i
PENENTUAN KADAR α-TOKOFEROL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN BIJI PANGI (Pangium edule Reinw) HASIL OLAHAN TRADISIONAL ETNIS BUGIS DAN TORAJA
DETERMINATION α-TOCOPHEROL AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF PANGI (Pangium edule Reinw) SEEDS BY
TRADITIONAL PROCESSED PRODUCT OF BUGINESE AND TORAJANESE
RAYMOND ARIEF N. NOENA
PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2017
ii
PENENTUAN KADAR α-TOKOFEROL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN BIJI PANGI (Pangium edule Reinw) HASIL OLAHAN TRADISIONAL ETNIS BUGIS DAN TORAJA
Tesis
Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar Magister
Program Studi
Farmasi – Herbal Medicine
Disusun dan diajukan oleh
RAYMOND ARIEF N. NOENA
Kepada
PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2017
iii
iv
PERNYATAAN KEASLIAN TESIS
Yang bertanda tangan di bawah ini
Nama : Raymond Arief N. Noena Nomor Mahasiswa : P2501215001
Program studi : Farmasi – Herbal Medicine
Menyatakan dengan sebenarnya bahwa tesis yang saya tulis ini benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri, bukan merupakan pengambilan tulisan atau pemikiran orang lain. Apabila di kemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa sebagian atau keseluruhan tesis ini hasil karya orang lain, saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.
Makassar, 19 Oktober 2017
Yang menyatakan
Raymond Arief N. Noena
v PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Alhamdulillah, segala puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat, taufik dan hidayahNya hingga penulis dapat merampungkan penelitian dan penyusunan tesis ini.
Penulis menyadari bahwa terdapat banyak hambatan, rintangan dan tantangan dalam penyelesaian penelitian dan penyusunan tesis ini namun dengan dukungan dan bantuan dari berbagai pihak akhirnya tesis ini dapat terselesaikan. Penghargaan setinggi-tingginya penulis haturkan kepada ayahanda tercinta Arief N.Noena dan ibunda Sartje Nur yang senantiasa mendoakan dan mendukung penulis dalam studi ini dan juga kepada isteri tercinta Nurul Hidayah Base yang selalu hadir memberi semangat dan setia mendampingi dalam suka dan duka.
Penulis menghaturkan terima kasih dan penghargaan setinggi- tingginya kepada yang terhormat Ibu Dr. Mufidah, S.Si, M.Si, Apt dan Ibu Dr. Risfah Yulianty, M.Si, Apt selaku komisi penasehat atas segala bimbingan, saran dan motivasi yang tak terbatas kepada penulis selama penelitian hingga tesis ini dapat terselesaikan. Pada kesempatan ini pula penulis mengucapkan terima kasih kepada :
1. Bapak Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si, Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin dan sekaligus sebagai komisi penguji.
vi
2. Ibu Dr. Hj. Latifah Rahman, DESS, Apt selaku Ketua Program Studi Magister Farmasi Universitas Hasanuddin dan sekaligus sebagai komisi penguji atas masukan dan saran yang telah diberikan demi kesempurnaan tesis ini
3. Bapak Dr. Muhammad Aswad, M.Si, Ph.D selaku komisi penguji atas kritik dan saran yang telah diberikan hingga akhir ujian tesis ini
4. Dr. H. Muhammad Guntur, M.Kes, Apt selaku Kepala Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan Provinsi Sulawesi Selatan beserta segenap staf atas kesediaannya memfasilitasi pelaksanaan pengujian pada Laboratorium Obat Tradisional BBPOM Makassar.
5. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan namanya satu per satu atas segala bantuan, dukungan, kebaikan dan keikhlasan yang telah diberikan kepada penulis hingga penelitian dan studi ini dapat terselesaikan dengan baik
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan sehingga kiritik dan saran yang bersifat membangun senantiasa diharapkan demi terciptanya dokumen yang lebih bermutu. Semoga tesis ini bermanfaat dan dapat menjadi referensi bagi pengembangan ilmu farmasi.
Makassar, Oktober 2017
Raymond Arief N.Noena
vii ABSTRAK
RAYMOND ARIEF N. NOENA. Penentuan Kadar α-Tokoferol dan Uji Aktivitas Antioksidan Biji Pangi (Pangium edule Reinw) Hasil Olahan Tradisional Etnis Bugis Dan Toraja (dibimbing oleh Mufidah dan Risfah Yulianty).
Biji Pangi (Pangium edule Reinw) di Sulawesi Selatan dapat ditemukan dalam beberapa bentuk hasil olahan yaitu keluwak (olahan Bugis) dan serbuk pangi/pammarasan (olahan Toraja). Biji buah pangi diketahui memiliki potensi sebagai sumber antioksidan alamiah. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kadar α−tokoferol dan aktivitas antioksidan biji pangi yang dibuat dari hasil olahan tradisional Bugis dan Toraja.
Parameter pengujian meliputi penentuan kadar α−tokoferol dalam ekstrak n-heksan keluwak dan pammarasan kering dengan metode HPLC-UV, penentuan kadar fenolik dan flavonoid total serta uji aktivitas antioksidan
dengan metode DPPH Radical Scavenging Agent (DPPH-RSA) dan β-Carotene Linoleic Acid Bleaching (BCB). Hasil penelitian menunjukkan
bahwa kadar α−tokoferol dalam ekstrak n-heksan keluwak dan pammarasan kering masing-masing sebesar 11,96%b/b dan 7,68 %b/b, fenolik total ekstrak etanol keluwak sebesar 27,33%b/b ekuivalen asam galat dan flavonoid total sebesar 5.93% b/b ekuivalen quersetin. Ekstrak etanol pammarasan kering menunjukkan potensi aktivitas antioksidan pada kedua metode pengujian dengan nilai IC50 89.46 μg/ml dan 143.77 μg/ml.
Penelitian ini menyimpulkan bahwa olahan tradisional biji pangi Bugis dan Toraja memiliki aktivitas antioksidan (P<0,05).
Kata kunci : Pangium edule Reinw, antioksidan, α−tokoferol, biji pangi, BCB, DPPH, IC50 , keluwak, pammarasan
viii ABSTRACT
RAYMOND ARIEF N. NOENA. Determination α-Tocopherol and Antioxidant Activity Of Pangi (Pangium Edule Reinw) Seeds By Traditional Processed Product Of Buginese And Torajanese (Supervised by Mufidah and Risfah Yulianty)
Pangi (Pangium edule Reinw) in South of Sulawesi can be found in several processed products namely keluwak (processed by Buginese) and pangi powder/pammarasan (processed by Torajanese). Pangi seeds are known to have potential as a source of natural antioxidants. This study aims to determine the levels of α−tocopherol and the antioxidant activity of pangi seed are made from traditional product processed by Buginese and Torajanese. Parameter testing includes determination of α−tocopherol in both of n-hexane extract of keluwak and dry pammarasan by HPLC-UV method, determination of total phenolic and flavonoid and antioxidant activity assay by DPPH Radical Scavenging Agent (DPPH-RSA) and β−Caroten Linoleic Acid Bleaching (BCB). Research result showed that concentration of α−tocopherol in n-hexane extract of keluwak and dry pammarasan were 11,96 and 7,68 %w/w, total phenolic of ethanol extract from keluwak about 27.33% w/w as gallic acid equivalent and total flavonoid 5.93% w/w as quercetin equivalent. Ethanol extract of pammarasan showed the most potent antioxidant activity in both methods (IC50 value 89.46 μg/ml and 143.77 μg/ml). This study concluded that traditionally processed of pangi seeds of both Buginese and Torajanese have antioxidant activity (P<0,05)
Keyword : Pangium edule Reinw,antioxidant, α−tocopherol, pangi seed, BCB, DPPH, IC50 value, keluwak, pammarasan
ix DAFTAR ISI
Halaman
PRAKATA v
ABSTRAK vii
ABSTRACT viii
DAFTAR ISI ix
DAFTAR TABEL xi
DAFTAR GAMBAR xii
DAFTAR LAMPIRAN xiii
DAFTAR SINGKATAN xv
I. PENDAHULUAN 1
A. Latar Belakang 1
B. Rumusan Masalah 3
C. Tujuan Penelitian 4
D. Manfaat Penelitian 4
II. TINJAUAN PUSTAKA 5
A. Uraian Tumbuhan Pangi (Pangium edule Reinw) 5
B. Vitamin E 9
C. Antioksidan 13
D. Uji Aktivitas Antioksidan 16
E. Penentuan Fenolik Total 19
F. Penentuan Flavonoid Total 20
x
G. Metode HPLC 23
H Kerangka Teori 26
I. Kerangka Konsep 27
J. Hipotesa 28
III. METODE PENELITIAN 29
A. Rancangan Penelitian 29
B. Lokasi dan Waktu 29
C. Alat dan Bahan 29
D. Metode Kerja 30
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 39
V. PENUTUP 51
A. Kesimpulan 51
B. Saran 52
DAFTAR PUSTAKA 53
LAMPIRAN 58
xi
DAFTAR TABEL
Nomor Halaman
1. Karakteristik absorbansi UV dan Floresensi Vitamin E 25 2. Hasil Analisis Data Kadar Air, Fenolik dan Falvonoid
Total dan Aktivitas antioksidan metode DPPH dan BCB
41
3 Spesifikasi sistem HPLC yang digunakan dalam penetapan kadar vitamin E total
46
xii
DAFTAR GAMBAR
Nomor Halaman
1. Tumbuhan Pangi (Pangium edule Reinw) 7
2. Buah pangi 8
3. Struktur isomer tokoferol dan tokotrienol ; bentuk α (5,7,8- trimethyltocol), β (5,8 -dimethyltocol), ɣ (7,8- dimethyltocol), δ (8-methyltocol)
11
4 Analisis tokoferol dan tokokromanol dengan instrumen HPLC C18-reverse phase pada (a) ekstrak biji kedelai (b) biji bunga matahari, (c) biji beras dan (d) endosperm kelapa
12
5. Reaksi Radikal DPPH dengan Antioksidan 17 6. Reaksi Fenol dengan pereaksi Folin- Ciocalteu 20
7. Kerangka C6 – C3 – C6 Flavonoid 21
8. Pembentukan senyawa kompleks quersetin-alumunium klorida
22
9. Kadar fenolik dan flavonoid total ekstrak etanol biji pangi mentah dan olahan
42
10. Nilai IC50 sampel dengan metode DPPH 44 11. Nilai IC50 sampel dengan metode BCB 45 12. Kromatogram hasil analisa kandungan α-tokoferol pada
sampel ekstrak n-heksan keluwak Bugis dengan instrumen HPLC-UV pada panjang gelombang 292 nm
48
13 Kromatogram hasil analisa kandungan α-tokoferol pada sampel ekstrak n-heksan pangi kering Toraja dengan instrument HPLC-UV pada panjang gelombang 292 nm
49
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Halaman
1. Skema Kerja Penelitian 58
2. Skema Pengujian Kadar Air dengan Metode Thermogravimetri
59
3. Skema Pengujian Kadar Fenolik Total dengan Metode Folin Ciocalteu
60
4. Skema Pengujian Kadar Flavonoid Total 62
5. Skema Pengujian Antioksidan Dengan Metode DPPH 64 6. Skema Pengujian Antioksidan Dengan Metode β-Carotene
Linoleic Acid Bleaching
65
7. Skema Analisis Kandungan Vitamin E Dengan Metode HPLC 66
8. Perhitungan Kadar Air 67
9. Perhitungan Nilai Rendemen 69
10. Hasil Analisis Kadar Fenolik Total 72
11. Hasil Analisis Kadar Flavonoid Total 76
12. Uji Antioksidan dengan Metode DPPH 80
13. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode β-Carotene Linoleic Acid Bleaching (BCB)
90
14. Hasil Analisis Kadar Vitamin E dengan Metode HPLC 98 15. Analisis Statistik Pengaruh Olahan Biji Pangi Terhadap Kadar
Fenolik Total
102
16 Analisis Statistik Pengaruh Olahan Biji Pangi Terhadap Kadar Flavonoid Total
105
17. Analisis Statistik Pengaruh Daerah Terhadap Aktivitas Antioksidan
108
xiv
18 Analisis Statistik Pengaruh Olahan Biji Pangi Terhadap Aktivitas Antioksidan
109
19. Gambar Sampel Penelitian 119
20 Gambar Uji Aktivitas Antioksidan 120
21 Gambar Pengukuran Fenolik Total 121
22 Gambar Alat-alat Penelitian 122
23 Gambar Determinasi Tumbuhan Pangi 123
24 Hasil Determinasi Tumbuhan Pangi 124
25 Sertifikat Pengujian Baku Standar α-Tokoferol 125
xv
DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN
Lambang/singkatan Arti dan Keterangan
%b/b Persen bobot per bobot , menyatakan jumlah gram zat dalam 100 gram sampel /campuran.
µg mikrogram
BCB β-Carotene Linoleic Acid Bleaching DPPH 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl
GAE Gallic Acid Equivalen, ekuivalen asam galat HPLC High Performance Liquid Chromatography,
kromatografi cair kinerja tinggi
IC50 Konsentrasi untuk menghambat 50 % radikal bebas
KL Sampel keluwak Bugis
nm Satuan nano meter
ppm Part per Million, bagian per juta PBM Sampel biji pangi mentah Bugis
PBS Sampel pangi basah Toraja
PKR Sampel pangi kering Toraja
PTM Sampel biji pangi mentah Toraja
QE Quersetin Equivalen, ekuivalen kuersetin
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Tumbuhan pangi (Pangium edule Reinw) merupakan tumbuhan vegetasi Indonesia yang memiliki banyak kegunaan dan telah dimanfaatkan secara luas oleh masyarakat terutama di Sulawesi Selatan oleh etnis Bugis dan Toraja yang mengolah buah pangi ini menjadi bumbu dan masakan.
Etnis Bugis mengolah biji buah pangi secara tradisional dengan cara memeram biji di bawah tanah selama 40 hari yang disebut keluwak dan digunakan sebagai bumbu masakan. Sebagian kecil masyarakat Bugis terutama di kabupaten Soppeng juga memanfaatkan daun pangi segar sebagai pembungkus ikan untuk menjaga kesegaran ikan agar bertahan antara 1-2 hari selama masa penyimpanan (Tahir, 2017).
Etnis Toraja mengolah kulit bagian dalam buah pangi yang berwarna putih dengan cara diiris tipis-tipis, dijemur sampai kering dan dikonsumsi sebagai makanan yang disebut kuli' pangi sedangkan salut biji diolah dengan cara dikeringkan yang disebut kaloko. Biji yang sudah terlepas dari kaloko mempunyai tempurung yang sangat keras. Di dalam biji inilah terdapat daging biji berwarna putih (endospem) yang dijadikan pammarasan. Pammarasan merupakan serbuk biji pangi yang diolah secara tradisonal dengan cara pengeringan. Bentuknya berupa serbuk
2
pangi kering dan pangi basah yang berbentuk bulat seperti bola (Oktavin, 2017).
Seluruh bagian tumbuhan pangi mengandung asam sianida dengan kadar 350 gram per pohonnya (Heyne, 1987) sehingga secara tradisional banyak dimanfaatkan sebagai pengawet bahan makanan terutama untuk daging ikan. Ekstrak metanol daun pangi dengan konsentrasi 6,25%
menunjukkan aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri pembusuk daging yaitu Bacillus cereus dan Salmonella typhimurium sedangkan ekstrak aseton biji buah pangi memiliki aktivitas antioksidan dengan kandungan senyawa fenol sebesar 22,22 mgGAE/gram dan menghambat pertumbuhan bakteri Salmonella typhimurium dan Listeria monocytogenes (Suhardi, 2009; Chye et al, 2009).
Biji pangi mengandung senyawa antioksidan dan asam lemak tak jenuh. Menurut Fardiaz (1992) bahwa ekstrak metanol biji pangi yang sudah difermentasi mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih tinggi daripada ekstrak metanol dari biji pangi segar. Senyawa antioksidan dalam biji pangi bersifat nonpolar, berasal dari senyawa tokokromanol yaitu α-, γ- dan δ-tokotrienol, dengan senyawa dominan ialah δ-tokotrienol sedangkan yang relatif polarnya adalah asam karboksilat dan gula, yang merupakan glikon senyawa fenolik konjugat. Senyawa fenolik konjugat ini menurun selama tahap awal germinasi namun setelah hipokotil mensintesis klorofil, senyawa ini kembali meningkat dan bersamaan dengan itu senyawa tokoferol disintesis (Andarwulan et al. 1999). Biji pangi juga dapat dipakai
3
sebagai bahan baku pembuatan minyak goreng alternatif karena mengandung asam lemak linoleat dan oleat yang cukup tinggi (Taufik, 2000). Proses pengolahan tradisional biji pangi yang berbeda diduga akan mempengaruhi kandungan zat aktif yang terdapat di dalamnya sebagaimana perubahan zat aktif dan aktivitas antioksidan yang telah dilaporkan oleh Fardiaz dan Andarwulan (1999).
Berdasarkan hal tersebut di atas, maka penelitian dilakukan untuk menentukan kadar α-tokoferol, fenolik dan flavonoid total dan menguji aktivitas antioksidan ekstrak biji pangi (Pangium edule Reinw) hasil olahan tradisional etnis Bugis dan Toraja.
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang diatas maka permasalahan yang timbul adalah :
1. Seberapa besar kadar α-tokoferol, fenolik total dan flavonoid total dari ekstrak n-heksan dan ekstrak etanol biji pangi hasil olahan tradisional etnis Bugis dan Toraja ?
2. Seberapa besar aktivitas antioksidan ekstrak n-heksan dan ekstrak etanol biji pangi hasil olahan tradisional etnis Bugis dan Toraja ?
4
C. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
1. Menentukan kadar α-tokoferol ekstrak n-heksan biji pangi dan kadar fenolik total dan flavonoid total dari ekstrak etanol biji pangi hasil olahan tradisional etnis Bugis dan Toraja
2. Menentukan aktivitas antioksidan ekstrak n-heksan dan ekstrak etanol biji pangi hasil olahan tradisional etnis Bugis dan Toraja
D. Manfaat Penelitian
Memberikan informasi bagi masyarakat tentang potensi biji pangi (Pangium edule Reinw) sebagai sumber antioksidan yang dapat dikembangkan sebagai sediaan farmasi yang berguna dalam bidang pengobatan serta menjadikan olahan biji pangi sebagai komoditi yang bernilai ekonomis bagi daerah dan masyarakat.
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Uraian Tumbuhan Pangi (Pangium edule Reinw)
1. Klasifikasi Tumbuhan
Pangi (Pangium edule Reinw) di klasifikasikan sebagai berikut (ITIS, 2011) :
Kerajaan : Plantae Sub kerajaan : Viridiplantae Superdivisi : Embryophyta Divisi : Tracheophyta Anak divisi : Spermatophytina
Kelas : Magnoliopsida
Bangsa : Malpighiales
Suku : Achariaceae
Marga : Pangium
Jenis : Pangium edule REINW
2. Nama daerah
Tumbuhan pangi memiliki banyak nama daerah antara lain : pucung (Jakarta), kluwak (Jawa), pakem (Bali, Jawa, Kalimantan), pacung, picung (Sunda), gempani atau hapesong (Toba), kayu tuba buah (Lampung), jeho
6
(Enggano), kapenceung, kapecong, simaung (Minangkabau), kuam (Kalimantan), pangi (Minahasa, Ambon), kalowa, kalowa’ (Sumbawa, Makasar), ngafu (Tanimbar), calli, lioja (Seram), kapait (Buru, Aru), awaran (Manokwari), kepayang (Malaysia) dan football fruit (Inggris) (Heyne, 1987).
3. Penyebaran
Tumbuhan pangi tersebar di kawasan Micronesia, Melanesia, dan Asia Tenggara termasuk Indonesia terutama di Jawa Barat, Jawa Timur, Jawa Tengah, Sulawesi Selatan, Sumatera Barat (Hanum, 1996)
4. Morfologi Tumbuhan Pangi
Tumbuhan pangi ini berupa pohon yang memiliki ukuran besar dengan tinggi pohonnya mencapai 8 - 40 m dengan diameter batang pohon berkisar 100 cm - 2,5 m. Ranting muda berambut coklat rapat dengan daun terkumpul pada ujung ranting, bertangkai panjang, helaian daun pada pohon muda berlekuk 3 sedangkan pada pohon pangi yang sudah tua berbentuk bulat telur melebar dengan pangkal yang terpancung atau bentuk jantung, meruncing. Permukaan daun tanaman pangi pada bagian atas licin berwarna hijau tua mengkilap, pada permukaan bawahnya berambut coklat dan tersusun rapat dengan tulang daun menonjol. Bunga tanaman pangi berwarna coklat kehijauan, tumbuh pada ketiak daun atau hampir di setiap ujung ranting. Bunga kebanyakan berkelamin tunggal. Bunga jantan tersusun dalam tandan sedangkan bunga betina soliter, kadang-kadang
7
dalam tandan. Anak tangkai dan kelopak berambut coklat, tinggi kelopak 1-2 cm dan daun mahkota berjumlah 5 – 8 helaian berbentuk oval memanjang berwarna hijau muda (Hanum, 1996).
Buah tanaman pangi berupa buah buni berbentuk bulat seperti telur atau lonjong, kulit buah pangi yang telah tua berwarna coklat dengan permukaan kasar. Diameter buah pangi berkisar antara 10 - 25 cm. Daging buah pangi berwarna kuning pucat, lunak dan dapat dimakan. Tiap buah pangi berisi sampai 18 biji atau lebih. Pada bagian kulit biji keluwak ini sangat tebal dan keras. Habitat keluwak pada daerah dengan ketinggian antara 10 - 1.000 m dari permukaan air laut (Lim, 2013).
Gambar 1. Tumbuhan Pangi (Pangium edule Reinw) (koleksi pribadi, 2017)
8
5. Kandungan Gizi dan Kimia
Komposisi gizi inti biji pangi untuk 100 gram bagian yang dapat dimakan meliputi air 57,7%, energi 227 kkal, protein 7,3%, lemak 20,2%, karbohidrat 4,1%, serat kasar (fiber) 9,6%, abu 1,1%, fosfor 30 mg, kalium 401 mg, kalsium 42 mg, magnesium 97 mg, besi 2,1 mg, mangan 47 ppm, tembaga 3,4 ppm, seng 14 ppm dan vitamin C 19 mg (Boon et al., 1999).
Biji mengandung glikosida sianogenik, alkaloid, flavonoid, steroid, saponin dan tanin. Kandungan kimia lainnya adalah asam palmitat, asam linoleat, asam linoelaidat (Lim et al., 2013). Pada biji pangi yang telah terfermentasi diketahui mengandung antioksidan bersifat polar yang diduga sebagai senyawa 1-p-hidroksifenil-7aminoheptana (Kasim and David, 2013).
Senyawa antioksidan non polar yang ditemukan antara lain adalah α-, ɣ- dan δ-tokotrienol sedangkan yang relatif polarnya adalah asam karboksilat dan gula, yang merupakan glikon senyawa fenolik konjugat (Andarwulan et al., 1999).
Gambar 2. Buah pangi (Koleksi pribadi, 2017)
9
6. Kegunaan
Ekstrak fenolik biji pangi diketahui mempunyai aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri Listeria monocytogenes dan Salmonella typhimurium.
Ekstrak aseton biji pangi juga menunjukkan potensi sebagai antioksidan berdasarkan pengujian menggunakan metode DPPH dan β-Carotene Linoleic Bleaching Assay (Chye et al, 2009). Infusa daun pangi juga diketahui memiliki pengaruh terhadap penurunan kadar kolesterol darah pada tikus putih jantan galur wistar (Mandey and Bodhi, 2014). Tanaman ini dapat digunakan sebagai antiseptik, pencegah parasit dan pemusnah hama yang mujarab (Heyne, 1987). Ekstrak metanol biji pangi dan daun pangi yang mengandung senyawa asam sianida, flavonoid dan saponin menunjukkan potensi sebagai insektisida pada hama tanaman dengan tingkat mortalitas hingga 75% (Wiryadiputra et al., 2014).
B. Vitamin E
Vitamin E adalah istilah kolektif untuk senyawa tokoferol dan tokotrienol. Vitamin E pertama kali ditemukan dalam bentuk α-tokoferol pada tahun 1922 oleh Herbert Evans. Senyawa α-tokoferol ini pertama kali diisolasi dari minyak gandum dan rumus kimia C29H50O, lalu pada tahun berikutnya berhasil diisolasi β dan ɣ-tokoferol. Diketahui bahwa α-tokoferol memiliki biologis yang lebih tinggi aktivitas dari β- dan ɣ -tokoferol. Pada tahun 1947 berhasil diisolasi senyawa δ-tokoferol dari minyak kedelai.
10
Senyawa tokotrienol pertama yang diidentifikasi sebagai α -, β –tokotrienol sedangkan ɣ- dan δ-tokotrienol diidentifikasi dari minyak sawit (Seppanen et al., 2010). Molekul tokoferol dan tokotrienol juga disebut sebagai tokokromanol yang terdiri dari cincin kromanol yang terikat pada rantai isoprenoid yang bersifat hidrofobik. Rantai tokoferol adalah alifatik jenuh sedangkan rantai samping tokotrienol berisi tiga ikatan ganda trans.
Terdapat empat bentuk isomer tokoferol dan tokotrienol yaitu bentuk α (alfa), β (beta), ɣ (gamma) dan δ (delta). Isomer tersebut dibedakan berdasarkan kedudukan gugus metil pada cincin kromanol. Bentuk α-tokotrienol dan tokoferol memiliki tiga gugus metil sedangkan bentuk β,ɣ memiliki dua gugus metil dan bentuk δ memiliki satu gugus metil.
Perbedaan struktur ini mempengaruhi tingkat aktivitasnya secara biologik (Colombo, 2010).
Semua tokoferol dan tokotrienol merupakan antioksidan potensial dengan mekanisme kerja penangkapan radikal bebas. Hanya saja sampai saat ini, sebagian besar penelitian tentang vitamin E terutama difokuskan pada α-tokoferol karena senyawa ini adalah bentuk dominan vitamin E pada jaringan. Suatu mekanisme aksi vitamin E terdiri dari donasi atom hidrogen fenolik ke radikal peroksil dan mengubahnya menjadi hidroperoksida. Senyawa radikal tokoferoksil yang dihasilkan ini menjadi lebih stabil sehingga tidak dapat melanjutkan siklus peroksidasinya (Jiménez et al.,2016).
11
Gambar 3. Struktur isomer tokoferol dan tokotrienol ; bentuk α (5,7,8- trimethyltocol), β (5,8 -dimethyltocol), ɣ (7,8-dimethyltocol), δ (8-methyltocol) (Hunter and Cahoon, 2007).
Tokoferol terdapat secara luas pada tanaman namun bentuk tokoferol ini sering berbeda dalam daun dan biji dari spesies tanaman yang sama, seperti biji kedelai yang mengandung lebih banyak ɣ -tokoferol daripada jumlah α- tokoferol dan δ-tokoferol. Tokotrienol dapat ditemukan dalam biji tanaman dikotil, termasuk tanaman keluarga Apiaceae (dan juga terdapat pada endosperm biji monokotil, penting seperti gandum, beras, dan barley (Gambar. 4). (Hunter & Cahoon, 2007).
Tokotrienol Tokoferol
12
Gambar 4. Analisis tokoferol dan tokokromanol dengan instrumen HPLC C18-reverse phase pada (a) ekstrak biji kedelai (b) biji bunga matahari, (c) biji beras dan (d) endosperm kelapa (Hunter & Cahoon, 2007).
Tokotrienol diketahui memiliki aktivitas neuroprotektif, antioksidan, anti-kanker dan dapat menurunkan kolesterol dengan sifat kerja yang berbeda dari sifat-sifat tokoferol. Jumlah mikromolar dari tokotrienol menekan aktivitas enzim HMG-CoA reduktase, yang bertanggung jawab untuk sintesis kolesterol. Tokotrienol diperkirakan memiliki sifat antioksidan yang lebih manjur dari α-tokoferol. Sisi tak jenuh rantai tokotrienol memungkinkan untuk penetrasi lebih efisien ke dalam jaringan yang memiliki lapisan lemak jenuh seperti otak dan hati (Ahsan et al., 2014)
13
C. Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang terdapat secara alami dalam bahan pangan. Senyawa ini berfungsi untuk melindungi bahan pangan dari kerusakan yang disebabkan terjadinya reaksi oksidasi lemak atau minyak yang sehingga bahan pangan yang berasa dan beraroma tengik (Andarwulan et al.,1999). Antioksidan merupakan agen yang dapat membatasi efek dari reaksi oksidasi dalam tubuh. Secara langsung efek yang diberikan oleh antioksidan dalam tubuh yaitu dengan mereduksi radikal bebas dalam tubuh dan secara tidak langsung yaitu dengan mencegah terjadinya pembentukan radikal. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut dapat dihambat (Wildman, 2001).
Antioksidan diklasifikasikan menjadi dua kelompok besar berdasarkan kelarutannya yaitu antioksidan larut air seperti asam askorbat, glutathione,asam lipoat dan asam urat dan antioksidan larut lemak seperti
karoten dan ubiquinol. Secara umum, antioksidan yang larut dalam air bereaksi dengan oksidan dalam sel sitosol dan plasma darah, sementara antioksidan larut lipid melindungi sel membran dari lipid per oksidasi (Mishra, 2011). Antioksidan juga dapat dikelompokkan berdasarkan jenisnya yaitu : Antioksidan Enzimatis dan Antioksidan non Enzimatis (Winarsih, 2007).
14
A. Antioksidan enzimatis:
Golongan ini merupakan antioksidan endogenus atau biasa juga disebut sebagai antioksidan primer, yang termasuk di dalamnya adalah enzim superoksida dismutase (SOD), katalase, glutation peroksidase (GSH-PX), serta glutation reduktase (GSHR). Antioksidan ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa radikal baru, yaitu mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya sebelum senyawa radikal bebas bereaksi. Antioksidan bekerja melalui mekanisme pemutusan rantai reaksi radikal dengan mendonorkan atom hidrogen secara cepat pada suatu lipid yang radikal, produk yang dihasilkan lebih stabil dari produk awal. Antioksidan golongan enzim ini adalah antioksidan yang sifatnya sebagai pemutus reaksi berantai (chain-breaking antioxidant) yang bisa bereaksi dengan radikal-radikal lipid dan mengubahnya menjadi produk-produk yang lebih stabil
B. Antioksidan Non-Enzimatis
Antioksidan ini disebut juga sebagai antioksidan eksogenus atau antioksidan sekunder. Antioksidan ini bekerja dengan cara mengkelat logam yang bertindak sebagai pro-oksidan, menangkap radikal dan mencegah terjadinya reaksi berantai. Antioksidan sekunder berperan sebagai pengikat ion-ion logam, penangkap oksigen, pengurai hidroperoksida menjadi senyawa non radikal, penyerap radiasi UV atau deaktivasi singlet oksigen. Lipida pangan umumnya mengandung ion-ion logam dalam jumlah sangat kecil yang mungkin berasal dari enzim-enzim
15
yang diaktifkan oleh logam, berasal dari peralatan pemurnian minyak atau berasal dari proses hidrogenasi. Logam-logam berat khususnya yang bervalensi dua atau lebih dengan potensial redoks yang sesuai, seperti Co, Cu, Fe, Mn dan sebagainya akan mempersingkat periode induksi dan meningkatkan kecepatan maksimum dari oksida lipida. Terbentuknya senyawa oksigen reaktif dihambat dengan cara pengkelatan metal, atau dirusak pembentukannya.
Asam sitrat, EDTA dan turunan asam fosfat adalah senyawa- senyawa pengkelat ion-ion logam. Asam sitrat yang banyak digunakan dalam produk pangan adalah pengkelat logam yang lemah. Meskipun demikian, senyawa ini sangat efektif dalam menghambat kerusakan oksidatif dari lipida dalam bentuk produk pangan dan umumnya ditambahkan kedalam minyak nabati sesudah proses deodorisasi.
Pengkelat ion-ion Logam ini sering disebut sinergis karena dapat meningkatkan aktivitas antioksidan fenolik. Antioksidan ini bisa juga didapatkan dari komponen nutrisi sayuran, buah dan rempah-rempah.
Komponen yang bersifat antioksidan dalam sayuran, buah dan rempah-rempah meliputi asam askorbat, vitamin E (tokoferol), β-karoten, flavonoid, isoflavon, flavon, antosianin, katekin dan isokatekin
(Kahkonen et al., 1999).
Kerusakan oksidatif atau kerusakan akibat radikal bebas dalam tubuh pada dasarnya bisa diatasi oleh antioksidan endogen tetapi jika senyawa radikal bebas terdapat berlebih dalam tubuh atau melebihi batas
16
kemampuan proteksi antioksidan seluler, maka dibutuhkan antioksidan tambahan dari luar atau antioksidan eksogen untuk menetralkan radikal yang terbentuk (Reynertson, 2007).
D. Uji Aktivitas Antioksidan
Berbagai metode telah dikembangkan untuk penentuan tokoferol dan tokotrienol dalam minyak. Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) fase normal atau fase balik (reverse) dipadukan dengan detektor ultraviolet (UV) dan atau detektor fluoresensi (FD) adalah teknik yang paling umum digunakan. Kromatografi gas (GC) dengan deteksi ionisasi nyala (FID), elektroforesis kapiler non-cairan (NACE) dengan deteksi fluorimetrik, spektroskopi inframerah transformasi fourier (FTIR) dan teknik elektroanalitik juga dilaporkan digunakan dalam determinasi senyawa tokoferol dan tokotrienol. HPLC fase normal memungkinkan pemisahan yang baik dari empat tokoferol dan empat tokotrienol dengan urutan elusi menjadi sebagai berikut: α-tokoferol < α-tokotrienol < β-tokoferol <
ɣ-tokoferol < β-tokotrienol< ɣ-tokotrienol < δ-tokoferol < δ-tokotrienol, namun metode ini memiliki kekurangan karena diperlukan waktu analisis yang panjang dan waktu retensi yang rendah (Zhang R, et al.,2013).
Teknik spektrometri berdasarkan pada reaksi radikal, kation radikal atau kompleks dengan kemampuan molekul antioksidan dalam menyumbangkan atom hidrogen. Metode pengujian dengan penangkapan radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) merupakan metode
17
pengukuran antioksidan yang sederhana, cepat, sensitif, reprodusibel untuk pengujian antioksidan. Metode ini juga dapat diterapkan baik untuk sampel berupa padatan maupun cairan. Radikal DPPH adalah suatu senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat pada panjang gelombang maksimal (λmax) 517 nm dan berwarna ungu gelap. Setelah bereaksi dengan senyawa antioksidan, DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan berubah menjadi kuning. Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer dan diplotkan terhadap konsentrasi (Pisoschi and Negulescu, 2011). Penurunan intensitas warna yang terjadi mengindikasikan berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH karena penangkapan satu elektron oleh zat antioksidan yang menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk beresonansi (Gambar 5).
Perubahan warna DPPH terjadi disebabkan oleh adanya senyawa yang bisa memberikan radikal hidrogen kepada radikal DPPH sehingga tereduksi menjadi senyawa DPPH-H (1,1-difenil-2- pikrilhidrazin).
Gambar 5. Reaksi Radikal DPPH dengan Antioksidan (Winarsih 2007)
18
Metode β-carotene bleaching (BCB) atau sering dikenal sebagai metode β-karoten-asam linoleat merupakan metode untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan berdasarkan pada kemampuan antioksidan untuk mencegah peluruhan warna jingga karoten akibat oksidasi dalam sistem emulsi minyak dan karoten. Dalam pengujian aktivitas antioksidan dengan β-carotene bleaching digunakan bahan-bahan utama, seperti β-karoten sebagai indikator aktivitas antioksidan, asam linoleat sebagai sumber radikal bebas, dan senyawa antioksidan sampel sebagai penghambat reaksi oksidasi (Utami, 2009).
Pada uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode β-karoten-asam linoleat, radikal bebas terbentuk dari hidroperoksida yang dihasilkan oleh asam linoleat. Radikal bebas asam linoleat terbentuk karena pengurangan atom hidrogen dari satu gugus metilen dialil yang menyerang ikatan rangkap pada beta karoten sehingga terjadi oksidasi beta karoten yang menyebabkan hilangnya gugus kromofor yang memberi warna orange. Perubahan warna ini dapat diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 470 nm (Jayaprakash et al., 2003). Lama pengukuran metode β-karoten-asam linoleat menurut literatur yang direkomendasikan adalah 0 menit sampai 120 menit dengan interval waktu 15 menit (Rosidah et al., 2008).
19
E. Penentuan Fenolik Total
Pengujian fenolik total menggunakan metode Folin Ciocalteu yang merupakan metode yang paling umum dalam menentukan fenolik total serta teknik pengerjaannya yang lebih murah dan mudah. Metode Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi dan reduksi kolorimetrik untuk mengukur semua senyawa fenolik dalam sampel uji sederhana (Singleton et al., 1965).
Metode ini menggunakan pembanding yaitu asam galat yang dipilih karena merupakan substansi yang stabil dan murni serta asam galat merupakan senyawa fenolik yang paling umum ditemukan pada tumbuhan. Asam galat dan sampel uji ketika direaksikan dengan reagen Folin Ciocalteu akan menghasilkan warna kuning yang menandakan bahwa sampel uji mengandung senyawa fenolik, setelah itu dilakukan penambahan larutan natrium hidroksida atau larutan natrium karbonat untuk membentuk suasana basa. Selama reaksi berlangsung, gugus hidroksil pada senyawa fenolik akan bereaksi dengan pereaksi Folin Ciocalteu, membentuk kompleks molibdenum-tungsten berwarna biru dengan struktur yang belum diketahui dan dapat dideteksi dengan spektrofotometer. Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat, setara dengan konsentrasi ion fenolak yang terbentuk yang artinya bahwa semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolak yang akan mereduksi asam heteropoli fosfotungstik (WO42)-fosfomolibdat (MoO42-2) menjadi senyawa kompleks molybdenum tungsten sehingga warna yang dihasilkan semakin pekat.
20
Intensitas warna yang terbentuk kemudian dikuantifikasi berdasarkan absorbansi dengan spektrofotometer (Xu and Howard, 2012).
Gambar 6. Reaksi Fenol dengan pereaksi Folin- Ciocalteu (Xu and Howard, 2012).
F. Penentuan Flavonoid Total
Flavonoid adalah senyawa fenol alam yang terdapat dalam hampir semua tumbuhan. Sejumlah tanaman obat yang mengandung flavonoid telah dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan, antibakteri, antivirus, antiradang, antialergi, dan antikanker. Efek antioksidan senyawa ini disebabkan oleh penangkapan radikal bebas melalui donor atom hidrogen dari gugus hidroksil flavonoid. Flavonoid termasuk dalam golongan senyawa phenolik dengan struktur kimia C6-C3-C6. Kerangka flavonoid terdiri atas satu cincin aromatik A, satu cincin aromatik B, dan cincin tengah berupa heterosiklik yang mengandung oksigen dan bentuk teroksidasi cincin ini dijadikan dasar pembagian flavonoid ke dalam sub-sub kelompoknya. Sistem penomoran digunakan untuk membedakan posisi karbon di sekitar molekulnya (Cook and Samman,1996).
21
Flavonoid berperan sebagai antioksidan dengan cara mendonasikan atom hidrogennya atau melalui kemampuannya mengkelat logam, berada dalam bentuk glukosida (mengandung rantai samping glukosa) atau dalam bentuk bebas yang disebut aglikon (Redha, 2010).
Gambar 7. Kerangka C6 – C3 – C6 Flavonoid
Metode yang umum digunakan untuk menentukan kadar flavonoid antara lain kromatografi gas, spektrometri massa, kromatografi lapis tipis, metode kolorimetrik, spektrofotometri ultraviolet, kromatografi cair kinerja tinggi, dan elektroforesis kapiler namun metode-metode tersebut membutuhkan tahapan analisis yang panjang dan waktu analisis yang cukup lama. Penentuan flavonoid total dalam ekstrak dilakukan untuk mengetahui prosentase kandungan flavonoid total menggunakan metode kolorimetri aluminium klorida dengan pengukuran absorbansi secara spektrofotometri. Pada metode ini, reaksi antara AlCl3dan gugus keto C-4 dan gugus hidroksil C-3 atau C-5 dari 3 flavon dan flavonol akan menghasilkan senyawa kompleks absorbans dari warna yang terbentuk diukur dengan spektrometer UV. Senyawa yang digunakan sebagai standar pada penetapan kadar flavonoid ini adalah kuersetin yang
22
merupakan flavonoid golongan flavonol yang memiliki gugus keto pada atom C-4 dan juga gugus hidroksil pada atom C-3 dan C-5 yang bertetangga. Kadar kuersetin dihitung sebagai kadar ekivalen flavonoid total dalam sampel. Penambahan natrium asetat pada metode ini adalah untuk mendeteksi adanya gugus 7-hidroksil sedangkan perlakuan inkubasi selama 30 menit yang dilakukan sebelum pengukuran dimaksudkan agar reaksi berjalan sempurna sehingga memberikan intensitas warna yang maksimal. Perhitungan kadar berdasarkan pada hukum Lambert- Beer yang menunjukkan hubungan lurus antara absorbans dan kadar analat (Chang et al. 2002).
Gambar 8. Pembentukan senyawa kompleks quersetin-aluminium klorida
Na asetat
23
G. Metode HPLC
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen sampel diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
Menurut Eldin et al., (2000), HPLC dapat dikelompokkan menjadi 2 berdasarkan kepolaran fasa geraknya yaitu :
a) Fase Normal HPLC
HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm dengan panjang 120 nm-250 nm diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar seperti n-heksan. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama dibanding dengan senyawa-senyawa non polar.
Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini disebut HPLC fase normal.
b) Fase Balik HPLC
Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 (C8)
24
atau 18 (C18). Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom.
Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak melalui kolom sedangkan molekul-molekul non polar akan bergerak lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon.
Prinsip kerja instumen HPLC adalah pemisahan setiap komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya dengan penggunaan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan pada kolom HPLC jenis fasa terbalik adalah silica (RMe2SiCl) dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8 sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya : air : asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah (Eldin et al.,2000).
Dalam pengujian vitamin E dan komponen isomernya dapat dilakukan dengan menggunakan instrument HPLC fase normal dan fase balik dengan detektor UV atau detektor fluoresensi
25
Tabel 1. Karakteristik absorbansi UV dan Fluoresensi Vitamin E (Eitenmiller et al.,2008)
26
H. Kerangka Teori
Pangi
(Pangium edule Reinw)
Tempat tumbuh Cara
Pengolahan
Biji Pangi
Senyawa Antioksidan
Konsentrasi berbagai metabolit sekunder tumbuhan sangat tergantung pada tempat tumbuh dan faktor lingkungan lain yang berdampak pada jalur metabolisme tumbuhan tersebut (Ramakrishna et al., 2011)
Proses pengolahan seperti perendaman, perebusan, pengukusan, pemeraman mempengaruhi perubahan zat aktif dan aktivitas antioksidan (Xu and Chang, 2008).
Senyawa Fenolik
Senyawa Flavonoid
Senyawa antioksidan bersifat nonpolar diduga yaitu tokotrienol dan tokoferol
Senyawa antioksidan bersifat polar yang diduga sebagai glikon senyawa fenolik konjugat.
(Andarwulan et al.1999)
Senyawa fenolik secara signifikan berkonstribusi terhadap aktivitas antioksidan biji pangi (Chye et al, 2009)
Flavonoid adalah golongan senyawa polifenol yang diketahui memiliki sifat sebagai penangkap radikal bebas, penghambat enzim hidrolisis dan oksidatif, sehingga dapat bekerja sebagai
antioksidan
(Pourmourad. 2006)
27
I. Kerangka Konsep
Keterangan :
Variabel Bebas =
Variabel Kendali =
Variabel Antara =
Variabel Tergantung =
Hubungan Variabel Bebas =
Hubungan Variabel Kendali = Hubungan Variabel Antara = Hubungan Variabel Tergantung =
Keluwak (olahan etnis Bugis)
Senyawa Bioaktif
Senyawa larut n-heksan
Serbuk Pangi (Olahan etnis Toraja)
Senyawa larut etanol 70%
Aktivitas Antioksidan
Senyawa Polar Fenolik Flavonoid Senyawa Non-Polar
Vitamin E Asam-asam lemak
28
J. Hipotesis
1. Hasil olahan tradisional biji pangi yang berbeda berpengaruh terhadap kandungan senyawa fenolik total, flavonoid total dan kadar α-tokoferol 2. Hasil olahan tradisional biji pangi yang dibuat secara tradisonal etnis
Bugis dan Toraja memiliki aktivitas antioksidan yang berbeda
