High Performance Liquid
Chromatography (HPLC)
HPLC
Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase)
Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi dengan fase gerak (mobile phase)
Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi senya-wa dengan fase diam dan fase gerak
HPLC
Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi dengan detektor yang sesuai dan dilaporkan sebagai kromatogram
Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu
retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak
Untuk:
- analisis kualitatif digunakan informasi tR,
- analisis kuantitatif digunakan informasi luas
Kegunaan HPLC :
• Pemisahan sejumlah seny.organik, anorganik,
maupun seny.biologis
• Analisis ketidakmurnian (impurities)
• Analisis senyawa tdk mudah menguap (non volatile)
• Penentuan molekul2 netral, ionik, maupun zwitter
ion
• Isolasi dan pemurnian senyawa
• Pemisahan seny2 yg strukturnya hampir sama
• Pemisahan seny2 dlm jml sekelumit (trace
elements)
Kelebihan HPLC
• HPLC dapat dipakai untuk senyawa non volatile dan senyawa berbobot molekul tinggi.
• HPLC dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg sebagian besar non volatile.
• HPLC biasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga aman bagi senyawa yg tidak tahan panas
• Pada HPLC kemungkinan antaraksi antara fase gerak dan
linarut besar sekali (mencakup antaraksi ikatan hidrogen dan reaksi ion) proses pemisahan lebih optimal
• Fase gerak pada HPLC dapat diubah dengan mencampur pelarut dalam berbagai gradient
• Dapat digunakan untuk menganalisis beberapa senyawa sekaligus (secara simultan)
Keterbatasan HPLC
• Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali
jika HPLC dihubungkan dg spektrometer
massa
• Jika sampel yang digunakan sangat kompleks,
maka resolusi (pemisahan) yg baik sulit
Tujuan Akhir HPLC
HPLC
Resolusi
• Tingkat pemisahan komponen dalam suatu
campuran dengan metode kromatografi
direfleksikan dalam kromatogram yang
dihasilkan
• Untuk hasil pemisahan yang baik,
puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah
secara sempurna dari puncak lainnya dengan
sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak
tumpang tindih
Komponen instrumen HPLC :
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran fase gerak = Pompa
3. Alat utk memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Wadah penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
Wadah Fase gerak
• Wadah fase gerak harus bersih dan lembam
(inert).
• Contoh wadah fase gerak yg biasa digunakan
mis.wadah pelarut kosong atau labu
laboratorium dg kapasitas 1-2L
Fase gerak
• Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
• Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
• Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
• Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Kriteria pemilihan fase gerak
• Viskositas rendah
• Transparansi terhadap UV; jika detektor UV yg
digunakan
• Perbedaan indeks bias antara fase gerak dg
sampel harus besar; jika digunakan detektor
indeks bias
• Titik didih rendah
• Kemurnian tinggi
• Inert
• Tidak toksis
• Harga
Pelarut UV cut off (nm) n-heksana 195 Sikloheksana 200 Tetraklorometan 265 Metilbenzen 285 Triklorometan 245 Diklorometan 230 Tetrahidrofuran 212 Propanon 330 Asetonitril 190 Iso-propanol 205 Etanol 205 Metanol 205 Asam etanoat 255 Air 170
Sem
aki
n
Pol
ar
• Fase gerak yang paling sering digunakan untuk
pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air
dengan asetonitril.
• Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak
yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorinasi atau menggunakan pelarut-pelarut
jenis alkohol.
• Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum
dibanding dengan fase terbalik.
• Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi)
Catatan
• Fase gerak sebelum digunakan harus
dilakukan degassing (penghilangan gas)
• Pelarut yg digunakan harus dg kemurnian
Pompa
• Syarat Pompa HPLC: inert terhadap fase gerak.
• Bahan yang umum dipakai adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam.
• Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, 20 mL/menit.
• Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
• Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. • Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Alat untuk memasukkan sampel
• Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan
secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom
menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon
yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample
loop) internal atau eksternal.
Kolom
• Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
• Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Parameter Kolom Konvensional Kolom Mikrobor Tabung Kolom Stanless steel P = 3,10,15,20, dan 25 cm o.d = 0,25 inci i.d = 4,6mm Stanless steel P = 25 dan 50 cm o.d = 0,25 inci i.d = 1 atau 2 mm
Tek. Operasional 500-3000 psi (35-215 bar) 1000-5000 psi (70-350 bar)
Fase Gerak
NP : hidrokarbon+pelarut2 terklorinasi atau alkohol .
RP : metanol atau asetonitril + air atau buffer
Kec.Alir : 1-3mL/menit
NP : hidrokarbon+pelarut2 terklorinasi atau alkohol .
RP : metanol atau asetonitril + air atau buffer
Kec.Alir : 10-100µL/menit Modifikasi Instrumen :
Aliran < 10µL/menit. Katup injeksi sampel dan sel detektor bervolume kecil
Kinerja
Efisiensi meningkat dg
berkurangnya uk.partikel fase diam, akan tetapi umur kolom dg ukuran partikel 3µm lbh pendek
Sangat efisien dan sensitif, akan tetapi lambat.
Konsumsi fase gerak hanya ¼ dari kolom konvensional
• Dalam prakteknya, kolom mikrobor tidak
setahan kolom kovensional dan kurang
bermanfaat untuk analisis rutin
Bagaimana memilih kolom???
Untuk memilih kolom (fase diam),
perhatikan beberapa sifat senyawa seperti:
- kelarutan
- kepolaran
Dengan memperhatikan sifat-sifat tersebut,
kolom dapat dipilih dengan petunjuk berikut
ini
Kolom
• Performance kolom menurun seiring
dengan lamanya waktu penggunaan,
yang ditandai dengan peningkatan
“backpressure” dan lebar puncak
Pengoperasian Kolom
Untuk kolom “Reversed-Phase” [C8, C18, fenil,
dll], gunakan petunjuk berikut:
- simpan kolom dalam asetonitril atau metanol atau campuran air dan pelarut organik
- jangan mengoperasikan kolom melebihi pH yang diperbolehkan (untuk kolom berbasis silika, disarankan pH 2,5 – 8).
pH > 8 silika terlarut
Pengoperasian Kolom
Selalu
flush
(aliri) kolom dengan pelarut
kuat (
strong solvent
) seperti metanol
sebelum digunakan untuk mengeliminasi
setiap analit yang tertahan kuat
Jangan pernah biarkan komponen bufer
tertinggal dalam pompa atau kolom,
karena
komponen
bufer
dapat
Pencucian Kolom
Bersihkan kolom dengan solven yang kuat.
- Untuk kolom Reversed-phase:
gunakan campuran 96% diklorometan dan 4% metanol dengan 0,1% amonium hidroksida
- Untuk kolom Normal-phase:
gunakan metanol
Pada keadaan yang sulit:
- lakukan “back-flushing” kolom dengan kece- patan alir rendah [ bila diperbolehkan !!! ]
