15
3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Juli 2012 sampai dengan Januari 2013. Penelitian dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat IPB, Insektarium laboratorium Entomologi, Bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Laboratorium Biodisel Balai Penelitian dan Pengembangan Kehutanan Bogor, Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Aneka Tanaman Industri (Balitri) Sukabumi dan Lembaga Biomedis Direktorat Kesehatan TNI-AD Jakarta.
Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan, adapun diagram alir proses penelitian yang dilakukan seperti pada Lampiran 3. Secara umum penelitian ini dilaksanakan dalam empat tahapan. Tahap pertama adalah persiapan bahan baku dan ekstraksi minyak biji kamandrah dengan metode pengempaan. Tahap kedua adalah melakukan standardisasi terhadap minyak biji kamandrah. Tahap ketiga adalah melakukan formulasi minyak biji kamandrah sebagai larvasida nabati. Tahap keempat adalah melakukan serangkaian uji terhadap formula larvasida yang dihasilkan.
Ekstraksi Minyak Biji Kamandrah Metode Pengempaan
Buah kamandrah disortir untuk memisahkan buah yang baik dan yang rusak. Buah dikeringkan di bawah sinar matahari selama 3 hari sampai kulit luar kering, kemudian dikupas. Selanjutnya biji digiling menggunakan hammer mill sebanyak 2 kali agar ukurannya lebih kecil (lolos 40 mesh), simplisia biji kamandrah ditimbang dan dimasukkan kedalam kantong yang terbuat dari kain berukuran 20 cm x 40 cm, kemudian dimasukkan kedalam alat pengempa yang memiliki elemen pemanas pada landasan tekan. Ekstraksi dilakukan dengan menekan tuas hidrolik secara berulang -ulang sampai dicapai tekanan piston yang diinginkan yaitu pada tekanan 10,54 MPa dengan temperatur 70 – 80 0C selama 15 menit, minyak yang dihasilkan ditampung dalam gelas piala dan disaring menggunakan kertas saring. Diagram alir proses ekstraksi minyak biji kamandrah seperti pada Lampiran 4.
Penentuan Mutu Minyak Biji Kamandrah Sebagai Larvasida Nabati
Standardisasi terhadap ekstrak minyak biji kamandrah sebagai bahan baku dari suatu produk larvasida perlu dilakukan untuk menjamin keterulangan khasiat
16
dari produk yang akan dihasilkan. Uji kualitas minyak kamandrah sebagai bahan baku larvasida nabati dilakukan dengan melakukan serangkaian uji fisiko kimia berdasarkan SNI 02-3127-1992 tentang cara uji fisiko kimia pestisida bentuk pekatan dalam minyak (Oil Concentrate,OC). Standar ini meliputi cara uji kadar air, keasaman, kebasaan, viskositas, berat jenis, asam lemak bebas. Sampel minyak kamandrah yang di uji sebanyak tiga macam yaitu minyak kamandrah hasil budidaya Balitri Sukabumi, minyak kamandrah dari tanaman tanpa budidaya di daerah Sukabumi dan Kalimantan.
Kadar Air dengan Pereaksi Karl Fischer
Penentuan kadar air contoh dilakukan dengan pereaksi Karl Fisher. Prinsip kerja penentuan kadar air metode Karl Fisher adalah contoh didispersikan dalam metanol, kemudian dititar dengan pereaksi Karl Fisher yang telah diketahui equivalen airnya (F). Prosedur kerja dilakukan dengan memipet sebanyak 20 mL metanol, dimasukkan dalam erlenmeyer 250 mL, kemudian dititrasi dengan pereaksi Karl Fisher sampai titik akhir (c mL). Contoh ditimbang sebanyak 2 g kemudian dimasukkan ke dalam labu titrasi, titrasi dilajutkan sampai titik akhir (d mL). Perhitungan kadar air dilakukan dengan rumus berikut :
F x ( c - d )
Kadar air, % b/b = x 100 Berat contoh (gram) x 1000 Keasaman
Keasaman dihitung sebagai H2SO4. Keasaman ditetapkan secara titrimetri, contoh dilarutkan dalam aseton, dititar dengan larutan NaOH. Sebanyak 10 gram contoh dimasukkan dalam erlenmeyer 250 mL, lalu ditambah dengan 25 mL aseton dan 75 mL aquades. Larutan tersebut kemudian dititrasi dengan NaOH (a mL), menggunakan indikator merah metil sampai terbentuk warna merah jambu, dilakukan titrasi blanko (b mL). Perhitungan keasaman dilakukan dengan rumus berikut :
49,004 x ( a - b ) x N
Keasaman, % b/b = x 100
Berat contoh (gram) x 1000 Viskositas
Pengukuran viskositas dilakukan dengan menggunakan viskometer Brokfild LV. Sebanyak 100 mL contoh dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian diletakkan pada spindle rotasi. Pengukuran dilakukan pada kecepatan 100 rpm hingga dicapai kestabilan pengukuran. Viskositas sampel langsung dapat diketahui dengan membaca nilai yang ditunjukkan oleh alat tersebut.
17
Berat Jenis
Bobot jenis adalah perbandingan berat dari volume sampel minyak dengan berat air pada suhu dan volume yang sama. Penentuan berat jenis dilakukan dengan cara: piknometer dibersihkan dan dikeringkan, di isi piknometer tersebut dengan aquades bersuhu 20 – 30 oC. Pengisian dilakukan sampai air dalam piknometer meluap dan tidak ada gelembung udara didalamnya. Setelah ditutup, piknometer di rendam dalam bak air yang bersuhu 20 oC dengan toleransi 0,2 oC selama 30 menit. Piknometer diangkat dari bak dan dikeringkan dengan kertas penghisap, kemudian di timbang berat piknometer dengan isinya. Contoh minyak / lemak cair yang akan ditentukan berat jenisnya, sebelumnya disaring terlebih dahulu dengan kertas saring. Hal ini bertujuan untuk membuang benda-benda asing dan kandungan air. Selanjutnya contoh minyak diperlakukan seperti langkah – langkah diatas. Berat jenis dapat dihitung dengan rumus berikut :
Berat botol dan minyak – berat botol Berat jenis pada suhu 20/20oC =
Berat air pada suhu 20oC Indeks Bias
Indeks bias berdasarkan SNI 02-3127-1992, prinsip pengukuran indeks bias adalah jika cahaya datang dan menembus dua media dengan kerapatan yang berbeda maka akan dibelokkan atau dibiaskan mendekat atau menjauh garis normal. Pengukuran indeks bias dilakukan dengan membersihkan terlebih dahulu prisma pada refraktometer menggunakan alkohol, kemudian diatas prisma tersebut diteteskan sampel menggunakan pipet tetes. Prisma dirapatkan dan diatur slidnya sehingga diperoleh garis batas yang jelas antara terang dan gelap, saklar diatur sampai garis batas berhimpit dengan titik potong dari dua garis bersilangan, kemudian dibaca indeks bias yang ditunjukkan pada alat refraktometer.
Asam Lemak Bebas
Asam lemak bebas ditetapkan secara titrimetri, contoh dilarutkan dalam bensena dan alkohol, dititar dengan larutan KOH. Asam lemak bebas dihitung sebagai KOH. Sebanyak 10 gram contoh dimasukkan dalam erlenmeyer 250 mL, kemudian ditambahkan 50 mL benzena, dikocok hingga larut. Ditambahkan 50 mL alkohol 95% netral, dipanaskan sampai mendidih (+ 10 menit) dalam penangas air sambil diaduk. Larutan ini kemudian dititrasi dengan KOH 0,1 N menggunakan indikator fenolftalein sampai terbentuk warna merah jambu yang stabil ( a mL). Asam lemak bebas dapat dihitung dengan rumus berikut :
56,1 x a x N
Asam lemak bebas, % b/b = x 100 Berat contoh (gram) x 1000
18
Analisis Kandungan Piperine Metode Spektrofotometri i) Pembuatan kurva spektrum absorpsi piperine
Larutan standar piperine dibuat dengan cara melarutkan 5 mg
piperine dengan etilena diklorida dalam labu ukur 50 mL. Dipipet 1 mL larutan standar tersebut kedalam labu ukur 25 mL kemudian dilarutkan dengan etilene diklorida sampai tanda batas, sehingga diperoleh larutan
piperine dengan konsentrasi 5 ppm. Diukur serapannya pada panjang gelombang 200 – 400 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Ditentukan panjang gelombang maksimal piperine.
ii) Pembuatan kurva kalibrasi
Standar piperine dilarutkan dalam etilena diklorida, dimasukkan dalam labu ukur untuk membuat larutan standar piperine dengan konsentrasi 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 5 ppm dan 6 ppm. Larutan standar diukur absorbannya pada λ max.
iii) Penetapan kadar piperin dalam minyak biji kamandrah.
Minyak kamandrah hasil pengempaan dihomogenkan, kemudian di timbang dengan neraca analitik. 0,5 gram sampel dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 125 mL. Labu di tutup alumunium foil untuk melindungi sampel dari cahaya. Etilena diklorida ditambahkan ke dalam labu sebanyak 50 mL, direfluks dan di aduk selama 1 jam, didinginkan pada suhu kamar, disaring kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan ditambah dengan Etilena diklorida sampai tanda batas. Absorban sampel diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ max. Kandungan piperine diperoleh dari kurva standar piperine.
Uji Efikasi Larvasida Minyak Biji Kamandrah
Sampel minyak kamandrah yang di uji sebanyak tiga macam yaitu minyak kamandrah hasil budidaya Balitri Sukabumi serta minyak kamandrah dari tanaman tanpa budidaya di daerah Sukabumi dan Kalimantan. Uji efikasi minyak biji kamandrah sebagai larvasida Ae. aegypti dilakukan untuk mengetahui konsentrasi terendah dari minyak biji kamandrah yang dapat membunuh 50% larva Ae. aegypti instar III. Uji efikasi dilakukan dengan menyiapkan larutan emulsi minyak kamandrah air dengan berbagai seri konsentrasi yaitu 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 250 ppm. Emulsi dari setiap seri konsentrasi diambil 200 mL dan dimasukkan dalam gelas plastik, kemudian dimasukkan 25 ekor larva Ae. aegypti instar III. Diulangi perlakuan ini untuk 5 ulangan. Pengamatan dilakukan setelah 24 dan 48 jam dengan menghitung banyaknya larva Ae. aegypti instar III yang mati. Untuk menentukan angka kematian 50% dan 90% (LC50 dan LC90) dilakukan dengan metode probit analisis (Finney Method) menggunakan software SPSS versi 17.
19
Formulasi Larvasida Nabati Minyak Biji Kamandrah.
Formulasi larvasida minyak kamandrah dibuat dengan cara granulasi basah menggunakan larutan amylum sebagai bahan pengikat dan laktosa sebagai bahan pengisi. Konsentrasi minyak biji kamandrah serta emulsifier yang digunakan masing-masing formula dikombinasikan, sehingga terdapat enam variasi formula larvasida. Komposisi dari masing-masing formula dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Komposisi formula larvasida nabati minyak biji kamandrah
Komposisi Rancangan Formula
F.1 F.2 F.3 F.4 F.5 F.6 Minyak Kamandrah ( gram ) 5 5 10 10 15 15
Gom Arab ( gram ) 20 - 20 - 20 -
Maltodekstrin ( gram ) - 20 - 20 - 20
Amylum ( gram ) 5 5 5 5 5 5
Laktosa ( gram ) 70 70 65 65 60 60
Persiapan formulasi dilakukan dengan mengayak terlebih dahulu semua bahan serbuk yang akan digunakan dengan menggunakan pengayak ukuran mesh 30, setelah itu bahan-bahan di timbang sesuai dengan kebutuhan. Disiapkan larutan amylum 5% sebagai bahan pengikat, dengan melarutkan amylum menggunakan aquades hingga larut. Minyak kamandrah diemulsikan dengan emulsifier (Gom Arab atau Maltodekstrin) dengan cara di aduk hingga terbetuk emulsi minyak kamandrah yang baik. Laktosa ditambahkan sebagai bahan pengisi dan di aduk hingga homogen, kemudian dimasukkan larutan amylum 5% bahan pengikat yang telah dibuat sebelumnya. Pengadukan dilanjutkan hingga di peroleh campuran yang homogen dan terbentuk massa yang basah dan dapat di kepal. Massa di ayak menggunakan pengayak dengan ukuran mesh 12, lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 40 oC selama 24 jam. Granul yang sudah kering dilakukan pengayakan kembali menggunakan ayakan dengan ukuran mesh 16, hasil ayak dengan mesh 16 ini disebut dengan granul . Diagram alir proses formulasi dapat dilihat pada Lampiran 5.
Uji Efikasi Formula sebagai Larvasida Ae. aegypti
Larvasida dilarutkan dalam air dengan berbagai seri konsentrasi. Larutan larvasida dari setiap seri konsentrasi diambil 200 ml dan dimasukkan dalam gelas plastik, kemudian dimasukkan 25 ekor larva Ae. aegypti instar III. diulangi perlakuan ini untuk 5 ulangan. Pengamatan dilakukan setelah 24 dan 48 jam dengan menghitung banyaknya larva yang mati. Untuk menentukan angka kematian 50% dan 90% (LC50 dan LC90) dilakukan dengan metode probit analisis
20
(Finney Method) menggunakan software SPSS versi 17.
Uji Stabilitas Formula Larvasida Nabati Terhadap Panas dalam Penyimpanan Terhadap Potensinya sebagai Larvasida dan Kandungan Bahan Aktifnya.
Formula yang telah ditingkatkan efektivitas dengan menurunkan nilai LC50 perlu dilakukan uji stabilitasnya bila produk ini disimpan dalam waktu yang lama. Stabilitas ini ditentukan dengan menyimpan formula larvasida nabati dalam inkubator menggunakan variasi temperatur penyimpanan dari 30 ºC, 40 ºC dan 50 ºC, pengaruh temperatur tersebut di ukur dengan menentukan kandungan bahan aktif dan efikasinya sebagai larvasida nabati.
Uji Durabilitas Formula
Uji durabilitas atau ketahanan formula perlu dilakukan untuk mengetahui ketahanan potensi dari suatu formula. Uji durabilitas formula dilakukan dengan membuat larutan formula pada konsentrasi nilai LC100, dari larutan tersebut dilakukan uji efikasi larvasida terhadap larva nyamuk Ae. aegypti instar III. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung banyaknya larva yang mati. Pengujian dilakukan setiap hari sampai didapatkan tingkat kematian larva kurang dari 80 %.
