LAPORAN PRAKTIKUM
KROMATOGRAFI
ISOLASI PIGMEN TANAMAN DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM
Dosen Pengampu :
FITRIA SUSILOWATI S.Pd, M.Sc
Disusun Oleh :
INDIANA GITA ANGGRAENI
36.2015.7.1.11.21
PRODI FARMASI
FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS DARUSSALAM GONTOR
KEGIATAN 3
ISOLASI PIGMEN TANAMAN DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM
I. TUJUAN
1. Melakukan isolasi pigmen tanaman dengan kromatografi kolom. 2. Memonitoring fraksi kolom dengan kromatografi lapis tipis.
II. DASAR TEORI
Kromatografi kolom adalah suatu teknik pemurnian untuk mengisolasi komponen yang diinginkan dai sutu campuran. Dalam kromatografi kolom, fase diam (adsorben padat) ditempatkan secara vertikal dalam kolom gelas dan fase gerak (cairan) ditempatkan pada bagian atas kolom dan begerak ke bawah melewati kolom (karena gravitasi atau tekanan eksternal). Sampel yang akan dianalisis dimsukkan ke bagian atas kolom. Eluen ditambahkan ke dalam kolom dan bergerak ke bawah melewtikolom. Keseimbangan terjadi antara komponen yang teradsopsi pda adorben dengan pelarut yang terelusi mengalir melewati kolom. (Basset, 1994).
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipsahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau bahkan tabung plastik. Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut (Gritter, 1991). Dalam kromatografi partisi cair-cair, suatu pemisahan dipengaruhi oleh distribusi sampel antara fase cair diam dan fase cair bergerak dengan membatasi kemampuan pencampuran. Jika suatu zat terlarut dikocok dalam sistem dua pelarut yang tidak bercampur atau saling melarutkan maka zat terlarut akan terdistribusi di antara kedua fase (Khopkar, 2008).
Klasifikasi Kromatografi Kolom berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben adalah : a. Kromatografi adsorbsia dalah kromatografi yang adsorbsi, komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom.
b. Kromatografi partisi, dalam kromtografi partisi, komponen yang dipisahkan secara selektif mengalami partisi antara lapisan cairan tipis pada penyangga padat yang bertindak sebagai fase diam dn eluen yang bertindak sebagai fase gerak.
c. Kromatografi petukran ion memishkan komponen yang berbentuk ion, komponen-komponen tersebut yang terikat pda penukar ion sebagai fase diam secara selektif akan terlepas/terelusi oleh fase gerak.
d. Komatogrfi filtrasi gel, dalam kromatografi filtrasi gel, kolom diisi dengan gel yang permeabel sebagai fase diam. Pemisahan berlangsung seperti proses pengayakan yang didasarkan atas ukuran molekul dari komponen yang dipisahkan (Khopkar, 2000).
Menurut Alimin (2007, hal: 75) keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi adalah :
a. Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil.
b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen. c. Proses pemisahan dalam dilakukan dalam waktu yang relatif singkat.
d. Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak memerlukan alat yang mahal dan rumit.
III. ALAT DAN BAHAN A. Alat
1. Kolom 1 buah
2. Klem dan statif 1 buah
3. Corong pisah 1 buah
4. Corong 1 buah
5. Botol vial 9 buah
6. Gelas beaker 4 buah
7. Mortar dan pestle 1 buah
8. Pipet tetes standar 4 buah
9. Pipet plastik 7 buah
10. Gelas ukur 5 mL 4 buah
11. Masker secukupnya
12. Pinset 1 buah
13. Sarung tangan secukupnya
14. Gelas ukur 25 mL 3 buah
15. Spatula 2 buah
16. Erlenmeyer 50 mL 1 buah
B. Bahan
1. Silika gel
2. Daun Bayam (Amarantus spinosus) 3. Kertas saring whatman
4. Plat KLT silica gel GF254
5. Solven PA aseton, n-heksan, methanol 6. Na2SO4 anhidrat
7. Kapas
IV. PROSEDUR KERJA Penyiapan kolom
Penyiapan ekstraksi sampel
Corong pisah
Timbang silica gel 3 gram
Tambahkan n-hexan secukupnya
Masukkan kapas ke dalam kolom
Masukkan campuran silica gel dan n-hexan kedalam kolom
Haluskan bayam dan tambahkan aseton 5 mL
Basahi kertas saring menggunakan aseton Masukkan anhidrat kedalam kertas saring Siapkan corong yang dilapisi kertas saring
Masukkan aquades 5 mL, n-hexan 5 mL, dan ekstrak sampel 5 mL kedalam corong pisah
Persiapan elusi
V. DATA PENGAMATAN
Tunggu sampai terjadi pemisahan
Pisahkan pelarut dan ekstrak sampel, lalu masukkan ekstrak sampel kedalam vial
Siapkan eluen n-hexan 5 mL ; n-hexan:aseton (7:3) diambil 5 mL ; aseton 5 mL ; aseton:methanol (8:2) diambil 5 mL ; methanol 5 mL
Masukkan ekstrak sampel kedalam kolom
VI. PEMBAHASAN
Kromatografi kolom adalah metode yang digunakan untuk memurnikan bahan kimia tunggal dari campurannya. Metode ini sering digunakan untuk aplikasi preparasi pada skala mikrogram hingga kilogram. Keuntungan utama kromatografi kolom adalah biaya yang rendah dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative, menentukan jumlah komponen campuran, dan memisahkan dan purifikasi substansi.
Kerugian kromatografi kolom yaitu untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual, metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama Prinsip kromatografi secara umum adalah pemanfaatan beda waktu tiap komponen yang dikandung sampel sewaktu berada pada fasa stasioner.
Jenis tumbuhan yang diekstraksi pada percobaan ini yakni daun bayam. Dalam proses ekstraksi pigmen digunakan daun bayam yang akan diekstraksi pigmennya. Untuk mengekstrak pigmen dalam daun bayam hanya digunakan daunnya saja sementara tulang
daunnya tidak digunakan karena pada pigmen tumbuhan umumnya terkandung pada daunnya. Daun bayam yang telah ditimbang kemudian ditambahkan aseton dan dilumatkan hingga halus. Penambahan aseton berfungsi untuk melarutkan pigmen yang terkandung dalam daun bayam, mengingat aseton merupakan pelarut non polar sehingga dapat dengan mudah melarutkan pigmen daun.
Ekstrak yang telah diperoleh lalu disaring menggunakan corong gelas yang ujungnya diberi kapas dan diisi dengan Na2SO4 anhidrat untuk memisahkan hasil ekstrak pigmen dengan
ampas daunnya. Adanya Na2SO4 anhidrat berfungsi untuk mengikat kandungan air yang
terdapat dalam ekstrak pigmen karena sifat dari Na₂SO₄ anhidrat yang higroskopis, sehingga diharapkan ekstrak pigmen tidak mengandung air.
Pada percobaan ini ekstrak pigmen aseton yang telah diperoleh di awal ditambahkan dengan n-heksana dan akuades. Penambahan ini menyebabkan pigmen terdistribusi dalam dua fasa, yakni fasa organik dan fasa air. Pigmen akan lebih terdistribusi ke fasa organik karena kesamaan sifat kepolarannya (non polar). Saat larutan dikocok akan membentuk dua lapisan yang tidak saling bercampur karena adanya perbedaan berat jenis antara keduanya (berat jenis n-heksana lebih ringan daripada air). Dikarenakan yang akan dianalisis adalah pigmen, maka yang diambil yakni fasa organiknya (lapisan atas).
Proses elusi pada kromatografi kolom dilakukan dengan mengelusikan larutan n-heksana (sifatnya paling non polar) terlebih dahulu untuk mengondisikan kolom yang akan diisi ekstrak pigmen (non polar). Setelah ekstrak pigmen dimasukkan ke dalam kolom, kemudian diikuti mengelusikan n-heksana, n- heksana/aseton (70/30), aseton, aseton/metanol (80/20), dan metanol. Urutan elusi ini berdasarkan sifat kepolarannya, di mana n-heksana bersifat paling non polar, sedangkan metanol yang paling polar.
Saat setiap eluen mulai dimasukkan, maka senyawa dalam ekstrak pigmen tadi akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan sifat kepolarannya. Setiap senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung akan diperoleh beberapa fraksi. Jika menurut urutan eluen yang dimasukkan dalam kolom, maka diperkirakan fraksi awal yang keluar akan memiliki sifat kepolaran yang paling rendah, sedangkan fraksi akhir yang keluar memiliki sifat kepolaran yang paling tinggi.
Sesuai dengan hasil pengamatan, pigmen warna terbagi dalam 9 vial berupa dan empat warna inti yaitu bening, coklat, kuning, dan hijau. Dari warna yang didapat maka dapat dianalisa bahwa daun bayam mengandung karoten, xantofil, serta klorofil, yang kestabilannya tahan pada panas. Kandungan besi pada bayam relatif lebih tinggi daripada sayuran lain (besi merupakan penyusun sitokrom, protein yang terlibat dalam proses fotosintesis) sehingga berguna bagi penderita anemia. Daun bayam mempunyai kandungan klorofil yang tinggi, sehingga laju fotosintesisnya juga tinggi.
Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b, yang membedakan adalah adanya gugus aldehid pada struktur klorofil b. Karoten adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% beta karoten dan 10% alpha karoten. Xantofil adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan xantofil dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten.
Pada percobaan kromatografi kolom ini kami mengalami sebuah kesalahan ditahap pemisahan pigmen dari tumbuhan, dimana ekstrak sampel pada kolom mengalami peretakan sehingga pemisahan warna kurang maksimal. Untuk menanggapi hal tersebut maka sampel kolom harus didinginkan dengan cara membasahi tissu dengan metanol dan membalutkannya pada kolom.
VII. KESIMPULAN
1. Penambahan Na2SO4 anhidrat berfungsi untuk mengikat kandungan air yang
terdapat dalam ekstrak pigmen karena sifat Na2SO4 yang higroskopis dan
diharapkan ekstrak pigmen tidak mengandung air.
2. Proses elusi berawal dari n-hexan lalu diikuti n-hexan: aseton (7:3) ; aseton 5 mL ; aseton:methanol (8:2) ; methanol yang berdasarkan sifat kepolaran, dimana n-hexan bersifat paling nonpolar dan methanol paling polar.
3. Daun bayam mempunyai kandungan klorofil yang tinggi yaitu klorofil a dan klorofil b, karoten dengan 90% beta karoten dan 10% alpha karoten serta xatofil.
DAFTAR PUSTAKA
Alimin, dkk. 2007. Kimia Analitik. Makassar: Alauddin Press.
Basset, J. 1994. Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.
Gritter, R. J. 1991. Pengantar Kromatografi. ITB. Bandung.
Khopkar, S.M. 2000. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press. Jakarta Khopkar, S.M. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Erlangga,
