BAB III. METODE PENELITIAN

(1)

65

BAB III. METODE PENELITIAN

A. KerangkaKonsep

Gambar3.1. Bagan kerangkakonsep

Keterangan bagan kerangka konsep:

Menyebabkan Efekastaxanthin oral Meningkat

Astaxanthin oral menghambat Variabelbebas

Variabelterikat

B. Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Poliklinik Kulit dan Kelamin RSUD dr Moewardi Surakarta. Pengemasan krim dengan kandungan tretinoin 0,025% + klindamisin 1,2%, pengemasan kapsul berisi astaxantin 4 mg dan pembuatan plasebo dilakukan di Laboratorium Universitas Setia Budi Surakarta.

Pengambilansampeldarahdilakukan di Laboratorium Prodia

E-selektin

IL-17

IL-22 IL-20 Astaxantin

Perbaikan akne vulgaris Akne

vulgaris

(2)

Surakarta.Pemeriksaan kadar serum E-selektin, IL-17, IL-20 dan IL-22 dilaksanakan di Laboratorium Prodia Jakarta.

C. Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Oktober - November 2019.

D.Jenis dan Rancangan penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian double blind randomized control trial dengan rancangan pretest and posttest control group design.

E.Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan yaitu

1. Tabung SST (Serum Separator Tube)8 cc 2. Kamera DSLR(Digital Single Lens Reflex)

3. Krim dengan kandungan tretinoin 0,025% + klindamisin 1,2%

4. Kapsul berisi astaxantin 4 mg

5. Kapsul berisi plasebo (laktulosa 4 mg)

6. Standar kit Human sE-selektinQuantikine^® ELISAR&D Systems 7. Standar kitHuman IL-17A HighSensitivityBender Medsystem 8. Standar kit Human IL-20 ImmunoassayQuantikine^® ELISAR&D Systems.

9. Standar kit Human IL-22 ImmunoassayQuantikine^® ELISAR&D Systems.

F. Macam Perlakuan

Penelitian ini membagi subjek menjadi 2 kelompok: kelompok perlakuandan kelompok kontrol. Kelompok perlakuan menerima terapi standar AV (krim dengan kandungan tretinoin 0,025% + klindamisin 1,2%)yang diolessetiapmalamdan kapsul berisi astaxantin 4 mg yang diminumsekalisehari.

Kelompok kontrol menerima terapi standar AV (krim dengan kandungan tretinoin 0,025% + klindamisin 1,2%)yang diolessetiapmalamdan kapsul berisi plasebo yang diminumsekalisehari. Terapidiberikanselama 1 bulan (30 hari).

(3)

G. Populasi dan Sampel Penelitian

Populasi target penelitian adalah pasien akne vulgaris di Surakarta.

Populasi terjangkau adalah pasien akne vulgaris di Poliklinik Kulit dan Kelamin RSUD dr Moewardi Surakartayang bersedia mengikuti penelitian.

Perhitungan besar sampel minimal tiap kelompok menggunakan rumus data numerik tidak berpasangan (Taufiqurochman, 2016):

2 (𝑧𝛼+𝑧𝛽)S na = nb = 2 Xa−Xb

zα : deviat baku alfa (1,96) zβ : deviat baku beta (1,28)

S : simpang baku dari selisih antar kelompok (3) Xa-Xb : selisih yang dianggap bermakna (4)

Sehingga perhitungan besar sampel minimal tiap kelompok:

2 (1,96+1,28)3

na = nb = 2 = 11,2 ≈ 12 4

Besar minimal sampel tiap kelompok adalah 12 subjek untuk masing- masing kelompok subjek. Dengan memperhitungkan risiko terjadi drop out pada tiap kelompok subjek yaitu sebesar 10% sehingga besar sampel tiap kelompok 12 + 1,2 = 13,2, dibulatkan menjadi 14. Penelitian ini menggunakan 2 kelompok subjek sehingga minimal keseluruhan sampel yang dibutuhkan adalah 14 x 2 = 28 subjek.

(4)

Kriteria inklusi:

- Subjek dengan akne vulgaristipe inflamasi (tipe papulopustular) - Subjek yang bersediamengikutipenelitian

Kriteria eksklusi:

- Subjek dengan dengan penyakit inflamasi lainnya - Obesitas

- Merokok

- Memakai obat-obatan seperti benzodiazepin, litium, siklosporin, ramipril, isoniazid, iodida, bromida, vitamin B kompleks, serotonin uptake inhibitor, epidermal growth factor receptor inhibitor, kontrasepsi progestin, kortikosteroid dan anti akne

- Memakaikosmetik - Subjek drop out

H. Variabel penelitian 1. Variabel bebas

Astaxantin

Astaxantin merupakan obat yang mempunyai efek farmakologi antioksidan dan antiinflamasi.Dosis oral yang digunakan 4 mg (Ambatiet al., 2014).

2. Variabel terikat

a. Kadar serum E-selektin

E-selektin adalah molekul adhesi sel yang diekspresikan pada sel endotel yang diaktivasi oleh sitokin.

Kadar serum E-selektin diukur dengan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dengan hasil ukur ng/ml dan skala ukur rasio.

b. Kadar serum IL-17

IL-17 adalah sitokin penanda dari sel T-helper 17, yang juga dihasilkan oleh sel imun dan adaptif lainnya yaitu sel T CD8+, Sel T γδ, sel T NK dan sel limfoid alamiah.

(5)

Kadar serum IL-17 diukur dengan ELISAdengan hasil ukur pg/ml dan skala ukur rasio.

c. Kadar serum IL-20

IL-20 adalah sitokin yang diproduksi oleh keratinosit akibat rangsangan IL-22, TNF-α, and IL-17. IL-20 juga diproduksi oleh monosit dan sel dendritik.

Kadar serum IL-20 diukur diukur dengan ELISA dengan hasil ukur pg/ml dan skala ukur rasio.

d. Kadar serum IL-22

IL-22 adalah sitokin yang diproduksi oleh Th17, Th22, dan sel NK mukosa.

Kadar serum IL-22 diukur dengan ELISAdengan hasil ukur pg/ml dan skala ukur rasio (Tabel 3.1).

Tabel 3.1. Variabel penelitian yang diteliti

Variabel Penelitian Variabel Satuan/variasi Skala

Variabel bebas Astaxantin -Diberi

astaxanthin - Tidakdiberi astaxantin

Kategorik

Variabel terikat Kadar serum E-selektin ng/ml Rasio

Kadar serum IL-17 pg/ml Rasio

3. VariabelLuar

a. Variabelterkendali

i. Radiasi ultraviolet

Radiasi sinar ultraviolet adalah radiasi elektromagnetik yang berasal dari matahari dengan rentang panjang gelombang 100 nm- 400nm.Variabelinidikendalikandenganmenghindarisinarmataharide nganmenginstruksikansubjekuntukmenggunakan masker dan helm tertutup.

(6)

ii. Obesitas

Obesitas akumulasi akumulasi lemak abnormal atauberlebihan yang dapat mengganggu kesehatan. Obesitas diukur berdasarkan indeks massa tubuh (IMT) seseorang. Seseorang dikategorikan

obesitas jika IMT>30

kg/m².ObesitasdikendalikandenganmencarisubjekdenganIMT<30 kg/m².

iii. Merokok

Merokok adalah menghisap asap tembakau yang dibakar ke dalam tubuh dan menghembuskannya kembali keluar. Subjek yang merokok setidaknya satu batang per minggu dikatakan sebagai perokok. Merokokdikendalikandenganmencarisubjek yang tidakmerokok.

iv. Kosmetik

Kosmetikadalah bahan atau sediaan yang dimaksudkan untuk digunakan pada bagian luar tubuh manusia (epidermis, rambut, kuku, bibir, dan organ genital bagian luar) atau gigi atau mukosa mulut terutama membersihkan, mewangikan, mengubah penampilan dan atau memperbaiki bau badan atau melindungi atau

memelihara tubuh pada kondisi

baik.Kosmetikdikendalikandenganmenccarisubjek yang tidakmenggunakankosmetikdalam 1 bulanterkahir.

v. Obat-obatan

Obat adalah benda atau zat yang dapat digunakan untuk merawat penyakit, meredakan atau menghilangkan gejala, atau mengubah proses kimia dalam tubuh. Obat merupakan bahan atau paduan bahan-bahan yang dimaksudkan untuk digunakan dalam menetapkan diagnosis, mencegah, mengurangi, menghilangkan, menyembuhkan. Obat-obatandikendalikandenganmencarisubjek

yang tidakmengkonsumsiobat-

obatansepertidalamkriteriaekslusidalam 1 bulanterakhir.

(7)

vi. Cucimukaberlebihan

Cuci muka adalah membersihkan muka dengan memakai air atau barang cair, biasanya dengan sabun.Cucimukadianjurkan 2-3 x dalamsehari.Cuci

mukadikendalikandenganmemberikaninstruksikepadasubjekuntuk mencucimukatidakleboihdari 2 x sehari.

b. Variabeltakterkendali i. Hormon

Hormonadalahzat yang dibentuk oleh bagian tubuh tertentu (misalnya kelenjar) dalam jumlah kecil dan dibawa ke jaringan tubuh lainnya serta mempunyai pengaruh khas (merangsang dan menggiatkan kerja alat-alat tubuh).

ii. Stres

Stresadalahgangguan atau kekacauan mental dan emosional yang disebabkan oleh faktor luar.

iii. Makanan

Makananadalahsegala bahan yang dimakan atau masuk ke dalam tubuh yang membentuk atau mengganti jaringan tubuh, memberikan tenaga, atau mengatur semua proses dalam tubuh.

I.Prosedur Pengumpulan Data

Subjekpasien akne vulgaris yang masuk kriteria inklusi dan eksklusi, setelahmengisiinformed consent, kuesionerdandiambilfotonyadengankamera DSLR,kemudian dimasukkankedalamsalahsatu kelompoksecaraacakolehpetugas.

Metode penelitian ini menggunakan double blind randomized control trial. Subjek dan peneliti tidak mengetahui isi kapsul yang diberikan ke subjek. Kemudian petugas memberikanterapikepadasubjeksesuaidengankelompoknya, kelompokperlakuanataukelompokkontrol.Kelompok perlakuan menerima terapi standar AV (krim dengan kandungan tretinoin 0,025% + klindamisin 1,2%)yang diolessetiapmalamdan kapsul berisi astaxantin 4 mg yang diminumsekalisehari.

Kelompok kontrol menerima terapi standar AV (krim dengan kandungan tretinoin

(8)

0,025% + klindamisin 1,2%)yang diolessetiapmalamdan kapsul berisi plasebo yang diminumsekalisehari. Terapidiberikanselama 1 bulan (30 hari). Sebelum diberikan terapi, subjekdiambilsampeldarahnyasebanyak 13 ccterlebihdahuludenganmenggunakanTabung SST di LaboratoriumProdia Surakarta untukmengetahuikadar serum E-selektin, IL-17, IL-20 dan IL- 22(pretest). Setelah 1 bulan terapisubjekdiambilsampeldarahnyakembali di LaboratoriumProdia Surakarta untukmengetahuikadar serum E-selektin, IL-17, IL-20 dan IL-22(posttest). SampeldarahkemudiandikirimkeLaboratoriumProdia Jakarta untukdiperiksakadar serum E-selektin, IL-17, IL-20 dan IL-22.

Pemeriksaankadarserum E-selektin

Pemeriksaankadarserum E-selektinmenggunakanteknik ELISA denganstandar kit Human sE-selektinQuantikine^® ELISAR&D Systems.

Pemeriksaan ini menggunakan teknik quantitatifsandwich enzyme immuno-assay.

Sebelumnya antibodi monoklonal spesifik untuk sE-selektin telah dilapisi dalam microplate. Standar, sampel, kontrol dan konjugat dipipet ke dalam well. Seluruh sE- selektin yang ada akan berikatan dengan antibodi yang ada dalam well. Setelah dicuci, keberadaan sE-Selectin yang berikatan dengan antibodi dalam well akan dipasangkan denganimmobilized antibody dengan antibody enzyme-linked monoclonal spesifik untuk sE-selektin.Kemudian dilakukan pencucian untuk menghilangkan substansi-substansi yang tidak terikat dan atau reagen antibody-enzyme, lalu larutan substrat ditambahkan ke dalam well dan kemudian terbentuklah pembentukan warna yang sebanding dengan jumlah sE-selektin yang terikat. Pembentukan warna dihentikan dan kemudian intensitas warna diukur. Pengukuran dilakukan menggunakan ELISA READER 680 (Biorad) Persiapan Reagen

- Wash Buffer

Encerkan 20 mL wash buffer konsentrat ke dalam 480 mL aquabidest untuk persiapan 500 mL washbuffer.

- Larutan Substrat

Color reagen A dan color reagen B di campur dengan perbandingan volume yang sama. Dibuat 15 menit sebelum digunakan. Lindungi dari sinar matahari. Volume yang dibutuhkan adalah 200µL

(9)

- Larutan sE-selektin Standar

Larutkan sE-selektin standar dengan air distilasi. Hasil larutan ini akan menjadi larutan stok 80 pg/ml. Diamkan larutan standar selama 15 menit sebelum melakukan dilusi larutan.

Pipet 900 µLcalibrator diluent RD6-11 kedalam tabung 8 ng/ml. Pipet 500 µL kedalam masing-masing tabung. Gunakan larutan stok untuk mendapatkan serial larutan seperti gambar di bawah ini. Larutan standar 8 ng/mL digunakan sebagai standar tertinggi dan calibrator diluent RD6-11 sebagai standar nol (0 pg/mL).

Prosedur Kerja

1. Siapkan semua reagen, working standard, sampel dankontrol 2. Tambahkan 100 µl assay diluent RD1W ke dalamwell

3. Tambahkan 100 µl standar, kontrol atau sampel ke dalam masing- masing well, campur denganbaik

4. Tutup plate dengan adhesive strip yang tersedia dan inkubasi pada suhu kamar selama 2 jam pada microplateshaker.

5. Buang isi dari tiap well dan cuci dengan menambahkan 400 µl wash buffer ke dalam masing-masing well. Ulangi proses tersebut sebanyak 3 kali (total pencucian sebanyak 4 kali). Setelah pencucian terakhir, buang isi dari well, buang sisa wash buffer dengan mengetuk-ngetukkan plate secara terbalik pada lap kertas yangbersih

6. Segera tambahkan 200 µl konjugatsE-selektin ke dalam masing-masing well. Tutup plate dengan adhesive strip baru, inkubasi pada plate shaker

(10)

di suhu kamar selama 2 jam

7. Ulangi kembali proses pencucian seperti pada no.5

8. Tambahkan 200 µl larutan substrat ke dalam masing-masing well. Tutup plate dengan plate sealer baru, inkubasi pada plate shaker di suhu kamar selama 30 menit. Hindari kontak langsung dengancahaya.

9. Tambahkan 50 µl stop solution ke dalam masing-masing well.

Perubahan warna akan terjadi dari bitu ke kuning. Jika warna berubah hijau atau tidak ada perubahan warna, goyang-goyang plate utnuk memastikan pencampuransempurna.

10. Tentukan optical density dari tiap well dalam waktu 30 menit menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 450nm.

Pemeriksaankadarserum IL-17

Pemeriksaankadarserum E-selektinmenggunakanteknik ELISA denganstandar kitHuman IL-17A HighSensitivityBender Medsystem. Pemeriksaan ini menggunakan teknik quantitatif sandwich enzyme immuno-assay. Sebelumnya antibodi monoklonal spesifik untuk IL-17A telah dilapisi dalam microplate. Standar dan sampel dipipet ke dalam well dan keberadaan IL-17A akan dipasangkan denganimmobilized antibody dengan antibody enzyme-linked monoclonal spesifik untukIL-17A.Setelah dilakukan pencucian untuk menghilangkan substansi-substansi yang terikat dan atau reagen antibody-enzyme, selanjutnya larutan substrat ditambahkan ke dalam well. Setelah masa inkubasi, amplifier solution ditambahkan dan kemudian terbentuklah pembentukan warna yang sebanding dengan jumlah IL-17A yang terikat.

Pembentukan warna dihentikan dan kemudian intensitas warnadiukur.

PersiapanReagen

- Wash Buffer Concentrate

Encerkan 50 ml wash buffer concentrate dengan air deionized atau distilasi hingga diperoleh 1000 ml larutan wash buffer

- Assay Buffer Concentrate

Encerkan 5 ml assay buffer concentrate dengan air deionized atau distilasihingga diperoleh 100 ml larutan assaybuffer

- Amplification Solution I

(11)

Larutkan 1:300 amplification reagent I dengan amplificator diluent - Amplification Solution II

Larutkan 1:1000 amplification reagent II dengan assay buffer - IL-17A Standar

Larutkan IL-17 A standar 200 pg/ml dengan pengenceran sebagai berikut: 100 µl IL-17A standar (200pg/ml)+570 µl assay buffer ---> 30 pg/ml

- Streptavidin-HRP

Larutkan 1:100 streptavidin-HRP concentrate dengan assay buffer Prosedur Kerja

1. Siapkan semua reagen, working standard, blank dansampel.

2. Siapkan konjugat biotin

3. Cuci well dengan menambahkan 400 µl wash buffer yang didiamkan terlebih dahulu sebanyak 10-15 detik ke dalam masing-masing well.

Ulangi proses tersebut sebanyak 2 kali. Setelah pencucian terakhir, buang isi dari well, buang sisa wash buffer dengan mengetuk-ngetukkan plate secara terbalik pada lap kertas yangbersih

4. Tambahkan 100 µl sample diluent ke dalam well standar. Ambil dan transfer 100 µL dari larutan stok 30 pg/mL, sehingga diperoleh pengenceran sebagai berikut:

(12)

5. Tambahkan 100 µl sampel ke dalam blankwell 6. Tambahkan 50µl sampelke dalamsamplewell

7. Tambahkan 50µl sampel ke dalam masing-masing sampelwell 8. Tambahkan 50 µl konjugat biotin ke dalam masing-masingwell

9. Tutup plate dengan plate sealer yang tersedia dan inkubasi pada suhu kamar selama semalam dalam ruanggelap.

10. Ulangi kembali proses pencucian seperti pada no. 2, sebanyak 6kali 11. Tambahkan 100 µl streptavidin-HRP ke dalam masing-masingwell

12. Tutup plate dengan plate sealer yang tersedia dan inkubasi pada suhu kamar selama 1 jam, jika tersedia di atas microplate shaker dengan kecepatan 100 rpm.

13. Segera siapkan reagen amplification solution I dan dilusi sebanyak 1x dengan amplification diluent

14. Ulangi kembali proses pencucian seperti pada no. 2, sebanyak 6kali

(13)

15. Tambahkan 100 µl amplification solution I ke dalam masing-masingwell 16. Tutup plate dengan plate sealer yang tersedia dan inkubasi pada suhu

kamar selama 15 menit, jika tersedia di atas microplate shaker dengan kecepatan 100rpm

17. Segera siapkan reagen amplification solutionII

18. Ulangi kembali proses pencucian seperti pada no. 2, sebanyak 6kali 19. Tambahkan 100 µl amplification solutionII ke dalam masing-masingwell 20. Tutup plate dengan plate sealer yang tersedia dan inkubasi pada suhu

kamar selama 30 menit, jika tersedia di atas microplate shaker dengan kecepatan 100rpm

21. Segera siapkan reagen larutan subtrat TMB

22. Ulangi kembali proses pencucian seperti pada no. 2, sebanyak 6kali 23. Tambahkan 100 µl larutan subtrat TMB ke dalam masing-masingwell 24. Tutup plate dengan plate sealer yang tersedia dan inkubasi pada suhu

kamar selama 10 menit, jika tersedia di atas microplate shaker dengan kecepatan 100 rpm, hindari daricahaya.

25. Tambahkan 100 µl stop solution ke dalam masing-masingwell

26. Tentukan optical density dari tiap well dalam waktu 30 menit menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 450 nm dan panjang gelombang koreksi pada 620 nm atau 650nm.

Pemeriksaankadarserum IL-20 menggunakanteknik ELISA denganstandar kit Human IL-20 ImmunoassayQuantikine^® ELISAR&D Systems. Pemeriksaan ini menggunakan teknik quantitatif sandwich enzyme immuno-assay. Sebelumnya antibodi monoklonal spesifik untuk IL-20 telah dilapisi dalam microplate.

Standar, sampel, kontrol dan konjugat dipipet ke dalam well. Seluruh IL-20 yang ada akan berikatan dengan antibodi yang ada dalam well. Setelah dicuci, keberadaan IL-20 yang berikatan dengan antibodi dalam well akan dipasangkan dengan immobilized antibody dengan antibody enzyme-linked monoclonal spesifik untuk IL-20. Kemudian dilakukan pencucian untuk menghilangkan substansi-

(14)

substansi yang tidak terikat dan atau reagen antibody-enzyme, lalu larutan substrat ditambahkan ke dalam well dan kemudian terbentuklah pembentukan warna yang sebanding dengan jumlah IL-20 yang terikat. Pembentukan warna dihentikan dan kemudian intensitas warna diukur. Pengukuran dilakukan menggunakan ELISA READER 680 (Biorad)

Persiapan Reagen - Wash Buffer

Encerkan 20 mL wash buffer konsentrat ke dalam 960 mL aquabidest untuk persiapan 500 mL wash buffer

- Larutan Substrat

Color reagen A dan color reagen B di campur dengan perbandingan volume yang sama. Dibuat 15 menit sebelum digunakan. Lindungi dari sinar matahari. Volume yang dibutuhkan adalah 200 µL

- Larutan IL-20 Standar

Larutkan human IL-20 standard dengan air distilasi. Hasil larutan ini akan menjadi larutan stok 40,000 pg/ml. Diamkan larutan standar selama 15 menit sebelum melakukan dilusi larutan.

Pipet 900 µl calibrator diluent RD5P kedalam tabung 4000 pg/ml. Pipet 500 uL ke dalam masing-masing tabung. Gunakan larutan stok untuk mendapatkan serial larutan seperti gambar di bawah ini. Larutan standar 4000 pg/mL digunakan sebagai standar tertinggi dan calibrator diluent RD5P sebagai standar nol (0 pg/mL).

(15)

Prosedur Kerja

1. Siapkan semua reagen, working standard, sampel dankontrol 2. Tambahkan 100 µl assay diluent RD1W ke dalamwell

3. Tambahkan 100 µl standar, control atau sampel ke dalam masing- masing well, campur denganbaik

5. Buang isi dari tiap well dan cuci dengan menambahkan 400 ul wash buffer ke dalam masing-masing well. Ulangi proses tersebut sebanyak 3 kali (total pencucian sebanyak 4 kali). Setelah pencucian terakhir, buang isi dari well, buang sisa wash buffer dengan mengetuk-ngetukkan plate secara terbalik pada lap kertas yangbersih

6. Segera tambahkan 200 µl IL-20 konjugat ke dalam masing-masing well.

Tutup plate dengan adhesive strip baru, inkubasi pada plate shaker di suhu kamar selama 2jam

7. Ulangi kembali proses pencucian seperti pada no.5

8. Tambahkan 200 µl larutan substrat ke dalam masing-masing well. Tutup plate dengan plate sealer baru, inkubasi pada plate shaker di suhu kamar selama 30 menit. Hindari kontak langsung dengancahaya.

9. Tambahkan 50 µl stop solution ke dalam masing-masing well.

Perubahan warna akan terjadi dari bitu ke kuning. Jika warna berubah hijau atau tidak ada perubahan warna, goyang-goyang plate utnuk memastikan pencampuransempurna.

10. Tentukan optical density dari tiap well dalam waktu 30 menit menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 450nm.

Pemeriksaankadarserum IL-22 menggunakanteknik ELISA denganstandar kit Human IL-22 ImmunoassayQuantikine^® ELISAR&D Systems.Pemeriksaan ini menggunakan teknik quantitatif sandwich enzyme immuno-assay. Sebelumnya antibodi monoklonal spesifik untuk IL-22 telah dilapisi dalam microplate.

(16)

Standar, sampel, kontrol dan konjugat dipipet ke dalam well. Seluruh IL-22 yang ada akan berikatan dengan antibodi yang ada dalam well. Setelah dicuci, keberadaan IL-22 yang berikatan dengan antibodi dalam well akan immobilized antibody dengan antibody enzyme-linked monoclonal spesifik untuk IL- 22.Kemudian dilakukan pencucian untuk menghilangkan substansi-substansi yang tidak terikat dan atau reagen antibody-enzyme, lalu larutan substrat ditambahkan ke dalam well dan kemudian terbentuklah pembentukan warna yang sebanding dengan jumlah IL-22 yang terikat. Pembentukan warna dihentikan dan kemudian intensitas warna diukur. Pengukuran dilakukan menggunakan ELISA READER 680 (Biorad)

Persiapan Reagen - Wash Buffer

Encerkan 20 mL wash buffer konsentrat ke dalam 960 mL aquabidest untuk persiapan 500 mL wash buffer.

- Larutan Substrat

Color reagen A dan color reagen B dicampur dengan perbandingan volume yang sama. Dibuat 15 menit sebelum digunakan. Lindungi dari sinar matahari. Volume yang dibutuhkan adalah 200 µL

- Larutan IL-22 HS Standar

Larutkan human IL-22 HS standard dengan air distilasi. Hasil larutan ini akan menjadi larutan stok 5500 pg/ml. Diamkan larutan standar selama 15 menit sebelum melakukan dilusi larutan.

Pipet 800 µLcalibrator diluent RD6-10 kedalam tabung 1000 pg/ml. Pipet 500 µL ke dalam masing-masing tabung. Gunakan larutan stok untuk mendapatkan serial larutan seperti gambar di bawah ini. Larutan standar 1000 pg/mL digunakan sebagai standar tertinggi dan calibrator diluent RD6-10sebagai standar nol (0 pg/mL).

(17)

Prosedur Kerja

1. Siapkan semua reagen,working standard, sampel dankontrol 2. Tambahkan 100 µL asssay diluent RD1-88 ke dalamwell

3. Tambahkan 100 µL standar, kontrol atau sampel ke dalam masing- masing well, campur denganbaik

5. Buang isi dari tiap well dan cuci dengan menambahkan 400 µLwash buffer ke dalam masing-masing well. Ulangi proses tersebut sebanyak 3 kali (total pencucian sebanyak 4 kali). Setelah pencucian terakhir, buang isi dari well, buang sisa wash buffer dengan mengetuk-ngetukkan plate secara terbalik pada lap kertas yangbersih

6. Segera tambahkan 200 µL IL-22 konjugat ke dalam masing-masing well. Tutup plate dengan adhesive strip baru, inkubasi pada plate shaker di suhu kamar selama 1jam

7. Uangi kembali proses pencucian seperti pada no.5

8. Tambahkan 200 µL larutan substrat ke dalam masing-masing well.

Tutup plate dengan plate sealer baru, inkubasi pada plate shaker di suhu kamar selama 30 menit. Hindari kontak langsung dengancahaya.

9. Tambahkan 50 µLstop solution ke dalam masing-masing well.

Perubahan warna akan terjadi dari biru ke kuning. Jika warna berubah hijau atau tidak ada perubahan warna, goyang-goyang plate utnuk memastikan pencampuransempurna.

(18)

10. Tentukan optical density dari tiap well dalam waktu 30 menit menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 450nm.

Data kadar serum E-selektin, IL-17, IL-20 dan IL-22sebelumterapi (pretest) dan 1 bulansetelahterapi (posttest) yang diperoleh selanjutnya akan dianalisis.

J. Alur Penelitian

Populasi

Kriteria Inklusi

Kriteria Eksklusi

Sampel

Kelompok perlakuan Kelompok kontrol

Diambil darah dandiukur kadar serum E-selektin, IL- 17, IL-20 dan IL-22

Terapi 1 bulan

Analisis data Randomisasi

(19)

K. Teknik Analisis Data

Analisis data penelitian ini menggunakan software statistik SPSS 21. Jika distribusi data normal maka analisis data menggunakan uji parametrik (uji t tidak berpasangan) dan jika distribusi data tidak normal maka menggunakan uji non parametrik (uji Mann-Whitney).

L. Etika Penelitian

Penelitian ini menggunakan persetujuan tertulis (informed consent), subjek penelitian diberikan penjelasan mengenai penelitian dan risiko yang mungkin timbul. Jika subjek telah mengerti dan bersedia berpartisipasi, maka subjek diminta menandatangani informed consent. Semua data yang diperoleh dalam penelitian ini akan dijaga kerahasiaannya dan hanya digunakan untuk kepentingan penelitian dan ilmiah.