High
Performance Liquid
Cromotograp hy
(HPLC)
KELOMPOK 4
Dosen Pengampu : Diah Kartika Putri, M.Farm
OUR MEMBER
Elen Septiana (200106141)
Regita Sofanara (200106143)
Iga Mawarni (200106144)
Deajeng Galuh Guritno (200106145)
Zakiyah Khoirunisa (200106146)
Ajeng Dinasti (200106147) Nabili Eka Putri (200106150)
Fitria Wulandari
(200106151)
Definisi
Kromatografi
0 1
TABLE OF CONTEKS
0 2
Definisi Dan Sejarah HPLC
0 3
Prinsip Kerja Dan Penggunaan HPLC
0 4 0 5
Jenis - Jenis Kromatogr
afi Kolom
0
6 Derivatisasi HPLC Instrumentasi
HPLC
0
Kekurangan 7
Dan
Kelebihan
HPLC
Kromatografi merupakan cara pemisahan yang mendasarkan partisi cuplikan (sampel) antara fasa bergerak dan fasa diam.
Berdasarkan sifat-sifat dari kedua fasa tersebut, maka kromatografi dapat dibedakan menjadi 5 sistem yaitu :
- Sistem kromatografi padat - padat - Cair - padat
- Cair - cair - Gas - padat - Gas - cair.
01. DEFINISI
KROMATOGRAFI
Pada kromatografi HPLC sistem yang digunakan adalah cair - padat, fasa bergerak (mobile phase) berupa cairan yaitu pelarut dan fasa diam (stationer phase) berupa padatan yaitu adsorban yang terdapat dalam kolom analitik.02. DEFINISI DAN SEJARAH HPLC
High Performance Liquid Chromatography (HPLC),
merupakan teknik
kromatografi cair (LC) yang digunakan untuk pemisahan berbagai komponen dalam campuran. HPLC juga digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi senyawa dalam proses pengembangan obat dan telah digunakan di seluruh dunia sejak beberapa dekade.
Definisi HPLC
HPLC adalah kependekan dari High Performance Liquid Chromatography yang diterjemahkan dalam bahasa Indonesia menjadi "KCKT"
atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
Tujuan penggunaan HPLC adalah memisahkan molekul dalam waktu minimum, sehingga penting untuk meningkatkan hasil analisis dan mengurangi waktu analisis.
Sejarah HPLC
Kromatografi berasal dari kata Yunani yaitu, chromos (warna) dan graphys (pita), sehingga kromatografi dapat diartikan
sebagai pemisahan
berdasarkan pada pita-pita warna dari sampel (bahan kimia) yang dipisahkan.
Menurut Deyl . (1975) dalam bukunya "Liquid Colum Chromatography"
menyebutkan bahwa teknik kromatografi ini pertama kalinya dikembangkan oleh Tswett's (1903-1906) pada pemisahan warna pigmen dari daun. Pada tahun-tahun berikutnya pengembangan tehnik kromatografi terus berlanjut.
Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha
dilakukan untuk
pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. .
03. PRINSIP KERJA DAN PENGGUNAAN HPLC
HPLC merupakan jenis dari kromatografi kolom dan bekerja dengan prinsip yang sama. Prinsip utama dari kromatografi kolom adalah adanya adsorbsi (penempelan permukaan) dari solut (cairan sampel) ke dalam larutan melalui fase diam yang menyebabkan adanya pemisahan solut dengan larutan. Tingkat adsorbsi tergantung pada afinitas dari fase diam dan fase gerak. Fase diam terdiri dari adsorben seperti silika.
PRINSIP KERJA
HPLC dapat digunakan untuk menguji sampel makanan dan minuman seperti beberapa zat aditif (pewarna, pengawet, perasa dan lain-lain), obat- obatan, pewarna tekstil, pestisida, lemakbabi, protein, vitamin, karbohidrat, gula, cafein, plasma dan sebagainya.
PENGGUNAAN HPLC
Conntoh bahan makanan yang dapat dianalisis
menggunakan HPLC
04. Instrumentasi HPLC
Pada HPLC, pompa berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Tujuan penggunaan pompa
adalah untuk
menjaminproses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebasdari gangguan.
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, injektor, kolom, dan detektor
2. Pompa 1. Wadah Fase Gerak
dan Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).
Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yangsecara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Injektor berfungsi untuk memasukkan sampel cairan ke dalam aliran aliran fase gerak. Syarat dari injektor yaitu dapat memasukkan contoh ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin untuk menghindari pelebaran puncak, mudah digunakan, keberulangan tinggi, dan dapat bekerja meskipun ada tekanan balik tinggi.
3. Injektor
4. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponen.
Setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector
5. Detector
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:
• detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa
• Golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yangsangat kecil.
Stabil dalam pengopersiannya.
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yangluas (kisaran dinamis linier).
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai
berikut:
SKEMA
INSTRUMENTASI HPLC
05. JENIS – JENIS
KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi Adsorbsi
Kromatografi Partisi
Kromatografi Penukaran Ion
Kromatografi Pasangan Ion
Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi Afinitas
Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Senyawa yang dianalisa terbawa oleh fase gerak terikat karena adanya interaksi dipol - dipol dengan permukaan fase diam yang bersifat padat. Pemisahan terjadi karena setiap senyawa mempunyai kekuatan dipol yang berbeda sehingga molekul yang berbeda akan mempunyai waktu tinggal yang berbeda pula.
Kromatografi jenis ini menggunakan fase diam cair yang dilapiskan pada bahan pendukung padat (polimer / silika) sedangkan fase geraknya dapat berupa cair (liquid liquid chromatografi) ataupun gas (gas liquid chromatografi). Prinsip kerja dari kromatografi partisi adalah perbedaan kelarutan senyawa yang dianalisa dalam fase gerak dan fase diam.
Kromatografi
Partisi
Seperti namanya kromatografi ini didasarkan adanya interaksi ion anatar ion yang berada dalam fase gerak dengan ion yang berada dalam fase diam. Ion - ion tersebut akan mempunyai waktu tinggal yang berbeda di dalam kolom karena perbedaan kekuatan daya tarik.
Fase diam yang digunakan dalam kromatografi jenis ini umumnya adalah bahan pendukung silika gel / resin penukar ion yang dilapis dengan bahan yang bersifat ionik baik dengan gugus fungsional asam maupun basa.
Kromatografi Pertukaran Ion
Kromatografi Pasangan Ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik danmengatasi masalah- masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionikditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan
Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton.Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam.
Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu,kemudian molekul- molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil.
Kromatografi Afinitas
Pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangatspesifik. Fase diam mengandung gugus- gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yangsesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuranyang sangat kompleks
Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika kimia suatu analit. tujuan utama penggunaan derivatisasi pada kckt adalah
untuk meningkatkan deteksi mengubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak
kromatografi yang lebih baik, mengubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik dan menstabilkan analitik
yang sensitif. Detektor yang paling banyak digunakan adalah detektor UV-vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromover yang akan
menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu
06. DERIVATISASI
HPLC
0 1
Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap
baik sinar
ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa
berfluoresen
sehingga dapat dideteksi dengan detektor uv-vis atau detektor fluoresens
Produk hasil derivatisasi harus stabil selama
proses
derivatisasi dan deteksi
Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak mengganggu pemisahan
kromatografi.
0 2
0 3
0 4
proses
derivatisasi harus cepat dan
menghasilka n produk yang sebesar mungkin
(100%).
SYARAT DERIVAT
HPLC
07. KEKURANGAN DAN KELEBIHAN HPLC Kekuran
gan
Kelebiha n
mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran
kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
dapat dihindari terjadinya
dekomposisi /kerusakan bahan yang dianalisis
Resolusi yang baik
dapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali mudah melakukan "sample recovery"
Kekurangan HPLC adalah membutuhkan analis/SDM khusus untuk mengoperasikan dikarenakan pengoperasian membutuhkan skill kompetensi khusus. Hal-hal berhubungan dengan HPLC juga mahalmahal seperti reagen, sparepart dan kolom.
THANKS
ANY QUESTION ?
SUMBER
