KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
Any Guntart
POMPA
C18 D Injektor
SKEMA HPLC
Integrator Kolom analitik
Ke penampungan
Instrumen HPLC
1. Reservoir Fase Gerak
↓
Bisa lebih dari 1
↓
dari gelas / stainless steel
↓
Daya tampung 1- 2 L
Dilengkapi degasser (menghilangkan gas terlarut) → gas NO2 & O2 → membuat gelembung-gelembung di
dalam kolom & detektor
↓
- Pelebaran pita analit
- Respon detektor terganggu
• Degassing → pompa vakum dihubungkan reservoir &
diaduk / dipanaskan
Solven disaring dengan kertas Millipore
Pemisahan dengan 1 jenis FG dengan konsentrasi konstan
→ Elusi Isokratk
Bila dengan 1 atau lebih FG yang polaritasnya berbeda → Elusi Gradien
Digunakan FG segar → mendapatkan hasil yang reprodusibilitas optmum dalam pemisahan
2. Pompa
Tekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi) Kec. Alir 1-3ml/menit
Bahan harus resisten secara kimiawi Ex : dari teflon & stainless steel
Tidak ada pulsa getaran Kontnyu
3. Peredam Pulsa Fase Gerak
Ada beberapa detektor sensitve terhadap variasi kec. Alir FG → ex : index refraksi,
elektrokimia & konduktometer
Peredam aliran dengan gas yang ditekan
4. Sistem Injeksi Sampel
Menentukan presisi perhitungan → reprodusibilitas sampel
Sampel dimasukkan dengan tekanan tnggi → merupakan pita dengan sampel tpis → pelebaran diperkecil
Konvensional atau automatk
Injektor Automatk
5. Kolom Kromatograf
Bentuk tabung, permukaan dalam rata Dari gelas / stainless steel
Lapisan luar kadang dilapisi logam → menahan tekanan ad 6000 psi, rx kimia dari FG
Sambungan kolom → tdak menyebabkan FG stagnant
Panjang kolom (10 – 30) cm
Analisis pemisahan cepat (3 – 8) cm Internal diameter (4 – 5)mm
Partkel diameter (3 – 5) µm
Guard kolom → sebelum kolom analitk
Kolom dari stainless steel
6. Detektor
Pemilihan didasarkan pada problem pemisahan
↓
Harus sensitf (menghindari pelebaran)
Ada 2 macam :
1. Berdasarkan sifat umum larutan
Refraktf indeks → control temperatur Kurang sensitve
2 . Berdasarkan sifat solut/analit/sampel UV – Vis
Fluorescence Elektrokimia
↓
Sinyal analit yang berbeda dari FG ↓
Lebih sensitf (µg – ng) ↓
Dikembangkan dengan derivatsasi pre & post kolom
Derivatsasi/modivikasi Instrumen HPLC
17
1.50 0.506
Fase gerak
pereaksi Pompa
sampel
kolom
Pompa pereaksi
kapiler bentuk koil
Detektor
penampung tempat injeksi
Alur sampel ke Detektor
7.Interpretasi output dari Detektor/integrator
• Direkam berupa rangkaian puncak-puncak
• Puncak untuk data kualitatf dan kuanttatf
Profil kromatogram
Dalam gambar, area di bawah puncak Y < dibanding dengan area dibawah puncak X. Hal ini mungkin disebabkan :
a.Karena Y lebih sedikit dari X
b.Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih
sedikit dibanding dengan X.
Rangkaian HPLC pada spektrometer massa
Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewat detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui.
Ini berart bahwa identfikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.
Fase Normal HPLC
• Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom
sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm panjang 150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar
dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
Fase Balik/Reverse Phase HPLC
Silika dimodifikasi menjadi non polar berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol
sepert metanol.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan
bereaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.
Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.
Hasil Analisis dengan menggunakan HPLC
