Penentuan pH dan Suhu Optimum Hyalurodidase Streptococcus agalactie.

Penentuan pH dan Suhu Optimum Hyalurodidase

Streptococcus agalactie

Oleh:

Wendry Setiyadi Putranto

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS PADJADJARAN

Penentuan pH dan Suhu Optimum Hyalurodidase

Streptococcus agalactie

Oleh

:

Wendry Setiyadi Putranto, SPt.,MSi

Mengetahui:

Kepala Laboratorium

Teknologi Pengolahan Produk Peternakan Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran

Dr. Ir.Kusmajadi Suradi,MS.

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Penggolongan enzim hyaluronidase didasarkan atas sumber enzim tersebut

dihasilkan,yaitu: hyaluronat – 4 – glycanohydrolases; yang dihasilkan oleh

jaringan tubuh, tipe hyaluronate – 3 – glycanohydrolases; yang dihasilkan dari

cacing tambang dan lintah, tipe hyaluronate lyase; merupakan hyaluronidase dari

bakteri streptococcus, staphylococcus, clostridium, propionibacterium,

peptostreptococcus merupakan bakteri- bakteri gram positif yang menghasilkan

enzim tersebut. Hyaluronate lyase memotong 1,4 glycosidic linked antara

N-acetyl-β-D-glucosamine dan D-glucoronic, dan menghasilkan produk berupa

2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enepyranosyluronic acid)-D-glucose).

Hyaluronidase merupakan salah satu faktor virulensi yang dimiliki SGB

untuk melakukan invasi, sehingga informasi ilmiah tentang karakterisasi terhadap

sifat-sifat enzim tersebut sangat diperlukan. Enzim tersebut sangat merugikan

bagi kesehatan manusia sehingga dapat dilakukan kajian ilmiah untuk

menghambat aktivitasnya dengan mempelajari karakterisasi biokimianya.

Enzim memiliki karakter yang spesifik terutama dalam hal pH dan suhu.

Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui pH dan suhu dimana

1.2. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan melakukan pemurnian dan mempelajari

karakterisasi biokimia dari hyaluronidase yang dihasilkan oleh Streptokokus

Grup B (SGB) dalam penentuan pH dan suhu optimumnya.

1.3. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan

Biomedis PAU Bioteknologi IPB, Laboratorium Immunologi dan Produksi Bahan

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Streptokokus Grup B (SGB) dan Faktor Virulensinya

Streptokokus Grup B (SGB) atau Streptococcus agalactie merupakan agen

penyakit yang menyebabkan mastitis sapi atau infeksi neonatal pada manusia

seperti septicemia dan meningitis (Baker,1980). Bakteri tersebut dapat pula

menginfeksi anjing, kelinci dan merpati (Butter,et al.1967). Pada manusia

Streptococcus agalactie dapat menyebabkan kematian pada bayi (neonatal

septicemi) , peradangan selaput otak (meningitis), endocarditis (radang jantung),

peritonitis, pleuritis, dan arthritis (Wilkinson,1978).

Terdapat beberapa serotipe Streptococcus agalctie yang dibuat oleh

Lancefield (1934) yaitu: 1a, 1b, 1c, II, III, IV, V (kelompok yang memiliki

polisakarida antigen) dan R, X (kelompok yang memiliki protein antigen). Pada

setiap negara terdapat perbedaan mayoritas serotipe yang diperoleh berdasarkan

dari nama isolat didapat. Pasaribu,et al. (1985) membandingkan Streptococcus

agalactie dari manusia dan sapi perah, dan ternyata diperoleh banyak serotipe

polisakarida pada isolat manusia, sedangkan pada sapi perah diperoleh banyak

mengandung protein antigen. Berdasarkan pola hemolisisnya, Streptococcus

agalactie (SGB) termasuk kelompok β- hemolisis, yaitu dalam media agar darah

terjadi hemolisis sempurna.

Seperti halnya bakteri patogen yang lain, bakteri tersebut menghasilkan

bermacam faktor virulensi, beberapa diekspresikan dipermukaan sel yaitu kapsul

6

mencapai hasil tertinggi dibandingkan komponen sel yang lain pada saat doubling

time [td] 1.4-h. Sedangkan produksi antigen SGB tidak berubah oleh perubahan

laju pertumbuhan sel, sebaliknya untuk produksi alkaline phospatase menurun

dengan menurunnya laju pertumbuhan sel. Terdapat beberapa protein yang

diekspresikan bakteri ini dan memberikan kontribusi terhadap virulensi bakteri ,

protein tersebut adalah hyaluronidase atau yang dikenal dengan hyaluronate lyase.

Hyaluronate lyase dari Staphylococcus aureus memiliki pH optimum 7,8 dalam

bufer yang mengandung NaCl. Satu aktivitas hyaluronidase didefinisikan sebagai

jumlah enzim yang mengkatalis pelepasan 1 nmol disakarida 2- acetamido – 2 –

deoxy – 3 – ( β - D – gluco – 4 – enepyranosyluronic acid ) D – glucose dari asam

hyaluronat per menit (Pritchard,et al.1994).

Hyaluronate lyase dari Staphylococcus aureus memiliki pH optimum 7,8

dalam bufer yang mengandung NaCl. Satu aktivitas hyaluronidase didefinisikan

sebagai jumlah enzim yang mengkatalis pelepasan 1 nmol disakarida 2- acetamido

– 2 – deoxy – 3 – ( β - D – gluco – 4 – enepyranosyluronic acid ) D – glucose dari

7

Gambar. 1. Struktur ikatan hyaluronate lyase dari Streptokokus agalactie

dengan asam hyaluronat (heksa sakarida) (Mello,et al.2002).

(A) merupakan struktur komplek hyaluronate lyase dan asam hyaluronat, (B) menunjukkan perbandingan struktur hyaluronate

lyase S.agalactiae dengan S.pneumoniae, dan (C) merupakan

8

Gambar A. merupakan struktur komplek enzim substrat, terlihat tiga domain

yaitu; , the N-terminal -sheet domain ( II-domain, top), the helical domain (

-domain, middle), the C-terminal -sheet domain ( II-domain, bottom). sedangkan

gambar B merupakan perbandingan struktur hyaluronate lyase S. Agalactiae

(warna hitam) dan S. pneumoniae (warna hijau), terdapat perbedaan yaitu

penambahan N terminus ( I-domain) dan memiliki sisi katalitik yang lebih

lebar pada hyaluronate lyases S. agalactiae . Gambar C merupakan gambaran

distribusi potensial elektrostatik. Positif potensial ditunjukkan warna biru, sedang

negatif potensil warna merah. Terlihat mayoritas pada sisi katalitik memiliki

positif potensial. Hyaluronate lyase yang diekskresikan Streptococcus agalactie

menghidrolisis asam hyaluronate yang merupakan polisakarida menjadi

disakarida. Dengan menggunakan struktur kristalografi komplek hyaluronate

lyase dan asam hyaluronate dapat ditunjukkan pada resolusi 2.2 Å. Hyaluronate

memiliki dua domain yaitu -helicaldomain dan -sheet domain. (Mello,et

III. BAHAN DAN METODA

3.1. Test Agar Hyaluronidase (Christ,1989)

Uji ini bertujuan untuk menentukan isolat yang menghasilkan

hyaluronidase. Media tumbuh adalah terdiri dari 100 ml BHI ditambahkan 1 g

Nobel Agar, kemudian disteril dengan autoklaf. Selanjutnya ditambahkan 50 mg

asam hyaluronat dalam 25 ml akuades dan 1,25 g BSA, dituangkan dalam cawan.

Inkubasi selama 24 jam, 37 oC. Selanjutnya SGB diinokulasikan dalam media

tersebut dan diinkubasi selama 24 jam suhu 37 oC. Empat isolat SGB yang

digunakan merupakan koleksi dari Ibu dr.Zainatul Hayati,M.Kes.,Sp.MK.,

kemudian dilakukan penggenangan dengan asetat 2 M sebanyak 5 ml dan terlihat

zona bening disekitar koloni SGB (zona bening mengindikasikan isolat SGB

tersebut mengekskresikan hyaluronidase).

3.2. Isolasi Hyaluronidase pada Supernatan

Setelah diperoleh isolat SGB yang menghasilkan hyaluronidase maka

bakteri ditumbuhkan pada 50 ml THB , diinkubasi pada suhu 37 oC, selama

kurang lebih 5 jam (nilai absorbansi 0,8 pada λ 650 nm). Selanjutnya

diinokulasikan kembali dalam 500 ml THB (mengandung 0,2% asam hyaluronat),

dan diinkubasi semalam pada suhu 37 o_{C. Untuk mengamati pertumbuhan}

Streptokokus Grup B, dilakukan pengamatan dengan melihat nilai optical density

(λ 650 nm) selama masa inkubasi. Dilakukan pengujian pula terhadap aktivitas

10

tersebut dapat kita tentukan waktu produksi hyaluronidase dari SGB, sebagai

patokan untuk produksi selanjutnya.

Hyaluronidase diperoleh dengan memisahkan enzim dengan sel bakteri

SGB tersebut menggunakan sentrifugasi 4000 rpm, selama 15 menit , suhu 4 oC.

Supernatan merupakan enzim kasar hyaluronidase. Selanjutnya dilakukan

pengujian aktivitas hyaluronidase dan penentuan kadar protein enzim (Bradford,

1976).

3.3. Pengendapan dengan Amonium Sulfat

Pengendapan protein dengan amonium sulfat dilakukan dengan metoda

Scope (1982). Sebanyak 10 ml supernatan enzim ditambahkan amonium sulfat

dengan berbagai kadar berdasarkan kejenuhan (40%, 45%, 55%, 65%, 75%, 85%)

untuk mendapatkan kadar amonium sulfat yang optimum. Penambahan amonium

sulfat dilakukan sedikit demi sedikit dengan magnetic stirer pada suhu dingin.

Setelah semua amonium sulfat larut, didiamkan semalam pada suhu 4 o_C.

Endapan yang terbentuk dipisahkan dari supernatan dengan sentrifius 4000 rpm,

15 menit, 4 oC. Endapan ditambahkan bufer pospat pH 6,4 satu kali volume.

Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas hyaluronidase dan kadar proteinnya.

Pengandapan amonium sulfat yang menghasilkan aktivitas tertinggi pada endapan

dan aktivitas yang rendah pada supernatan digunakan sebagai patokan untuk

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN.

4.2. Perubahan pH dalam Produksi Hyaluronidase SGB

Selama masa pertumbuhan bakteri, dilakukan pula pengamatan terhadap

perubahan pH media biakan (Gb.4), terlihat bahwa selama masa pertumbuhan

SGB, pH media biakan cukup stabil yaitu berkisar pada pH 7. Sel-sel mikroba

akan tumbuh dengan baik bila berada pada media biakan yang mengandung hara

esensial pada kondisi suhu dan pH yang sesuai.

6

Gambar .2. Perkembangan pH media selama kultur.

Streptokokus Grup B mengekskresikan hyaluronidase dengan aktivitas

tertinggi adalah pada saat jam ke- 20 masa pertumbuhan bakteri tersebut (fase

logaritma pertumbuhan). Data waktu produksi tersebut dapat kita gunakan untuk

melakukan produksi enzim dalam skala yang lebih besar. Demikian pula yang

12

media cair selama semalam pada suhu 37o_{C untuk mendapatkan hyaluronidase}

dari bakteri tersebut.

4.3. Pemurnian Hyaluronidase SGB

Tabel.1. Pemurnian hyaluronidase SGB

Tahap

kemurnian Perolehan (%)

Ekstrak kasar 100 506 0,600 0,0012 1 100

(NH4)2SO4 45% 5 31,10 0,391 0,0125 10,4 65,2

4.4. Penentuan Suhu Optimum

Suhu sangat mempengaruhi laju reaksi katalitik enzim. Enzim

membutuhkan suhu tertentu untuk bekerja secara optimal. Berdasrakan data yang

diperoleh menunjukkan bahwa suhu optimum hyaluronidase tidak berbeda dengan

suhu yang diperlukan bakteri SGB untuk tumbuh secara baik. Tidak terjadi

perubahan karakter suhu optimum aktivitas hyaluronidase antara hyaluronidase

yang diisolasi dari supernatan dengan hyaluronidase hasil pengendapan amonium

13

Aktivitas hyaluronidase hasil penegendapan amonium sulfat 45% (U/ml)

Aktivitas hyaluronidase pada supernatan (U/ml)

Gambar.3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas spesifik hyaluronidase SGB

Berdasarkan data yang diperoleh, hyaluronidase SGB memiliki aktivitas

optimum pada suhu 37 oC. sedangkan dengan semakin meningkatnya suhu

aktivitas enzim tersebut akan semakin menurun dan kehilangan aktivitas pada

suhu 55 oC. Sehingga hyaluronidase SGB tidak tergolong enzim termostabil

karena enzim termostabil sejati memiliki waktu paruh pada suhu 50 oC yang jauh

lebih lama dari pada enzim termolabil (tidak tahan panas). Suhu yang terlalu

tinggi akan mempengaruhi perubahan konformasi substrat sehingga sisi reaktif

subtrat mengalami hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim dan hal ini

menyebabkan aktivitas enzim akan rendah. Tingginya suhu akan menyebabkan

rusaknya interaksi nonkovalen (ikatan hidrogen, interaksi vander waals, interaksi

hidrofobik, dan interaksi elektrostatik) yang menjaga struktur tiga dimensi enzim

14

hyaluronidase yang diisolasi dari bisa ular memiliki suhu optimum 37 o_{C dan}

kehilangan aktivitas pada suhu 60 o_C.

4.5. Penentuan pH Optimum

Enzim akan menunjukkan aktivitas yang tertinggi pada bufer pH tertentu.

Fenomena ini merupakan karakter yang khas dari enzim. Hyaluronidase yang

diisolasi dari bisa ular memiliki pH optimum 6 (Kudo,et al.2001). Sedangkan

hyaluronidase dari serum manusia memiliki pH optimum 3,7 (Afify,et al.1993).

Perubahan pH pada skala deviasi kecil dapat menyebabkan turunnya

aktivitas enzim karena dengan perubahan ionisasi gugus-gugus fungsionilnya.

Gugus ionik berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk

mengikat dan mengubah substrat menjadi produk. Pada perubahan skala deviasi

besar, perubahan pH akan mengakibatkan enzim mengalami denaturasi karena

adanya gangguan terhadap berbagai interaksi nonkovalen yang menjaga

kestabilan struktur tiga dimensi enzim (Hames,et al.2000).

Berdasarkan data pada Gambar.12, hyaluronidase SGB memiliki pH

optimum 6,4. Deviasi pH yang besar dari pH optimum mengakibatkan

terganggunya struktur tiga dimensi enzim tersebut atau enzim mengalami

15

Aktivitas hyaluronidase hasil pengendapan amonium sulfat 45% (U/ml) Aktivitas hyaluronidase pada supernatan (U/ml)

Gambar. 4. Pengaruh pH terhadap aktivitas hyaluronidase SGB

Seperti halnya dengan suhu optimum hyaluronidase, tidak terjadi

perbedaan karakter pH optimum antara hyaluronidase pada supernatan dan

V. KESIMPULAN

Hyaluronidase dari Streptokokus Grup B (SGB) merupakan enzim

ekstraseluler yang memiliki kemampuan menghidrolisis asam hyaluronat. Enzim

tersebut memiliki aktivitas yang optimum dalam bufer posfat pH 6,4 dan suhu

DAFTAR PUSTAKA

Afify.A.M.,Stern.M., G. Markus., S. Robert.1993.Purification and

Characterization of Human Serum Hyaluronidase. Archives of Biochem and Biophysics.305(2):434 – 441.

Bradford,MM.1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantitaties of protein in utilizing the principle of protein-dye binding.Anal.Biochem.72:248-254.

Baker,CJ.1980. Group B Streptococcal Infection. Adv.Intern.Med.25:475 – 501

Bergmeyer,H.U.1987.Method of Enzymatic Analysis. VCH.Vol.IV:45-49.

Butter,M.N.W and DeMoor,C.E.1967. Streotococcus agalactie as Acause of

Meningitis in the Newborn and bacteremia in Adults. Antonie van Leeuwenhoek.33;439-450.

Christ.D.1989,Untersuchungen an Streptococcus uberis unter besonder

Berucksichtigung mutmaBlicher pathogenitatsfatoren. Aus der professur fur Bakteriologie und immunologie der Justus-Universitat GiBen.33-34.

Hames BD, Hooper NM.2000, Biochemistry.The instant Notes. Ed ke-2. Hongkong: Spinger,Verlag.hlm.83-84.

Kudo.K.Anthony.T.Tu.2001. Characterization of Hyaluronidase Isolated from

Agkistrodon contortrix contortrix (Southern Copperhead) Venom. Archives

of Biochem and Biophysics.386(2):154-162.

Mello.L.V, Bert L. de Groot, Songlin Li, and Mark J. Jedrzejas. 2002.Structure

and Flexibility of Streptococcus agalactiae Hyaluronate Lyase Complex

with Its Substrate. J. Biol. Chem.277(39): 36678-36688,

Pasaribu,F.H.,C.Lammler and H.Blobel,1985. Serotyping of Bovine and Human Group B Streptococci by Coaglutination,IRCS.Med.Sci.13:14-25.

Pritchard.D.G.BoLin.Willingham.T.R,Baker.J.R,1994.Characterization of The Goup B Streptococcal Hyaluronate Lyase. Archives of Biochem and Biophysic.315 (2):431-437.

Ross RA, Lawrence C. Madoff, and Lawrence C. Paoletti.1999. Regulation of