HPLC II. Indah Solihah

(1)

HPLC II

(2)

2 HPLC-2011

Teknik Elusi



Isokratik:

- teknik elusi menggunakan komposisi fase gerak tetap (polaritas tetap) selama proses

kromatografi berlangsung



Gradien:

- teknik elusi menggunakan komposisi fase gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah) selama proses kromatografi berlangsung

(3)

3 HPLC-2011

(4)

4 HPLC-2011

Eluen=

campuran

A + B

50 % B

(5)

5 HPLC-2011

30 % B

(6)

6 HPLC-2011

Teknik Gradien

Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas, kemudian dilakukan

(7)

7 HPLC-2011

(8)

8 HPLC-2011

Normal-Phase HPLC

[ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]

 Senyawa polar:

- terelusi belakangan (t_R panjang)

- semakin non-polar fase gerak, t_R senyawa polar makin panjang

 Solven:

- campuran metilen klorid, dietileter, kloroform

 Eluent strength:

(9)

9 HPLC-2011

Reversed-Phase HPLC

 Senyawa polar:

- terelusi lebih dahulu

 Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar lebih kuat tertahan

 Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra- hidrofuran

 Eluent strength:

- dimodifikasi dengan air

(Kellner dkk., 1998)

Reversed-Phase HPLC

(10)

Detektor

Bagaimana

Memilih detektor

dan

Apa pertimbangannya

???

(11)

Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2

golongan yaitu:



detektor universal (yang mampu mendeteksi zat

secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak

bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan

detektor spektrometri massa;



detektor yang spesifik yang hanya akan

mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,

seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan

elektrokimia.

(12)

Detektor HPLC

Bulk property detector (BPD) :

- mengukur sifat solute dan fase gerak

contoh : detektor indeks bias ( RI )

 Solute property detector (SPD) :

- hanya mengukur sifat solute

- 1000 kali ≥ sensitif dibanding BPD

(13)

Syarat Detektor :

• _{Cukup sensitif}

• _{Stabilitas dan reprodusibilitas tinggi}

• _{Respon linear terhadap solut}

• Waktu respon pendek sehingga tidak

bergantung

flow rate

(kec.alir)

• _{Mudah digunakan}

(14)

Detektor UV

• Detektor ini bekerja pada λ tertentu dimana

pelarut tidak menyerap sinar pada λ tersebut

sedangkan sampel menyerap dengan kuat.

• Ada dua jenis detektor UV : detektor dengan

satu panjang gelombang (254 nm) dan detektor

dengan λ yg dapat diubah ubah antara 200-700

nm

• Detektor mempunyai jangka kepekaan yg lebar

• Detektor ini hanya bekerja jika senyawa

(15)

(16)

(17)

Detektor UV

Untuk keperluan analisis komponen utama

dalam sampel secara HPLC-UV diperlukan minimal nilai



senyawa harus ≥ 10 M-1_{. cm}-1

pada  ≥ 185 nm.

 Untuk keperluan trace analisis secara HPLC-UV diperlukan minimal nilai



senyawa harus ≥ 1000 M-1_{. cm}-1

Untuk trace analisis secara HPLC deteksi UV, senyawa dengan nilai



senyawa  100 M-1_.

(18)

(19)

UV / Visible detector

Advantages

• High sensitivity & small sample volume required

• Can be used with gradient elution

• Is relatively cheap and not sensitive to temperature

• Sensitive to large number of organic compounds

Disadvantages

• Does not work with

compounds that do not absorb light at this wavelength region

• Cannot be used with the solvents having large

absorption in the UV region

• Cannot be used for the sample components which cannot be absorbed in the UV region

(20)

(21)

Detektor PDA

• _{Mampu memberikan kumpulan kromatogram}

secara simultan pada panjang gelombang yg

berbeda dlm sekali proses (

single run

)

• _{Pada kromatogram dapat pula ditampilkan}

spektrum UV shg dpt digunakan untuk

memilih λmaks utk sistem HPLC

• Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan

ditampilkan sbg plot 3 dimensi (absorbansi,

panjang gelombang, dan waktu)

(22)

(23)

Detektor Fluoresensi

• _{Merupakan detektor yg paling peka, tetapi}

hanya dapat dipakai untuk senyawa yg bisa

berfluorisensi, karena itu kadang2 solut

diubah menjadi turunan senyawa yg

berfluorisensi sebelum dikromatografi

(24)

24 HPLC-2011

Detektor UV

vs

Fluorescen

UV

(25)

25 HPLC-2011

Luminescence

Bagaimana terjadinya fluorescensi ???

(26)

Fluorescene detection

• Compared to UV-VIS detectors fluorescence detectors offer a higher sensitivity and selectivity that allows to quantify and identify compounds and impurities in complex matrices to extremely low concentration levels

(trace level analysis)

• Fluorescence detectors sense only those

substances that fluoresce

excitation

Mobile phase

emission

basic principles of HPLC - 1

(27)

Detektor Indeks Bias

• _{Indeks bias solut dan pelarut harus berbeda}

• Detektor mengukur perbedaan antara indeks

bias pelarut murni dan indeks bias pelarut yg

keluar dari kolom, perbedaan ini disebabkan

oleh adanya solut.

• Detektor ini tidak dapat dipakai untuk elusi

bergradien karena indeks bias sistem berubah

selama kromatografi

(28)

Refractive index (RI) detection

• The ability of a compound or solvent to deflect light provides a way to detect it

• The RI is a measure of

molecule’s ability to deflect light in a flowing mobile phase in a flow cell relative to a static mobile phase contained in a reference flow cell

• The amount of deflection is proportional to concentration

• The RI detector is considered to be a universal detector but it is not very sensitive

(29)

Detektor Elektrokimia

• _{Detektor ini menggunakan sifat redoks solut}

untuk mengukur kehadiran solut tersebut.

• Memiliki kepekaan yg tinggi

• _{Fase gerak harus polar dan mengandung}

(30)

Detektor Spektrometri Massa

• _{Untuk identifikasi senyawa murni}

• _{GC-MS : terjadi pola fragmentasi}

• _{LC-MS : tdk terjadi pola fragmentasi}

• Data berupa berat molekul, terkadang

(31)

HPLC-2011 31

Derivatisasi

Apa arti derivatisasi …

?

Apa tujuannya …

?

Bagaimana caranya …

?

(32)

32 HPLC-2011

Tujuan Derivatisasi

Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa dengan pereaksi (agen) penderivat untuk menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs

Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa non-kromofor  senyawa berkromofor)

Meningkatkan daya deteksinya (senyawa

berkromofor UV  senyawa berkromofor

(33)

Syarat reaksi derivatisasi

1. Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap

baik sinar UV-Vis atau membentuk senyawa

berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan

spektrofluorometri;

2. Proses derivatisasi harus cepat dan

menghasilkan produk yang sebesar mungkin

(100 %);

3. Produk hasil derivatisasi harus stabil selama

proses derivatisasi dan deteksi;

4. Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak

menganggu pemisahan kromatografi.

(34)

34 HPLC-2011

Captopril

N

HS

COOH

CH

₃

O

Dapatkah Captopril dianalisis secara HPLC dengan detektor UV ?

(35)

35 HPLC-2011

Derivatisasi dg

p

-Br fenacylbromide

E t i l a m i n Captopril p -Br fenacylbromide N HS COOH CH₃ O C-CH₂-Br Br O +

(36)

36 HPLC-2011

Hasil derivatisasi :

Captopril +

p

-Br Fenacylbromide

N HS CH₃ O Br O O C-O-CH₂-C

(37)

37 HPLC-2011

Gabapentin

C

OH

O

H

₂

N

Dapatkah Gabapentin dianalisis secara HPLC dengan detektor UV atau Fluorescen ?

(38)

HPLC-2011 38

Derivatisasi

dg

Dansilklorid

Fluorescent derivative + R-NH₂ O=S=O Cl N CH₃ H₃C - HCl O=S=O NH N CH₃ H₃C R Dansil klorid

(39)

Contoh Senyawa

Asli

Yang

(40)

40 HPLC-2011

(41)

41 HPLC-2011

(42)

Asam Salisilat

C

O

H

(43)

As.Salisilat - Fluorescensi

C

O

H

(44)

Papaverin HCl

N CH₂ OCH₃ OCH₃ H₃CO H₃CO _.HCl

(45)

Riboflavin

N

NH

N

_O

OH OH OH

CH

₂

-CH-CH-CH-CH

₂

OH

O

H

₃

C

H

₃

C

(46)

(47)

47 HPLC-2011

Bentuk Kromatogram

Bentuk kromatogram (peak) ada berma-

cam-macam, a.l:

- tailing, fronting (leading) - asimetri, simetri

- pecah - lainnya

(48)

HPLC-2011 48

Peak asymmetry - tailing

(49)

HPLC-2011 49

Peak Asymmetry vs Tailing

Baca:

Snyder dkk., 1997

(50)

HPLC-2011 50

(51)

51 HPLC-2011

Pengatasan Peak Tailing

Tambahkan 30 mM:

- Trietilamin (utk seny. basa)

- Amonium asetat (utk seny. asam)

 Bila Tailing masih tetap ada, gantilah trietil- amin dengan:

10 mM dimetiloktilamin atau dimetiloktil- amin asetat

 Kurangi jumlah sampel hingga < 1 g

Bagaimana mekanisme kerja TEA mencegah tailing ?

(52)

52 HPLC-2011

Tailing Senyawa Basa

Pada RP-HPLC, residu silanol [ Si-OH ] dalam kolom yang bersifat asam, akan berikatan kuat dengan senyawa basa [ R-NH₂ ] yang melewati kolom tersebut.

Agar tidak terjadi tailing, ditambahkan amin modifier ke dalam campuran fase gerak, misal: trietilamin [ TEA ].

TEA akan me-

masking

residu Si-OH, sehingga saat senyawa basa melewati kolom tidak terjadi ikatan yang terlalu kuat, hingga akhirnya dapat

(53)

53 HPLC-2011

Penggunaan TEA

Perhatikan jumlahnya, jangan terlalu banyak. Bila terlalu banyak akan menghilangkan fungsi residu silanol pada kolom RP-18.

Untuk hal tersebut, lakukan optimasi !

Perhatikan:

pencucian kolom sesudah digunakan pemisahan dengan