BAB I BAB I
PENDAHULUAN PENDAHULUAN
Protease disebut juga peptidase atau proteinase, merupakan
Protease disebut juga peptidase atau proteinase, merupakan enzimenzim golongangolongan hidrolase
hidrolase yang akan memecahyang akan memecah protein protein menjadimenjadi molekulmolekul yang lebih sederhana, sepertiyang lebih sederhana, seperti menjadi
menjadi oligopeptidaoligopeptida pendek pendek atauatau asam amino,asam amino, dengan dengan reaksireaksi hidrolisishidrolisis pada pada ikatanikatan peptida
peptida (Baehaki, Suhartono, Palupi, & Nurhayati, 2008)(Baehaki, Suhartono, Palupi, & Nurhayati, 2008) .. Enzim ini diperlukan olehEnzim ini diperlukan oleh semua
semua makhluk hidup makhluk hidup karena bersifat esensial dalamkarena bersifat esensial dalam metabolisme metabolisme protein. protein. Peranannya Peranannya dalam tubuh antara lain membantu pencernaan protein dalam
dalam tubuh antara lain membantu pencernaan protein dalam makanan,makanan, menggunakan menggunakan kembali protein-protein intraseluler, koagulasi
kembali protein-protein intraseluler, koagulasi sel darah,sel darah, dan akivasi berbagai jenis dan akivasi berbagai jenis protein, enzim dan
protein, enzim dan hormon. hormon.
Infark miokard akut atau yang lebih dikenal dengan serangan jantung Infark miokard akut atau yang lebih dikenal dengan serangan jantung merupakan p
merupakan penyakit enyakit yang teyang terjadi rjadi akibat akibat sumbatan sumbatan bekuan bekuan darah darah (trombus) (trombus) padapada pembuluh
pembuluh darah darah jantung jantung (arteri (arteri koronaria). koronaria). Selain Selain itu, itu, penyakitpenyakit stroke stroke juga juga merupakan penyakit yang disebabkan oleh gumpalan darah pada pembuluh darah otak merupakan penyakit yang disebabkan oleh gumpalan darah pada pembuluh darah otak atau
atau serebrovaskuler. serebrovaskuler. Berdasarkan Berdasarkan data data dari dari Departemen Departemen Kesehatan Kesehatan RepublikRepublik Indonesia
Indonesia pada pada tahun tahun 2002, 2002, penyakit penyakit infark infark miokard miokard akut akut merupakan merupakan penyebabpenyebab kematian u
kematian utama dengan tama dengan angka angka mortalitas 220.000 mortalitas 220.000 (14%). (14%). Pada tahun Pada tahun 2004, 2004, penyakitpenyakit tersebut
tersebut juga juga merupakan merupakan penyebab penyebab kematian kematian utama utama di di dunia. dunia. Terhitung Terhitung sebanyaksebanyak 7.200.000 (12,2%) kematian terjadi akibat penyakit ini di seluruh dunia
7.200.000 (12,2%) kematian terjadi akibat penyakit ini di seluruh dunia (Organization,(Organization, 2008)
2008)..
Tubuh kita
Tubuh kita memiliki memiliki beberapa jabeberapa jalur mekanislur mekanisme untuk me untuk melisiskan melisiskan bekuanbekuan darah
darah dalam dalam pembuluh pembuluh darah. darah. Agen Agen yang yang berperan berperan dalam dalam melisiskan melisiskan bekuan bekuan darahdarah yaitu agen trombolitik. Salah satu agen tersebut adalah enzim streptokinase yang yaitu agen trombolitik. Salah satu agen tersebut adalah enzim streptokinase yang merupakan aktivator plasminogen menjadi plasmin yang berfungsi sebagai pemecah merupakan aktivator plasminogen menjadi plasmin yang berfungsi sebagai pemecah gumpalan darah, karena enzim tersebut bekerja pada sistem pembekuan darah, sehingga gumpalan darah, karena enzim tersebut bekerja pada sistem pembekuan darah, sehingga sering digunakan dalam pengobatan stroke dan serangan jantung. Namun, streptokinase sering digunakan dalam pengobatan stroke dan serangan jantung. Namun, streptokinase memiliki waktu paruh yang pendek karena terjadi pemotongan ikatan peptida oleh memiliki waktu paruh yang pendek karena terjadi pemotongan ikatan peptida oleh plasmin
plasmin pada pada asam asam amino amino berupa berupa lisin lisin atau atau arginin, arginin, sehingga sehingga fungsi fungsi streptokinasestreptokinase sebagai obat tidak tahan lama terhadap penderita
sebagai obat tidak tahan lama terhadap penderita stroke stroke dan serangan jantung dan serangan jantung (FARISSA, Rifqi, & Maharani, 2012)
(FARISSA, Rifqi, & Maharani, 2012)..
Oleh karena itu, dapat dilakukan suatu metode mutagenesis terarah dengan cara Oleh karena itu, dapat dilakukan suatu metode mutagenesis terarah dengan cara melakukan pemotongan ikatan peptida pada situs asam amino streptokinase secara tepat melakukan pemotongan ikatan peptida pada situs asam amino streptokinase secara tepat agar
BAB II BAB II TINJAUAN PUSTAKA TINJAUAN PUSTAKA 2.1. 2.1. StreptokinaseStreptokinase Gambar 1. Streptokinase Gambar 1. Streptokinase Streptokinase adalah
Streptokinase adalah protein protein ekstraseluler ekstraseluler bakteri bakteri yang diproduksi oleh beberapayang diproduksi oleh beberapa galur
galur Streptococcus haemolyticusStreptococcus haemolyticus.. Kemampuan Kemampuan protein protein ini untuk memecahini untuk memecah gumpalan gumpalan darah
darah dilaporkan pertama kali pada tahun 1993.dilaporkan pertama kali pada tahun 1993. ProteinProtein ini hanya terdiri dari satuini hanya terdiri dari satu rantai
rantai molekul molekul dengandengan massa massa 4747 kDa, kDa, 414 asam amino dan memiliki 3 domain yaitu 414 asam amino dan memiliki 3 domain yaitu α
α (1-146), (1-146), ββ (147-290), (147-290), γγ (291-414) (291-414) (WO, Ekroth, Teger-Nilsson, & William-Olsson,(WO, Ekroth, Teger-Nilsson, & William-Olsson, 1981)
1981)..
Streptokinase berguna untuk pengobatan fase dini emboli paru akut dan infark Streptokinase berguna untuk pengobatan fase dini emboli paru akut dan infark miokard akut. Streptokinase mengaktivasi plasminogen dengan cara tidak langsung miokard akut. Streptokinase mengaktivasi plasminogen dengan cara tidak langsung yaitu dengan bergabung terlebih dahulu dengan plasminogen untuk membentuk yaitu dengan bergabung terlebih dahulu dengan plasminogen untuk membentuk kompleks aktivator. Selanjutnya kompleks aktivator tersebut mengkatalisis kompleks aktivator. Selanjutnya kompleks aktivator tersebut mengkatalisis perubahan plasminogen menjadi plasmin.
perubahan plasminogen menjadi plasmin.
Cara kerja streptokinase dalam mengatasi
Cara kerja streptokinase dalam mengatasi penggumpalan darah penggumpalan darah adalah denganadalah dengan berfungsi
berfungsi sebagaisebagai aktivator aktivator plasminogen plasminogen dan protease serin.dan protease serin. PlasminogenPlasminogen memilikimemiliki 791 asam amino, dan memiliki 7 domain yaitu 5 kringle, 1pra-aktivasi, 1 katalitik 791 asam amino, dan memiliki 7 domain yaitu 5 kringle, 1pra-aktivasi, 1 katalitik protease.
protease.
Gambar 2. Plasminogen Gambar 2. Plasminogen
Plasminogen merupakan suatu zimogen (calon enzim) yang akan menjadi enzim aktif (disebut plasmin) apabila diaktifkan oleh suatu molekul aktivator tertentu. Cara mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin adalah dengan memotong ikatan peptida pada plasminogen. Apabila plasmin telah aktif maka enzim plasmin tersebut dengan mendegradasi (menghancurkan protein pembeku atau penggumpal darah. Streptokinase telah digunakan sebagai obat untuk mengatasi penyakit akibat pembekuan atau penggumpalan darah dalam tubuh, seperti infark miokardium.
Streptokinase merupakan senyawa trombolitik, yang mempunyai mekanisme kerja:
1. Mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin. 2. Plasmin melarutkan fibrin (gumpalan darah).
3. Selain melarutkan fibrin, plasmin juga menguraikan streptokinase sehingga streptokinase menjadi tidak aktif.
Gambar 3. Pengaktifkan plasminogen oleh streptokinase
Kegunaan dan permasalahan streptokinase adalah waktu paruh pendek sehingga kerja obat dalam tubuh tidak lama akibat penguraian oleh plasmin, pembentukan anti streptokinase. Penyelesaian masalah: modifikiasi kimia, rekayasa protein. Kegunaannya adalah untuk pengobatan stroke dan infark jantung akut.
Streptokinase masih merupakan pilihan utama dalam terapi stroke dan infark myokardia akut karena harganya relatif lebih murah dibandingkan senyawa fibrinolitik lain. Waktu paruh streptokinase yang pendek salah satunya diakibatkan pemotongan oleh plasmin yang memotong ikatan peptida setelah lisin atau arginin
2.2. Trombolitik
Terapi trombolitik adalah terapi klinis yang ditujukan untuk reperfusi jaringan miokardium dengan memperbaiki aliran darah pada pembuluh darah yang tersumbat. Bekuan darah yang terdapat dalam pembuluh darah akan mengganggu aliran darah ke bagian tubuh yang dialiri oleh pembuluh darah. Hal ini dapat menyebabkan suatu kerusakan serius pada bagian-bagian tubuh. Jika bekuan terdapat pada arteri yang memasok darah ke jantung, maka dapat menyebabkan serangan jantung, jika bekuan terdapat pada aliran darah ke otak, maka dapat terjadi stroke (Hartono, Soerarso, & Rampengan, 2011).
Efektivitas obat trombolitik bergantung pada umur gumpalan. Gumpalan yang lebih lama memiliki fibrin yang berhubungan silang dan lebih padat. Oleh karena itu, gumpalan lebih sulit dilarutkan. Untuk mengobati infark miokardial akut, obat trombolitik idealnya diberikan dalam 2 jam pertama. Lebih dari itu, efektivitasnya berkurang dan dosis yang lebih tinggi dibutuhkan untuk mencapai lisis yang diharapkan.
Berbeda dengan antikoagulan yang mencegah terbentuk dan meluasnya tromboemboli, trombolitik melarutkan trombus yang sudah terbentuk. Agar efektif trombolitik harus diberikan sedini mungkin. Indikasi golongan obat ini ialah untuk infark miokard akut, trombosis vena dalam dan emboli paru, tromboemboli arteri, melarutkan bekuan darah pada katup jantung buatan dan kateter intravena.
1. Efek samping Trombolitik
Trombolitik dapat menyebabkan perdarahan. Meskipun rt-PA menyebabkan fibrinogenolisis yang lebih sedikit dibandingkan dengan streptokinase dan urokinase, selektivitas terhadap bekuan darah nampaknya tidak mengurangi risiko timbulnya perdarahan. Bila perdarahan hebat obat harus dihentikan dan mungkin diperlukan transfusi darah. Untuk mengatasi fibrinolisis dengan cepat dapat diberikan asam aminokaproat, suatu inhibitor fibrinolisis, secara IV lambat. Bradikardia dan aritmia dapat terjadi pada penggunaan obat ini pada pasien infark miokard akut, yang biasanya digunakan sebagai petunjuk terjadinya reperfusi. Efek samping lain mual, muntah. Streptokinase yang merupakan protein asing dapat menyebabkan reaksi alergi seperti pruritus, urtikaria, flushing , kadang-kadang angioedema, bronkospasme. Reaksi alergi ringan juga dilaporkan pada penggunaan urokinase dan rt-PA yang nonantigenik.
Obat-obat trombolitik digunakan untuk melarutkan gumpalan darah (trombi). Gumpalan darah dapat terbentuk pada semua pembuluh darah, namun ketika terbentuk di pembuluh darah koroner, serebral atau pulmonal, akan mengancam hidup, trombi koroner dapat menyebabkan infark miokard, trombi pembuluh darah serebral dapat menyebabkan stroke, tromboemboli pulmoner dapat menyebabkan gagal jantung dan gagal napas. Oleh karena itu, penting untuk mendiagnosis cepat dan menangani gumpalan darah.
2. Mekanisme Thrombolisis
Obat trombolitik melarutkan gumpalan darah dengan mengaktifkan plasminogen yang membentuk produk yang disebut plasmin. Plasmin adalah enzim penghancur protein yang dapat memutuskan ikatan antara molekul fibrin, yang menyusun gumpalan darah. Karena mekanisme ini, obat trombolitik disebut juga ‘aktivator plasminogen’ dan ’obat fibrinolitik’.
Ada tiga kelas utama obat fibrinolitik, yaitu Aktivator Plasminogen Jaringan (tPA), Streptokinase (SK), dan Urokinase (UK). Meskipun obat-obat ini dapat melarutkan gumpalan darah namun berbeda dalam mekanismenya.
Gambar 4. Mekanisme Trombolitik
Gambar di atas menggambarkan mekanisme fibrinolitik tPA dan SK. Turunan tPA adalah obat trombolitik yang paling sering digunakan terutama untuk gumpalan darah di koroner dan pembuluh darah serebral, karena kekhususannya mengaktifkan plasminogen yang terikat di fibrin. Mekanisme tPA
menghancurkan gumpalan yaitu tPA terikat ke fibrin di permukaan gumpalan darah, mengaktivasi plasminogen yang terikat ke fibrin. Plasmin dilepaskan dari plasminogen yang terikat fibrin, kemudian molekul fibrin dihancurkan oleh plasmin dan gumpalan terlarut.
Plasmin adalah protease yang dapat menghancurkan molekul fibrin, sehingga dapat melarutkan gumpalan. Namun, plasmin juga dapat menghancurkan protein sistemik lain termasuk fibrinogen. Namun karena spesifitas fibrin yang dihancurkan oleh tPA, pelarutan gumpalan dari fibrinogen sirkulasi lebih sedikit dari pada SK dan UK. Meskipun tPA cenderung selektif untuk plasminogen yang terikat pada fibrin, tPA mengaktifkan plasminogen sirkulasi dengan melepaskan plasmin yang menyebabkan penghancuran fibrinogen sirkulasi dan menimbulkan keadaan fibrinolitik sistemik. Dalam keadaan normal, α2-antiplasmin yang bersirkulasi dalam darah menginaktifkan plasmin tetapi dosis terapetik tPA dan SK menyebabkan pembentukan plasmin berkurang untuk mengatasi konsentrasi α2-antiplasmin yang bersirkulasi. Secara ringkas, meskipun tPA relatif selektif bekerja pada fibrin gumpalan darah, tetapi dapat memicu keadaan lisis sistemik
dan perdarahan yang tidak diharapkan (Patrisia, 2009).
Berikut ini adalah penyakit yang disebabkan oleh penggumpalan darah : a. Serangan Jantung (Infark Miokard Akut)
Gambar 5. Infark Miokard (IM)
Infark Miokard Akut adalah iskemia atau nekrosis miokard yang disebabkan karena penurunan aliran darah keotot jantung. Infark miokard (IM), dikenal sebagai serangan jantung, terjadi ketika sekelompok otot jantung mati karena penyumbatan mendadak dari arteri koroner (trombosis koroner). Hal ini biasanya disertai dengan nyeri dada luar biasa dan sejumlah kerusakan jantung (Jamal, 2004).
Pemblokiran arteri koroner yang paling sering disebabkan oleh kondisi yang disebutaterosklerosis, yang merupakan penumpukan zat lemak secara bertahap dalam alirandarah di sepanjang lapisan dalam arteri yang membatasi aliran darah ke jantung. Zat-zat ini juga dapat membuat massa abnormal dari trombosit yang menjadibekuan darah. Jaringan parut yang dihasilkan dari otot mati pada IM mengubah pola aktivitas listrik jantung. Perubahan-perubahan dalam pola listrik ini terlihat dengan jelas dalam uji elektrokardiografi (EKG), sehingga alat ini sangat penting untuk mendiagnosis IM.
Salah satu yang menyebabkan sumbatan tersebut adalah terbentuknya gumpalan darah yang disebut trombosis yang dapat terjadi di otak ( cerebral stroke) maupun di jantung (myocardial infarction) ini dapat mengakibatkan cacat (disability) bahkan kematian. Gumpalan darah ini bisa dihancurkan oleh enzim-enzim fibrinolitik karena mengandung fibrinogen sebagai protein utama. Pada manusia, reaksi penguraian serat-serat fibrin terjadi melalui kerja enzim plasmin.
Pasien infark miokard akut memerlukan trombolitik bila nyeri dada timbul sekurang-kurangnya selama 30 menit dan peningkatan segmen ST persisten dan refrakter terhadap nitrogliserin sublingual. Obat-obat yang termasuk golongan trombolitik ialah streptokinase, urokinase, aktivator plasminogen, rt-PA ( Recombinant Human Tissue-Type Plasminogen Activator ). Kelompok obat ini sangat mahal.
Sebelum pengobatan dimulai heparin harus dihentikan (kecuali pada pasien infark miokard akut yang memerlukan pengobatan segera) dan selanjutnya dilakukan pemeriksaan laboratorium yaitu waktu trombin ( TT ), prothrombin time, activated partial thromboplastin time (aPTT ), hematokrit, kadar fibrinogen dan hitung trombosit, untuk menentukan ada tidaknya perdarahan. TT dan aPTT harus kurang dari 2 kali nilai normal pada awal terapi.
b. Stroke
Sebagian besar peristiwa stroke terjadi akibat penutupan saluran arteri di otak oleh gumpalan darah. Oleh sebab itu penggunaan obat-obat peluntur darah beku dapat mereduksi kerusakan otak akibat stroke. Salah satu metode yang sering digunakan dalam medis adalah memanfaatkan enzim-enzim fibrinolitik dalam terapi penyakit trombosis. Berbagai macam enzim fibrinolitik misalnya urokinase, streptokinase, rekombinan plasminogen aktivator jaringan, stafilokinase, dan rekombinan prourokinase telah dipelajari secara luas dan dipakai sebagai obat anti trombosis melalui intravenous (injeksi, infusi, transfusi, atau aspirasi). Namun, obat-obat ini harganya mahal dan kemampuannya terbatas (misalnya mudah hancur dan dapat menimbulkan pendarahan). Oleh karena itu, obat-obat anti beku darah baru yang memiliki kefektifan lebih baik dan efek samping yang lebih rendah sangat diperlukan.
Stroke adalah serangan otak yang timbulnya mendadak akibat tersumbat atau pecahnya pembuluh darah otak. Dengan kata lain penyakit stroke ini merupakan penyakit pembuluh darah otak (serebrovaskuler) yang ditandai dengan kematian jaringan otak (infark serebral) hal ini disebabkan karenakan adanya penyumbatan, penyempitan atau pecahnya pembuluh darah menuju otak se hingga pasokan darah
dan oksigen ke otak berkurang dan menimbulkan serangkaian reaksi biokimia yang akan merusakkan atau mematikan sel-sel saraf otak (Donnan et al., 1996).
Jumlah penderita stroke di Indonesia semakin meningkat tiap tahunnya. Pada akhir tahun 2012 lalu, sebuah lembaga mencatat telah terjadi sekitar 500.000 kasus penderita stroke dengan angka 12.500 orang meninggal akibat penyakit tersebut. Sementara sisanya mengalami cacat, baik ringan maupun berat. Karena itu pengobatan awal serta pencegahan menjadi peran penting dalam menangani stroke.
2.3.Bakteri Bacillus Subttilis
Bacillus subtilis termasuk jenis Bacillus. Bakteri ini termasuk bakteri gram positif, katalase positif yang umum ditemukan di tanah. Bacillus subtilis mempunyai kemampuan untuk membentuk endospora yang protektif yang memberi kemampuan bakteri tersebut mentolerir keadaan yang ekstrim. Tidak seperti spesies lain seperti sejarah, Bacillus subtilis diklasifikasikan sebagai obligat anaerob. Bacillus subtilis tidak dianggap sebagai patogen walaupun kontaminasi makanan tetapi jarang menyebabkan keracunan makanan. Sporanya dapat tahan terhadap panas tinggi yang sering digunakan pada makanan dan bertanggung jawab terhadap kerusakan pada roti.
Bacillus subtilis selnya berbentuk basil, ada yang tebal dan yang tipis. Biasanya bentuk rantai atau terpisah. Sebagian motil dan adapula yang non motil. Semua membentuk endospora yang berbentuk bulat dan oval. Baccillus subtlis merupakan jenis kelompok bakteri termofilik yang dapat tumbuh pada kisaran suhu 45°C – 55°C dan mempunyai pertumbuhan suhu optimum pada suhu 60°C – 80°(Wong, Ye, & Nathoo, 1994).
Bacilus Subtilis ini awalnya bernama Vibro subtilis oleh Christian Gottfried Ehrenberg pada tahun 1835. Kemudian nama bacillus subtilis dikenalkan oleh Ferdinand Cohn pada 1872. B. subtilis telah digunakan sepanjang 1950 sebagai alternatif dari obat karena efek immunostimulatory sel dari masalah, yang pada pencernaan telah ditemukan secara signifikan untuk kekebalan aktivasi antibodi spesifik GM, IgG ,dan Iga keluarnya. Bakteri ini dipasarkan di seluruh Amerika dan Eropa dari 1946 sebagai immunostimulatory bantuan dalam usus dan perawatan dari penyakit urinary tract seperti Rotavirus
dan Shigella, tetapi ditolak popularitasnya setelah pengenalan konsumen antibiotik murah walaupun kurang menyebabkan reaksi alergi kesempatan yang cukup rendah dan racun normal flora usus.
Bacillus subtilis tidak dianggap sebagai manusia pathogen, dapat mencemari makanan tetapi jarang menyebabkan keracunan makanan. Bacillus subtilis menghasilkan enzim proteolitik subtilisin. Bacillus subtilis spores dapat hidup yang ekstrim pemanasan yang sering digunakan untuk memasak makanan, dan bertanggung jawab untuk menyebabkan kekentalan yang lengket, membenang konsistensi yang disebabkan oleh bakteri produksi panjang rantai polisakarida.
Bacillus subtilis dapat membagi asymmetrically, memproduksi sebuah endospora yang tahan terhadap faktor lingkungan seperti panas, asam, dan garam, yang dapat berada di dalam lingkungan dalam jangka waktu yang lama. Endospora adalah yang dibentuk pada saat gizi stres, memungkinkan organisme untuk terus berada di dalam lingkungan sampai kondisi menjadi baik. Sebelum proses untuk menghasilkan spora bakteri melalui proses produksi flagella dan
mengambil DNA dari lingkungan.
Bacillus subtilis terbukti untuk manipulasi genetik, karena itu telah menjadi banyak diadopsi sebagai model organisme untuk penelitian laboratorium, terutama dari sporulation, yang merupakan contoh sederhana dari diferensiasi selular.
Bacillus subtilis memiliki sekitar 4.100 gen. Dari jumlah tersebut, hanya 192 yang ditampilkan. Mayoritas gen yang penting dalam kategori domain relatif sedikit dari metabolisme sel, dengan sekitar separuh yang terlibat dalam pengolahan informasi, satu-kelima yang terlibat dalam sintesis dari sel amplop
dan penentuan bentuk dan divisi sel, dan satu-kesepuluh yang berkaitan dengan sel energetika.
Aplikasi bakteri ini dalam industri cukup banyak. Bacillus subtilis merupakan salah satu yang paling banyak digunakan untuk produksi enzim dan bahan kimia khusus. Aplikasi industri termasuk produksi amilase, protease,
inosine, ribosides, dan asam amino. Selain itu, aplikasinya banyak sekali. Enzymes diproduksi oleh B. subtilis dan B. licheniformis secara luas digunakan sebagai tambahan dalam laundry deterjen. Kemudian bakteri ini dapat memainkan peran dalam pengamanan limbah radionuklida [misalnya Thorium (IV) dan Plutonium (IV)] pembuangan dengan mengikat sifat proton dari permukaan.
Keguanaan lain bakteri ini cukup banyak sekarang dangan berkembangnya teknologi. B. subtilis strain QST 713 (dipasarkan sebagai QST 713 atau serenade) memiliki alam berhubung dgn fungisida aktivitas, dan bekerja sebagai agen kontrol biologi. populer di seluruh dunia sebelum pengenalan konsumen antibiotik immunostimulatory sebagai agen untuk membantu perawatan gastrointestinal dan penyakit urinary tract. Hal ini masih banyak digunakan di Eropa Barat dan Timur Tengah sebagai alternatif obat. dapat dikonversi menjadi peledak berbahaya compounds dari nitrogen, karbon
dioksida, dan air. recombinants B. subtilis str. pBE2C1 dan B. subtilis str. pBE2C1AB digunakan dalam produksi polyhydroxyalkanoates (PHA) dan agar mereka dapat menggunakan gandum terendam air limbah sebagai sumber karbon untuk menurunkan biaya produksi PHA.
2.4. Western Blot
Western Blot adalah sebuah metode untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan. Imunoblot menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli atau perubahan oleh jarak polipeptida atau oleh struktur 3-D protein. Protein tersebut dikirim ke membran, di mana mereka dideteksi menggunakan antibodi untuk menargetkan protein (Ririn, 2013).
Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai Western Blot untuk mengikuti teknik Southern blot yang pertama kali ditemukan. Western Blot mengidentifikasi antibodi spesifik pada protein yang telah dipishkan antara satu dengan yang lain menurut ukurannya lewat gel elektroforesis. Blot merupakan sebuah membran, biasanya berbahan dasar nitroselulose atau PVDF ( Polyvynilidine fluoride). Gel diletakkan di pada membran dan adanya aliran listrik menginduksi protein pada gel untuk berpindah pada membran yang dilekatkan. Membran tersebut kemudian merupakan replika dari pola protein pada gel yang kemudian diwarnai secara sekuensial dengan antibodi. Prosedur Western Blot terdiri dari preparasi sampel, elektroforesis gel, transfer dari gel ke membran, dan imunostain dari blot tersebut.
Western Blot dikenal sebagai teknik yang sangat baik dan digunakan secara luas untuk mengidentifikasi dan mengkuantifikasi protein yang spesifik dalam campuran yang kompleks. Teknik ini memungkinkan deteksi tidak langsung dari sampel protein yang diimobilisasi pada nitroselulosa atau membran PVDF. Pada Western Blot yang konvensional, sampel protein terlebih dahulu di running dengan SDS – PAGE dan secara elektroforesis ditransfer ke membran. Setelah langkah blocking, membran di lacak dengan antibodi primer baik monoklonal maupun poliklonal yang jumlahnya meningkat dibanding antigen. Setelah pencucian yang sekuensial, membran kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder yang dikonjugasi dengan enzim yang sifatnya reaktif terhadap antibodi. Aktivitas dari enzim seperti alkaline phospatase (AP) dan horseradish peroxidase (HRP) yang
penting untuk pengeluaran sinyal. Pada akhirnya, membran dicuci kembali dengan substrat dari enzim yang tepat yang akan memproduksi sinyal yang dapat direkam.
Western Blotting merupakan teknik yang digunakan untuk mengidentifikasi dan memposisikan protein berdasarkan kemampuannya untuk berikatan dengan antibodi yang spesifik. Analisis Western Blot dapat mendeteksi protein yang diinginkan dari campuran dari protein dalam jumlah besar. Western Blot dapat memberikan informasi tentang ukuran dari protein dengan perbandingan dengan ukuran marker dalam satuan kilodalton dan juga memberi informasi tentang ekspresi protein dengan perbandingan dengan kontrol seperti pada sampel yang tidak diberi perlakuan atau sel atau jaringan tipe lain)..
Gambar 8. Hasil western blot
Western Blot adalah proses transfer dan imunodeteksi protein pada gel yang bertujuan untuk :
1. Mengetahui keberadaan dan berat Molekul protein sampel pada campuran. 2. Membandingkan reaksi silang antar protein.
3. Mempelajari modifikasi protein selama sintesis
Metode Western Blotting diawali dibagi menjadi 6 tahapan yaitu : 1. Preparasi sampel
2. Separasi protein pada gel elektroforesis
3. Transfer protein pada membran NC atau PVDF 4. Blocking nonspesific - binding sites pada membran
5. Penambahan antibodi primer, antibodi sekunder 6. Deteksi atau visualisasi pengikatan antigen antibodi.
Tehnik imunoblot yang dikenal sebagai tehnik Western Blot menggabungkan ide dasar dari ELISA dengan tehnik pemisahan protein secara elektroforesis. Pada tehnik Western Blot, antigen berupa protein dipisahkan dahulu secara elektroforesis. Protein yang telah terpisah pada gel poliakrilamida dipindahkan ke kertas nitroselulosa atau lembaran nilon, menggunakan arus listrik, dengan suatu tehnik yang di sebut elektroblot. Selanjutnya protein yang telah di pindahkan ke kertas nitroselulosa/lembaran nilon di deteksi menggunakan dua antibody dan enzim pelapor seperti pada ELISA. Perbedaannya, pada Western Blot reaksi warna yang
dikatalisis enzim pelapor adalah reaksi warna dengan produk berwarna terpresipitasi pada kertas/nilon. Akibatnya uji positif Western Blot akan terlihat sebagai pita berwarna pada kertas/nilon.
Proses pemindahan protein dari gel ke kertas nitroselulosa/nilon pada tehnik Western Blot dilakukan tanpa terlebih dahulu mewarnai protein. Ketika arus listrik dialirkan, protein yang masih bermuatan negative (karena masih dilingkupi SDS), akan berpindah dari gel yang berada di sisi katoda, ke kertas nitroselulosa atau nilon yang berada di sisi anoda.
2.5. Mutagenesis Terarah dengan Teknik PCR (Polymer ase Chai n Reacti on ) Polymerase Chain Reaction atau yang disingkat dengan PCR merupakan alat yang berfungsi untuk mengetahui genetika (gen), kelainan metabolik, penyakit bawaan, hingga mendeteksi penyebaran virus. Teknik PCR yang pertama kali ditemukan oleh Karl B. Mullis pada tahun 1985 menjadi populer di kalangan ilmuwan yakni dengan pengembangan DNA yang dapat disintesiskan secara cepat.
Menurut Erlich (1989), PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.
Penyakit Tuberkulosis masih menjadi masalah kesehatan masyarakat terutama di negara berkembang. Hal ini disebabkan angka morbiditas dan mortalitas yang cukup tinggi. Kelanjutan masalah TB yang kompleks diperbesar dengan Emerging Multi
Drug Resistant-TB (MDR-TB) dan TB ko-infeksi HIV dan strain Extensively Drug Resistant-TB (XDR-TB) yang virulen dan berkaitan dengan penyakit fatal dan mortalitas tinggi. Hal ini sangat dipengaruhi oleh penderita, virulensi kuman Mycobacterium tuberkulosis, dan faktor lingkungan. Standar internasional penanganan Tuberkulosis meliputi diagnosis, pengobatan, dan kesehatan masyarakat. Diagnosis sebagai awal tindakan, membutuhkan metode yang modern, cepat, akurat dan murah dengan sarana diagnostik terbatas. Diagnosis molekuler merupakan solusi untuk kriteria tersebut. Diagnosis ini dengan mendeteksi bagian mikroba yang berperan fungsional dalam kehidupan sel, mRNA. Molekul mRNA mengkode protein 85 B (alpha-antigen), IS6110 DNA, dan 16S rRNA. Protein 85 B terdapat dalam jumlah banyak dan spesifik pada dinding sel mikroba, dengan waktu paruh yang singkat menjadikan protein ini spesifik dalam pendeteksian. Hal ini memperkuat dasar deteksi mRNA sebagai petanda adanya mikroba hidup dan berkembang biak, dan sangat berguna bagi diagnosis Tuberkulosis. Peningkatan sensitivitas ditunjang dengan teknik amplifikasi DNA, sehingga deteksi mRNA dengan teknik amplifikasi DNA (seperti PCR) dapat meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas. Dasar diagnosis ini sangat berguna sebagai alat diagnosis Tuberkulosis yang akurat dan cepat, terutama pada kasus sulit seperti TB ko-infeksi HIV dan TB anak.
PCR adalah suatu cara sederhana dan cepat untuk membuat multiple copies atau memperbanyak sekuens DNA spesifik yang diinginkan dengan meniru replikasi DNA in vivo secara in vitro. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel. Untuk memperbanyak DNA spesifik diperlukan template DNA (cetakan DNA) untai tunggal (ssDNA/single stranded DNA). Template DNA untai tunggal dapat diperoleh dengan cara denaturasi dsDNA (double stranded DNA) yang mengurai dari dsDNA menjadi ssDNA pada temperatur 94-96°C. Selain itu diperlukan dua primer oligonukleotida yang komplementer terhadap sekuens yang mengapit (terletak pada kedua ujung) fragmen DNA spesifik yang akan disalin. Primer-primer inilah yang menentukan segmen mana yang akan mengalami siklus berulang-ulang agar jumlahnya berlipat ganda. Primer yang terdiri
atas untaian tunggal DNA akan bergabung dengan untaian DNA templat, dan sintesis DNA selanjutnya dilakukan dengan bantuan enzim polimerase. Seperti disebutkan di atas, untai tunggal DNA diperoleh dengan denaturasi dsDNA dan setelah denaturasi, ssDNA yang terjadi dapat bergabung dengan primer.
Replikasi materi genetik dilaksanakan oleh enzim-enzim yang disebut DNA polymerase, yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Enzim-enzim tersebut menginisiasi sintesis DNA dengan berawal dari primer yang berikatan dengan cetakan. Primer umumnya mempunyai panjang 9-25 basa dan menentukan situs dimulainya replikasi DNA.
Untuk mempelajari efek mutasi pada ekspresi gen, para peneliti telah mengembangkan suatu teknik yang dikenal site-directed mutagenesis (mutagenesis situs terarah), yang mengintroduksi mutasi titik ke suatu situs tertentu. Salah satu strategi mutagenesis semacam itu yang paling sering digunakan memanfaatkan amplifikasi DNA yang diarahkan oleh primer untuk mengintroduksi mutasi. Salah satu primer didesain dengan sebuah sekuens yang berkomplemen dengan daerah di dalam DNA target, namun primer tersebut mengandung substitusi, insersi, atau delesi yang diinginkan. Sekuens mutagenik di dalam primer harus terletak di ujung 5’ atau di tengah (internal) primer, bukan diletakan di ujung 3’ primer. Ujung 3’ primer mutagenik (dengan panjang setidaknya 6-10 bp) harus sepenuhnya berkomplemen dengan DNA target agar penempelan primer pada target terjadi dengan sempurna dan DNA polymerase dapat melakukan pemanjangan primer. Awal PCR (5-10 siklus pertama) dilakukan dengan tingkat kecepatan yang rendah agar terjadi kesalahan pasangan basa atau mismatch. Begitu sejumlah cetakan yang telah termutasi terbentuk selama PCR, maka cetakan ini akan berperan sebagai target dan sepenuhnya berkomplemen dengan primer. Produk akhirnya akan mengandung mutasi pada situs yang kita inginkan.
Kelemahan teknik ini adalah bahwa harus ada primer spesifik untuk setiap ujung segmen DNA sasaran yang akan diamplifikasi, dan karena sensitifitas metode ini sangat tinggi, setiap tes harus selalu disertai kontrol positif dan kontrol negatif untuk menghindarkan salah interpretasi akibat kontaminasi dengan DNA eksogen. Teknik PCR memungkinkan untuk memperbanyak beberapa fragmen dari gen sekaligus yang diduga menunjukan kelainan, tetapi perlu diingat bahwa amplifikasi DNA dengan PCR baru memberikan hasil paling baik bila dilakukan untuk sekuen DNA di bawah 10 kb (kb = kilo base pairs = 1.000 pasang basa), sedangkan bila sekuens
DNA itu lebih dari 1000 pasang basa efisiensi reaksi berkurang drastis. Sekuens tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen.
Selain untuk mendeteksi segmen DNA tertentu, teknik PCR juga dapat digunakan untuk menganalisis mRNA, tetapi karena RNA tidak dapat digunakan sebagai templat untuk membuat copy, terlebih dahulu perlu dilakukan transkripsi terbalik (reverse transcription) RNA menjadi cDNA dengan menggunakan enzim reverse transcriptase yang akan membuat cDNA dari mRNA bersangkutan, baru kemudian dilakukan amplifikasi PCR.
Jika suatu fasa zat bermuatan diberi beda potensial maka fasa tersebut akan berpindah sepanjang medium ke arah katoda atau anoda sesuai dengan muatan partikel. Fenomena tersebut disebut dengan elektroforesis. Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau garadasi konsentrasi sepanjang sistem (medium). Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi medan listrik. Dengan demikian, kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk pemisahan makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terpisah pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau auturadiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well ) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satukutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan ( staining ) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai"
dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atomradioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Pita-pita (band ) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker ) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan mengelektroforesis marker tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan
dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
Visualisasi produk PCR dilakukan menggunakan metode elektoforesis gel. Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi untuk menyaring objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung alat elektroforesis gel.
Prinsip elektroforesis untuk visualisasi produk PCR yaitu berdasarkan muatan DNA pada pH netral, dimana DNA yang bermuatan negatif akan tertarik (bermigrasi) ke arah kutub positif di dalam gel. Kecepatan migrasi tergantung pada berat molekul DNA. Semakin besar molekul DNA tersebut, kecepatan migrasi
BAB III
PEMBAHASAN SOAL
1. Apa fungsi streptokinase dalam pengobatan orang yang mengalami serangan jantung, atau stroke?
Jawab:
Serangan jantung atau stroke merupakan penyakit yang disebabkan oleh penyumbatan pada pembuluh darah (serangan jantung atau infark miokard penyumbatan pada nadi koroner, stroke penyumbatan pada pembuluh darah otak/serebroveskuler). Oleh karena itu, digunakan streptokinase untuk mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin yang akan menghancurkan gumpalan darah tersebut.
2. Bagaimana cara kerja streptokinase? Ingat streptokinase adalah enzim, jadi reaksi apakah yang dikatalisisnya?
Jawab:
Cara kerja streptokinase dalam mengatasi penggumpalan darah adalah dengan berfungsi sebagai aktivator plasminogen. Plasminogen merupakan suatu zimogen (calon enzim) yang akan menjadi enzim aktif (plasmin). Cara mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin adalah dengan memotong ikatan peptida pada plasminogen. Apabila plasmin telah aktif maka plasmin tersebut akan
mendegradasi (menghancurkan) protein pembeku atau penggumpal darah.
3. Mengapa plasmin dapat mendegradasi streptokinase dengan cepat? Jawab:
Karena sifat plasmin yang seperti tripsi, yang mendegradasi ikatan peptida setelah lisin atau arginin.
4. Jelaskan strategi yang dilakukan peneliti untuk menghasilkan streptokinase yang tahan plasmin.
Strategi yang dilakukan peneliti adalah melakukan rekayasa protein untuk menghasilkan streptokinase yang tahan plasmin (waktu paruh panjang) dengan metode mutagenesis terarah dengan PCR.
Dengan menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR), setiap materi genetik apapun dapat ditentukan dengan tepat dan direplikasi dalam jumlah banyak dengan cara menentukan sepasang primer yang mengapit sekuens DNA yang dikehendaki dan PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. Cara kerjanya dimulai dari pengikatan dua oligonukleotida (primer) yang telah diketahui komposisinya ke suatu sekuens target yang diinginkan. Kemudian, DNA polimerase akan memperpanjang oligonukleotida tersebut. Setiap reaksi akan diulang setelah tahap denaturasi sehingga terjadilah amplifikasi (penguatan) secara eksponensial. Awal PCR (5-10 siklus pertama) dilakukan dengan tingkat kecepatan yang rendah agar terjadi kesalahan pasangan basa atau mismatch. Begitu sejumlah cetakan yang telah termutasi terbentuk selama PCR, maka cetakan ini akan berperan sebagai target dan sepenuhnya berkomplemen dengan primer.
Pada PCR terdapat tiga suhu atau tahapan inkubasi yang diulangi sebanyak 20-50 kali. Satu ulangan dari ketiga tahap ini disebut siklus. Tahap pertama disebut denaturasi, di mana kedua untai milekul DNA target akan terpisah (terdenaturasi) oleh pemanasan DNA pada suhu 94⁰C-96°C untuk memutus ikatan hidrogen di
antara basa-basa, menghasilkan dua untai DNA yang terpisah. Tahap kedua adalah penempelan (annealing ), di mana dua primer akan berhibridisasi menjadi sekuens komplementer pada untai tunggal DNA. Primer-primer yang dimaksud adalah sekuens DNA untai tunggal sintesis dan berukuran pendek (panjang 20-30 basa). Primer-primer dipilih sedemikiasm rupa agar satu primer bersifat komplementer dengan salah satu ujung gen yang diinginkan pada salah satu untai. Sementara itu, primer kedua bersifat komplementer dengan ujung yang lainnya pada untai DNA yang satu lagi. Primer akan membentuk ikatan hidrogen (menempel) dengan sekuens komplementernya sehIngga terbentuklah molekul untai ganda yang stabil. Suhu penempelan berkisar antara 45-60°C. Tahap ketiga yaitu ekstensi atau elongasi,
yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis DNA polimerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan jumlah
molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap utas baru yang disintesis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya.
5. Mengapa asam amino lys386 dan Lys59 yang dipilih untuk dimutasi? Jawab:
Plasmin mempunyai kemampuan untuk memotong ikatan peptida setelah residu lisin atau arginin. Sedangkan streptokinase yang memiliki 414 asam amino yang terbagi menjadi 3 domain yaitu: α (1-146), β (147-290), γ (291-414). Pada domain β (147-290) asam amino merupakan sisi aktif dari streptokinase untuk mengaktifkan plasminogen. Oleh karena itu, dilakukan mutasi pada posisi α (posisi asam amino lys59) dan γ (posisi asam amino lys386) agar tidak mempengaruhi situs β sebagai aktivator plasminogen.
6. Mengapa pilihan glutamin untuk mengganti lys386, dan Lys59 adalah yang paling baik? Jelaskan secara structural.
Jawab:
Glutamin dipilih untuk mengganti amino lys386, dan Lys59 karena panjang rantai samping sebanding dengan Lys sehingga tidak mengganggu struktur tiga dimensi streptokinase dan glutamin tidak memiliki muatan positif.
Gambar 9. Struktur Glutamin dan Lisin
7. Baca makalah asli. Di dalam makalah asli disebutkan wild-type streptokinase,
SKN460, SKN460-C32. Jelaskan apakah itu wild-type streptokinase, SKN460, SKN460-C32?
Jawab:
Gambar 10. Streptokinase Alami dan Mutan
a. Wild-type streptokinase (ditunjukkan pada gambar A) merupakan streptokinase alami atau belum dimutasi.
b. SKN460 (ditunjukkan pada gambar C) merupakan streptokinase yang sudah dimutasi pada N-terminal posisi asam amino Lys59.
c. SKC32 (ditunjukkan pada gambar B) merupakan streptokinase yang sudah dimutasi pada C-terminal posisi asam amino Lys386.
d. SKN460-C32 (ditunjukkan pada gambar D) merupakan streptokinase yang sudah dimutasi pada N-ter minal dan C- terminal.
8. Jelaskan penggunaan Western Blot untuk deteksi protein. Jawab:
Western blot adalah metode untuk mengidentifikasi suatu protein dengan berat molekul tertentu yang telah diseparasi. Pada tehnik wastern blot, antigen berupa protein dipisahkan terlebih dahulu secara elektroforesis. Protein yang telah terpisah pada gel poliakrilamida dipindahkan ke kertas nitroselulosa atau lembaran nilon, menggunakan arus listrik, dengan suatu tehnik yang disebut elektroblot. Selanjutnya protein yang sudah dipindahkan tersebut di deteksi menggunakan dua antibodi dan enzim pelapor. Pada Western Blot reaksi warna yang di katalisis
enzim pelapor adalah reaksi warna dengan produk berwarna terpresifitasi pada kertas atau nilon. Akibatnya uji positif Western Blot akan terlihat sebagai pita berwarna pada kertas atau nilon.
Gambar 11. Western Blot
Misalkan protein target yang ingin di deteksi adalah antigen X. Kertas nitroselulosa yang sudah mengandung protein, setelah arus listrik dimatikan, dikeluarkan dari peralatan dan di rendam dalam larutan antibodi pertama yang anti-X. Apabila protein yang di elektroforesis dan di pindahkan ke kertas nitroselulosa adalah protein X, maka antibodi anti-X akan mengikat protein X pada kertas tersebut. Setelah perendaman dan inkubasi, kertas nitroselulosa dicuci untuk menghilangkan antibodi anti-X yang tidak terikat. Pada tahap berikutnya, kertas nitroselulosa di rendam dalam antibodi kedua. Antibodi kedua adalah antibodi yang anti terhadap antibodi pertama. Jika misalnya antibodi pertama (antibodi anti-X) adalah IgG kambing, maka antibodi kedua adalah Imunoglobulin yang anti terhadap bagian konstan (Fc) IgG. Selain itu antibodi kedua juga terikat secara kovalen dengan suatu enzim pelapor. Dengan demikian, pengikatan antibodi kedua ke antibodi pertama, yang terikat antigen X pada kertas nitroselulosa akan dapat di deteksi dengan penambahan sunstrat tak berwarna. Sebalum penambahn substrat, kertas nitroselulosa yang sudah di rendam dalam larutan antibodi kedua di cuci untuk membuang antibodi kedua yang tidak terikat. Setelah pencucian, substrat
ditambahkna. Substrat adalah suatu zat tak berwarna, yang oleh enzim pelapor akan dikatalisi perubahannya menjadi suatu produk berwarna. Pembentukan produk berupa pita berwarna pada kertas, menandakan bahwa pada kertas terdapat protein
X.
9. Apakah Western Blot dapat digunakan untuk deteksi protein khusus? Jelaskan jawaban anda dengan memberikan contoh.
Jawab:
Western Blot dapat digunakan untuk deteksi protein khusus. Contohnya mendeteksi streptokinase yang merupakan enzim (protein khusus) yang memiliki fungsi khusus sebagai aktivator plasminogen menjadi plasmin yang menghancurkan gumpalan darah.
10. Jelaskan gambar 2 pada makalah asli. Kesimpulan apa yang dapat diambil dari gambar 2 pada makalah asli?
Jawab:
Gambar 12.Pengolahan Streptokinase dan Mutein oleh Plasmin
Pada gambar (a) menunjukkan SK Wild-Type tidak tahan plasmin karena pada waktu 5 menit dengan berat molekul 47 kDa sudah terdegradasi (terdapat
produk degradasi) yang ditunjukkan oleh pita-pita dengan ketebalan sangat tipis dengan berat molekul dibawah 47kDa atau sekitar 40 kDa).
Pada gambar (b) menunjukkan SKN460 yang mulai terdegradasi pada waktu 10 menit namun pita yang ditunjukkan pada t=10 menit sedikit lebih tipis dibandingkan pada pita t=0 atau 1 menit. Pada t=20 sampai 60 menit pita yang ditunjukkan lebih tipis dibandingkan pita pada t=10 menit, hal tersebut menunjukkan produk degradasi dari protein streptokinase.
Pada gambar (c) menunjukkan SKN460-C32 dengan ketebalan pita t=0 sampai 60 menit relatif sama atau pita pada t=60 menit sedikit lebih tipis dari pada pita pada t=0 menit. Hal tersebut menunjukkan bahwa streptokinase dengan mutasi pada kedua ujung (N-terminal dan C-terminal) menghasilkan streptokinase yang
tahan plasmin dan tidak ada produk degradasinya.
11. Jelaskan gambar 3 dari makalah asli. Kesimpulan apa yang dapat diambil dari gambar 3.
Jawab:
Gambar 13. Aktivitas dari Berbagai Bentuk Streptokinase
Pada gambar diatas menunjukkan aktivitas biologis dari streptokinase dan rekayasa turunannya ditentukan dengan Caseinolysis Radial. Caseinolysis Radial merupakan suatu metode untuk mendeteksi suatu aktivitas protein misalnya streptokinase yang diperlakukan pada elektroforesis dengan agarosa yang mengandung susu skim (kasein) dan plasminogen.
Pada sumur yang telah dibuat, dimasukkan sampel (streptokinase). Setelah itu, dengan adanya kasein, gel akan berwarna keruh. Dengan adanya aktivitas
streptokinase maka akan terbentuk suatu zona bening di sekitar sumur. Zona bening pada gel tersebut menunjukkan diameter aktivitas streptokinase yang mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin yang akan mendegradasi kasein.
Pada gambar (a) menunjukkan perbandingan antara SK Wild-Type dengan SKN460 dan SKN460-C32. Pada SKN460, aktivitasnya meningkat sebanyak 2,2 kali lipat dibandingkan dengan SK Wild-Type. Pada SKN460-C32 menunjukkan diameter aktivitas meningkat hingga 2,5 kali lipat dibandingkan SK Wild-Type. Pada gambar (b) menunjukkan bahwa aktivitas dari SKC32 sedikit meningkat (1,1 kali lipat dibanding SK Wild-Type).
Aktivitas tersebut menunjukkan aktivitas dari streptokinase yang mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin yang mendegradasi kasein (hal tersebut menunjukkan seperti plasmin yang akan menghancurkan gumpalan darah). Jadi, zona bening yang terbesar di sekitar sumur menunjukkan aktivitas streptokinase yang paling baik. Hal tersebut ditunjukkan pada SKN460-C32.
BAB IV KESIMPULAN
Dari makalah diatas, dapat diambil kesimpulan bahwa streptokinase penting dalam melarutkan gumpalan darah. streptokinase berperan sebagai katalis yang mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin. Plasmin berfungsi untuk mendegradasi ikatan peptida pada fibrinogen yang merupakan penyebab gumpalan darah, menjadi benang-benang fibrin. Plasmin memiliki sifat mendegradasi ikatan peptida setelah lisin.
Sehingga plasmin selain mendegradasi fibrinogen, juga mendegradasi streptokinase pada asam amino Lys59 dan Lys386. Hal ini menyebabkan waktu hidup streptokinase
menjadi rendah, yaitu 30-90 menit.
Untuk membuat streptokinase yang tahan plasmin, maka perlu dilakukan mutasi pada asam amino streptokinase, Lys59 dan Lys386. Mutasi ini menghasilkan
DAFTAR PUSTAKA
Baehaki, A., Suhartono, M. T., Palupi, N. S., & Nurhayati, T. (2008). Purifikasi dan Karakterisasi Protease dari Bakteri Patogen Pseudomonas aeruginosa. Jurnal. Teknol. dan Industri Pangan, 19(1).
Donnan, G. A., Davis, S. M., Chambers, B. R., Gates, P. C., Hankey, G. J., McNeil, J. J., . . . Tuck, R. R. (1996). Streptokinase for acute ischemic stroke with relationship to time of administration. Jama, 276 (12), 961-966.
FARISSA, I. P., Rifqi, S., & Maharani, N. (2012). KOMPLIKASI PADA PASIEN INFARK MIOKARD AKUT ST-ELEVASI (STEMI) YANG MENDAPAT MAUPUN TIDAK MENDAPAT TERAPI REPERFUSI:(Studi di RSUP Dr. Kariadi Semarang). Fakultas Kedokteran.
Glick, B. R., & Pasternak, J. J. (1998). Principles and applications of recombinant DNA. ASM, Washington DC , 683.
Hartono, B., Soerarso, R., & Rampengan, S. H. (2011). Trombosis pada Katup Prostetik Mekanik. Jurnal Kardiologi Indonesia, 28(4), 73-79.
Jamal, S. (2004). Deskripsi penyakit system sirkulasi: penyebab utama kematian di Indonesia. Cermin dunia kedokteran, 143(6).
Organization, W. H. (2008). The World Health Report 2008: Primary Health Care Now More Than Ever. Geneva: WHO Library Cataloguing-inPublication. Patrisia, H. T. (2009). KADAR PLASMINOGEN AKTIVATOR INHIBITOR-1 SEBAGAI
PREDIKTOR OUTCOME STATUS NEUROLOGIS PADA STROKE ISKEMIK AKUT (Plasminogen activator inhibitor-1 level as predictor neurologic outcome
in acute ischemic stroke). UNIVERSITAS DIPONEGORO.
Ririn, M. (2013). Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Online : http://ririnmirnawatiskm.blogspot.com/2013/06/teknik-pcr-polymerase-chain-reaction.html. (05 Mei 2014)
WO, E. B., Ekroth, R., Teger-Nilsson, A.-C., & William-Olsson, G. (1981). Intrapleural instillation of streptokinase effects on systemic fibrinolysis. The Thoracic and cardiovascular surgeon, 29(02), 124-126.
Wong, S.-L., Ye, R., & Nathoo, S. (1994). Engineering and production of streptokinase in a Bacillus subtilis expression-secretion system. Appl Environ Microbiol, 60(2), 517-523.
