oksidasi dan pewarnaan endospora dilakukan untuk mendapatkan genus yang lebih spesifik dari isolat-isolat tersebut.
3.2.2 Uji Oksidasi
Uji oksidasi digunakan ini untuk mengetahui bakteri yang menghasilkan enzim sitokrom oksidase. Pada uji oksidasi ini digunakan reagen berupa N,N,N,N-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD). Reagen tersebut merupakan indikator redoks dalam mengukur aktivitas enzim sitokrom oksidase yang terjadi pada bakteri. Enzim sitokrom oksidase merupakn enzim kompleks yang berperan dalam fosforilasi oksidatif.
Hasil pada isolat bakteri A menunjukkan hasil positif untuk uji ini dengan timbulnya warna ungu setelah direaksikan dengan reagen ini. Hal tersebut menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri aerob yang memiliki enzim sitokrom c oksidase. Menurut buku panduan second edition of Bergeys Manual , kemungkinan isolat berasal dari kelompok bakteri Aeromonas sp, Pseudomonas sp dan Vibrio sp.
Hasil pada isolat bakteri B dan D juga menunjukkan hasil positif untuk uji oksidasi yang ditandai dengan timbulnya warna ungu setelah direaksikan reagen TMPD. Isolat bakteri tersebut merupakan bakteri aerob yang juga memiliki enzim sitokrom c oksidase. Isolat bakteri B juga merupakan isolat bakteri yang berasal dari dari kelompok bakteri Aeromonas sp, Pseudomonas sp dan Vibrio sp.
Uji biokimia untuk isolat A, B dan D adalah uji fermentasi glukosa untuk mengelompokkan bakteri menjadi kelompok yang lebih kecil yaitu Aeromonas sp dan Vibrio sp. 3.2.3 Uji Fermentasi Glukosa
Uji fermentasi glukosa digunakan untuk mengetahui apakah isolat bakteri tersebut dapat melakukan fermentasi glukosa. Perubahan warna yang terjadi pada media menunjukkan adanya asam sebagai hasil dari proses fermentasi glukosa. Pada saat fermentasi, hanya bakteri yang bersifat aerob fakultatif yang dapat melakukan fermentasi glukosa sedangkan bakteri yang bersifat aerob obligat tidak dapat melakukan proses fermentasi glukosa ini.
Hasil pada isolat bakteri A, B dan D menunjukkan bahwa isolat dapat melakukan fermentasi glukosa ditunjukkan dengan adanya perubahan warna pada media dari warna merah menjadi kuning. Kemungkinan genus untuk isolat C berasal dari kelompok bakteri Vibrio sp dan Aeromonas sp.
Pada hari kedua inkubasi dapat dilihat bahwa isolat A,B dan D merupakan bakteri aerob fakultatif yang mampu memfermentasikan glukosa menjadi asam piruvat.
Uji berikutnya untuk isolat A, B dan D adalah uji Na+ yang dilakukan untuk mendapatkan genus dari isolat bakteri A, B dan D.
A B
4.3.4 Uji Na+
Uji Na+ dilakukan untuk membedakan antara kelompok bakteri Vibrio sp dan Aeromonas sp. Kelompok bakteri Vibrio sp merupakan kelompok bakteri halotoleran yang akan mampu bertahan pada lingkungan yang memiliki kadar mineral yang tinggi.Uji Na+ dilakukan untuk membedakan antara kelompok bakteri Vibrio sp dan Aeromonas sp.
Hasil pada isolat bakteri A, B dan D menunjukkan bahwa bakteri tersebut positif terhadap uji Na+ dengan adanya pertumbuhan bakteri pada media yang mengandung 6% NaCl. Berdasarkan hasil uji-uji biokimia tersebut, isolat A, B dan D merupakan bakteri dari genus Vibrio sp.
Kelompok bakteri Vibrio sp merupakan bakteri yang dapat hidup pada lingkungan yang memiliki kadar mineral yang cukup tinggi. Pada bakteri Vibrio sp terdapat kandungan KCl yang memampukan bakteri tersebut dapat bertahan hidup dari tekanan osmosis. Kelompok bakteri Vibrio biasa ditemukan pada daerah yang memiliki kadar Na+ yang cukup tinggi seperti air laut dan pegunungan. Hal tersebut yang memungkinkan bakteri Vibrio ditemukan di lingkungan Songgoriti.
4.3.5 Pewarnaan Endospora
Bakteri C merupakan bakteri gram positif. Menurut second edition of Bergeys Manual untuk mengetahui genus dari bakteri gram positif tersebut harus dilakukan pewarnaan endospora.
Pada pewarnaan endospora, reagen yang digunakan adalah malachite green dan safranin untuk pewarnaan spora. Hasil dari pewarnaan endospora pada bakteri C setelah dilihat dengan menggunakan mikroskop menunjukkan warna hijau yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut memiliki endospora.
Endospora merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim seperti kering, pemanasan dan keadaan asam. Endospora berbentuk sangat padat dan refraktil karena memiliki kandungan air yang sangat rendah. Bakteri yang memiliki endospora sangat sulit diwarnai sehingga dibutuhkan pewarnaan spesifik. Pewarna spesifik yang digunakan adalah malachite green. Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. Bakteri yang menghasilkan spora akan mengikat kuat senyawa pewarna yaitu malachite green dan ketika dilakukan pewarnaan selanjutnya menggunakan safranin, sel spora tidak dapat berikatan dengan pewarna lain karena sudah berikatan dengan malachite green. Oleh karena itu warna bakteri spora adalah hijau. Bakteri yang tidak memiliki spora cenderung tidak tahan terhadap pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai dengan malachite, sel vegetatif akan mampu berikatan dengan pewarna tersebut tetapi dapat dilunturkan setelah dilakukan pencucian karena tidak berikatan kuat dengan pewarna malachite green. Setelah itu dilakukan pengecatan dengan menggunakan safranin dan sel vegetatif akan berikatan dengan pewarna safranin sehingga warna yang dihasilkan ketika diamati oleh mikroskop akan menunjukkan warna merah muda (Assani,1994).
Hasil dari pewarnaan endospora isolat C menunjukkan bahwa bakteri C menunjukkan hasil positif dengan adanya warna hijau setelah dilakukan pewarnaan endospora. Hal
tersebut menunjukkan bahwa kemungkinan bakteri untuk isolat C adalah bakteri Clostridium sp dan Bacillus sp. Uji selanjutnya untuk isolat C menurut second edition of Bergeys Manual adalah uji strict anaerob.
Endospora yang dimiliki oleh isolat C tersebut yang memungkinkan isolat bakteri tersebut ditemukan di lingkungan Sumber Air Panas Songgoriti. Endospora pada bakteri ini berfungsi untuk melindungi bakteri dari suhu tinggi.
4.3.6 Uji Strict Anaerob
Pada uji strict anaerob ini, media yang digunakan merupakan media Thioglycollate agar. Thyoglycollate agar ini digunakan untuk mengetahui hubungan antara oksigen dengan mikroorganisme. Media ini terbuat dari asam thyoglicolic dengan agar yang akan mencegah masuknya oksigen ke dalam media. Media ini juga memiliki indikator berupa resazurin yang digunakan untuk mengetahui keberadaan oksigen pada media. Resazurin akan berwarna merah ketika di dalam media terdapat oksigen dan akan semakin memudar dengan berkurangnya kandungan oksigen pada media.
Berdasarkan hasil dari uji strict anaerob, diketahui bahwa bakteri tersebut negatif terhadap uji ini karena bakteri tersebut tumbuh pada permukaan media thioglycollate agar. Bakteri yang tumbuh pada permukaan media merupakan bakteri yang bersifat aerob karena pada inokulasi awal oksigen hanya berada di daerah permukaan media. Hal tersebut ditunjukkan dengan adanya perbedaan warna pada media awal uji strict anaerob. Pada media thioglycollate agar yang belum ditanami bakteri, media akan memiliki dua warna yaitu merah muda dan kuning. Menurut second edition of Bergeys manual , bakteri yang ditemukan merupakan bakteri dari genus Bacillus sp. Bacillus sp merupakan bakteri yang berasal dari genus Gram positif yang memiliki sifat aerob obligat maupun aerob fakultatif dan membentuk endospora pada kondisi lingkungan tertentu.
IV. KESIMPULAN
DAFTARPUSTAKA
[1] Asnawi, Hafid, “Keanekaragaman Bakteri Termofilik yang Terdapat Dalam Sumber Mata Air Panas di Taman Wisata Padusan Pacet, Kabupaten Mojokerto, Jawa Timur”, Jurusan Biologi FMIPA, UM, (2006).
[2] Assani, S., Mikrobiologi Kedokteran. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta, (1994).
[3] Brock, Thomas D., “Thermophilic Microorganisms and Life at High Temperatures”, Springer-Verlag. ISBN 0-387-90309-7, (1978).
[4] Edwards C., “Thermophiles”. In: Edwards C (ed) Microbiology of extreme environments. Open University, Oxford, (1990), P1-32.
[5] Lasa I., Berenguer J., “Thermophilic enzymes and their biotechnological potential”, Microbiologia SEM, 9, (1993), 77-89.
[6] Muharni, “”Isolasi dan Identifikasi Bakteri penghasil Kitinase dari Sumber Air Panas Danau Ranau Sumatera Selatan”, Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Sriwijaya, Sumatera Utara, (2010).
[7] Mustafa, Irfan, “Pengkajian Potensi Bakteri Penerapan Meor”, Program Studi Bioteknologi, ITB, (2006). [8] Nascimento, W.C.A. and Martins, M.L.L., “Studies on
