High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Indah Solihah

(1)

High Performance Liquid

Chromatography (HPLC)

(2)

HPLC

Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase)

Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi dengan fase gerak (mobile phase)

Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi senya-wa dengan fase diam dan fase gerak

(3)

HPLC

Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi dengan detektor yang sesuai dan dilaporkan sebagai kromatogram

Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu

retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak

Untuk:

- analisis kualitatif digunakan informasi tR,

- analisis kuantitatif digunakan informasi luas

(4)

(5)

Kegunaan HPLC :

• Pemisahan sejumlah seny.organik, anorganik,

maupun seny.biologis

• Analisis ketidakmurnian (impurities)

• Analisis senyawa tdk mudah menguap (non volatile)

• Penentuan molekul2 netral, ionik, maupun zwitter

ion

• Isolasi dan pemurnian senyawa

• Pemisahan seny2 yg strukturnya hampir sama

• Pemisahan seny2 dlm jml sekelumit (trace

elements)

(6)

Kelebihan HPLC

• HPLC dapat dipakai untuk senyawa non volatile dan senyawa berbobot molekul tinggi.

• HPLC dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg sebagian besar non volatile.

• HPLC biasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga aman bagi senyawa yg tidak tahan panas

• Pada HPLC kemungkinan antaraksi antara fase gerak dan

analit besar sekali (mencakup antaraksi ikatan hidrogen dan reaksi ion)  proses pemisahan lebih optimal

• Fase gerak pada HPLC dapat diubah dengan mencampur pelarut dalam berbagai gradient

• Dapat digunakan untuk menganalisis beberapa senyawa sekaligus (secara simultan)

(7)

Keterbatasan HPLC

• Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali

jika HPLC dihubungkan dg spektrometer

massa

• Jika sampel yang digunakan sangat kompleks,

maka resolusi (pemisahan) yg baik sulit

(8)

Tujuan Akhir HPLC

HPLC

(9)

Resolusi

• Tingkat pemisahan komponen dalam suatu

campuran dengan metode kromatografi

direfleksikan dalam kromatogram yang

dihasilkan

• Untuk hasil pemisahan yang baik,

puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah

secara sempurna dari puncak lainnya dengan

sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak

tumpang tindih

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

Komponen instrumen HPLC :

1. Wadah fase gerak

2. Sistem penghantaran fase gerak = Pompa

3. Alat utk memasukkan sampel

4. Kolom

5. Detektor

6. Wadah penampung buangan fase gerak

7. Tabung penghubung

(15)

(16)

Wadah Fase gerak

• Wadah fase gerak harus bersih dan lembam

(inert).

• Contoh wadah fase gerak yg biasa digunakan

mis.wadah pelarut kosong atau labu

laboratorium dg kapasitas 1-2L

(17)

Fase gerak

• Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.

• Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.

• Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.

• Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

(18)

18 HPLC-2011

Normal-Phase HPLC

[ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]



Senyawa polar:

- terelusi belakangan (t

_R

panjang)

- semakin non-polar fase gerak,

t

_R

senyawa polar makin panjang



Solven:

- campuran metilen klorid, dietileter, kloroform



Eluent strength:

(19)

19 HPLC-2011

Reversed-Phase HPLC



Senyawa polar:

- terelusi lebih dahulu



Semakin polar fase gerak

, senyawa non-polar

lebih kuat tertahan



Solvent:

Campuran metanol, asetonitril, tetra-

hidrofuran



Eluent strength:

- dimodifikasi dengan air

(Kellner dkk., 1998)

Reversed-Phase HPLC

(20)

Kriteria pemilihan fase gerak

• Viskositas rendah

• Transparansi terhadap UV; jika detektor UV yg

digunakan

• Perbedaan indeks bias antara fase gerak dg

sampel harus besar; jika digunakan detektor

indeks bias

• Titik didih rendah

• Kemurnian tinggi

• Inert

• Tidak toksis

• Harga

(21)

Pelarut UV cut off (nm) n-heksana 195 Sikloheksana 200 Tetraklorometan 265 Metilbenzen 285 Triklorometan 245 Diklorometan 230 Tetrahidrofuran 212 Propanon 330 Asetonitril 190 Iso-propanol 205 Etanol 205 Metanol 205 Asam etanoat 255 Air 170

Sem

aki

n

Pol

ar

(22)

• Fase gerak yang paling sering digunakan untuk

pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran

larutan bufer dengan metanol atau campuran air

dengan asetonitril.

• Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak

yang paling sering digunakan adalah campuran

pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang

terklorinasi atau menggunakan pelarut-pelarut

jenis alkohol, dietileter, atau kloroform.

• Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum

dibanding dengan fase terbalik.

• Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik atau

dengan cara bergradien (komposisi fase gerak

berubah-ubah selama elusi)

(23)

Catatan

• Fase gerak sebelum digunakan harus

dilakukan degassing (penghilangan gas)

• Pelarut yg digunakan harus dg kemurnian

(24)

Pompa

• Syarat Pompa HPLC: inert terhadap fase gerak.

• Bahan yang umum dipakai adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam.

• Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, 20 mL/menit.

• Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.

• Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. • Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini

lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

(25)

Alat untuk memasukkan sampel

• Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan

secara langsung ke dalam fase gerak yang

mengalir di bawah tekanan menuju kolom

menggunakan alat penyuntik yang terbuat

dari tembaga tahan karat dan katup teflon

yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample

loop) internal atau eksternal.

(26)

(27)

(28)

Parameter Kolom Konvensional Kolom Mikrobor Tabung Kolom Stanless steel P = 3,10,15,20, dan 25 cm o.d = 0,25 inci i.d = 4,6mm Stanless steel P = 25 dan 50 cm o.d = 0,25 inci i.d = 1 atau 2 mm

Tek. Operasional 500-3000 psi (35-215 bar) 1000-5000 psi (70-350 bar)

Fase Gerak

NP : hidrokarbon+pelarut2 terklorinasi atau alkohol .

RP : metanol atau asetonitril + air atau buffer

Kec.Alir : 1-3mL/menit

NP : hidrokarbon+pelarut2 terklorinasi atau alkohol .

RP : metanol atau asetonitril + air atau buffer

Kec.Alir : 10-100µL/menit

Modifikasi Instrumen :

Aliran < 10µL/menit. Katup injeksi sampel dan sel detektor bervolume kecil

Kinerja

Efisiensi meningkat dg

berkurangnya uk.partikel fase diam, akan tetapi umur kolom dg ukuran partikel 3µm lbh pendek

Sangat efisien dan sensitif, akan tetapi lambat.

Konsumsi fase gerak hanya ¼ dari kolom konvensional

(29)

Kolom

• Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

• Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

(30)

• Dalam prakteknya, kolom mikrobor tidak

setahan kolom kovensional dan kurang

bermanfaat untuk analisis rutin

(31)

Bagaimana memilih kolom???



Untuk memilih kolom (fase diam),

perhatikan beberapa sifat senyawa seperti:

- kelarutan

- kepolaran



Dengan memperhatikan sifat-sifat tersebut,

kolom dapat dipilih dengan petunjuk berikut

ini

(32)

(33)

(34)

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

Kolom

• Performance kolom menurun seiring

dengan lamanya waktu penggunaan,

yang ditandai dengan peningkatan

“backpressure” dan lebar puncak

kromatogram

(42)

Pengoperasian Kolom

Untuk kolom “Reversed-Phase” [C8, C18, fenil,

dll], gunakan petunjuk berikut:

- simpan kolom dalam asetonitril atau metanol atau campuran air dan pelarut organik

- jangan mengoperasikan kolom melebihi pH yang diperbolehkan (untuk kolom berbasis silika, disarankan pH 2,5 – 8).

pH > 8  silika terlarut

(43)

Pengoperasian Kolom

Selalu

flush

(aliri) kolom dengan pelarut

kuat (

strong solvent

) seperti metanol

sebelum digunakan untuk mengeliminasi

setiap analit yang tertahan kuat

Jangan pernah biarkan komponen bufer

tertinggal dalam pompa atau kolom,

karena

komponen

bufer

dapat

mengendap dan menimbulkan kerusakan

(44)

Pencucian Kolom

Bersihkan kolom dengan solven yang kuat.

- Untuk kolom Reversed-phase:

gunakan campuran 96% diklorometan dan 4% metanol dengan 0,1% amonium hidroksida

- Untuk kolom Normal-phase:

gunakan metanol

Pada keadaan yang sulit:

- lakukan “back-flushing” kolom dengan kece- patan alir rendah [ bila diperbolehkan !!! ]

(45)

(46)

46 HPLC-2011

Teknik Elusi



Isokratik:

- teknik elusi menggunakan komposisi fase

gerak tetap (polaritas tetap) selama proses

kromatografi berlangsung



Gradien:

- teknik elusi menggunakan komposisi fase

gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah)

selama proses kromatografi berlangsung

(47)

47 HPLC-2011

(48)

48 HPLC-2011

Eluen=

campuran

A + B

50 % B

(49)

49 HPLC-2011

30 % B

(50)

50 HPLC-2011

Teknik Gradien

Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas, kemudian dilakukan

(51)

51 HPLC-2011