BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian ini adalah eksperimen dengan randomisasi (Randomized Control Trial/ RCT), double blind.
B. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Unit Haemodialisis RSUD Dr. Moewardi Surakarta.
C. Populasi Sampel
1. Populasi sasaran : Pasien penyakit ginjal diabetik stadium V yang telah
melakukan Haemodialisis selama 3 bulan sampai 5 tahun. 2 Populasi sumber : Pasien penyakit ginjal diabetik stadium V yang telah
melakukan Haemodilisis selama 3 bulan sampai 5 tahun di unit Haemodialisis RSUD Dr. Moewardi Surakarta.
3. Populasi sampel : Diambil acak pada semua pasien penyakit ginjal diabetik stadium V yang telah menjalani Haemodialisis selama 3 bulan sampai 5 tahun di Unit Haemodialisis RSUD Dr. Moewardi Surakarta, memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi dan bersedia diambil darahnya untuk penelitian.
D. Besar Sampel
Penentuan besar sampel (sample size) melibatkan parameter tingkat kesalahan (error term) atau α dan tingkat kekuatan pengujian (power test) atau 1 - β.
Formulasi besar sampel dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: (Dahlan, 2009; Santjaka, 2011) 2 2 2 1 1
)
(
Z
Z
n
dimana: n : besarnya sampel.Z1-α = 1,96.
Z1-β : nilai standar normal power test, jika 1 - β = 0,90 maka:
Z1-β = 1,282.
δ : selisih yang diinginkan (difference of interest)
σ : besarnya penyimpangan (standar deviasi) yang bisa ditolerir. Karena untuk kelompok sampel berpasangan berlaku: δ2
= σ2 = 1, sehingga: 2 1 1
)
(
Z
Z
n
maka dengan kondisi diatas, penelitian ini menggunakan ukuran sampel minimal adalah:
n = (1,96 + 1,282)2 = 10,51 dibulatkan menjadi 11.
Dengan demikian sampel minimal dalam penelitian ini adalah 11 responden dalam setiap kelompok. Penelitian ini merupakan uji klinis dengan mempertimbangkan kemungkinan terjadi drop out maka ditetapkan angka drop out sebesar 10% (Sri Rejeki Harun dkk, 2011). Dengan mempertimbangkan minimal besar sampel dan drop out maka diambil sampel sebesar 15 pasien dengan penyakit ginjal kronik stadium V (n=15 pasien untuk tiap kelompok) sehingga besar sampel telah cukup memadai dan memenuhi formulasi besar sampel. Teknik pengambilan sampel dengan simple random sampling menggunakan program Open Epi versi 2.3.
Kriteria Inklusi antara lain :
1. Penderita penyakit ginjal diabetik stadium V. 2. Usia 20-59 tahun.
3. Sedang menjalani hemodialisis selama lebih dari 3 bulan dan tidak melebihi 5 tahun.
4. Penderita mendapat terapi atau tidak pada penyakit DM 5. Hb ≥ 8mg/dl
6. Bersedia menandatangani persetujuan penelitian.
Kriteria Eksklusi antara lain :
1. Pasien penyakit ginjal diabetik yang menjalani terapi insulin 2. Pasien PGK yang sedang menjalani terapi dengan steroid
3. Pasien PGK stadium V dengan keganasan 4. Pasien PGK stadium V dengan uropati obstruktif 5. Pasien dalam kondisi infeksi / sepsis
6. Pasien menderita hepatitis B dan atau C.
7. Pasien peminum alkohol, perokok, obesitas dan dalam terapi asam folat Keterangan tambahan definisi kriteria eksklusi:
1. Terapi steroid
Glukokortikoid memiliki efek anti inflamasi dan imunomodulator. Kortisol menghambat transkripsi pengkodean gen sitokin pro inflamasi dengan cara menurunkan aktivitas nuclear factor kappa (NF-кB) sebagai hasilnya, kortikosteroid akan menghambat sintesis atau aksi sebagian besar sitokin pro inflamasi (Rhen dan Cidlowski, 2005).
Meskipun efek anti inflamasi kortikosteroid terutama disebabkan oleh penekanan sintesis sitokin pro inflamasi (TNF-α, IL-1β, IL-6), sebagian efek juga disebabkan peningkatan produksi sitokin anti inflamasi seperti IL-10. Glukokortikoid menyebabkan pergeseran dari respon Th1 ke respon Th2, di mana akan terjadi peningkatan produksi IL-4, IL-10 dan IL-13 (Ramirez, 1996).
Kortikosteroid mampu memblok jalur inflamasi melalui sejumlah jalur. Antara lain kortikosteroid mampu menghambat produksi prostaglandin melalui (i) induksi dan aktivasi annexin-1, (ii) induksi MAPK fosfatase-1, dan (iii) menekan transkipsi cyclooksigenase-2. Kortikostreroid juga dapat menghambat produksi sitokin-sitokin pro inflamasi melalui penghambatan aktivasi NF-kB (Rhen dan Cidlowski, 2005; Guntur, 2010).
2. Keganasan
Inflamasi kronis telah dikaitkan dengan beberapa keganasan solid, antara lain kanker oesofagus, gaster, hepar, pankreas, ginjal, dan prostat. Mekanisme yang mungkin di mana inflamasi dapat berkontribusi terhadap karsinogenesis antara lain: (i) interaksi sitokin dan faktor pertumbuhan yang memicu pertumbuhan sel tumor, induksi cyclo-oxygenase-2 pada makrofag dan sel epitel; dan pembentukan spesies oksigen dan nitrogen reaktif mutagenik.
C-reactive protein merupakan penanda inflamasi general yang kadarnya meningkat oleh sitokin pro-inflamasi antara lain IL-6, IL-8, dan TNF-α. Kadar CRP diketahui meningkat pada keganasan (Mazhar, 2006).
3. Uropati obstruktif
Pada uropati obstruktif, didapatkan stimulasi NFκβ dan penanda stress oksidatif seperti malondialdehid (Deendoven, 2011).
4. Infeksi dan sepsis
Infeksi adalah istilah untuk menamakan keberadaan berbagai kuman yang masuk ke dalam tubuh manusia. Bila kuman berkembang biak dan menyebabkan kerusakan jaringan disebut penyakit infeksi. Pada penyakit infeksi terjadi jejas sehingga timbullah reaksi inflamasi. Pada reaksi inflamasi berbagai jenis sel akan teraktivasi dan memproduksi berbagai jenis mediator inflamasi termasuk berbagai sitokin. Termasuk sitokin pro-inflamasi adalah TNF-α, IL-1, INF-γ.
Systemic inflammatory response syndrome adalah sindroma yang ditandai oleh dua atau lebih kriteria sebagai berikut:
a. Suhu > 38 C atau < 36 C
b. Denyut jantung > 90 kali / menit
c. Respirasi > 20 kali / menit atau Pa CO2 < 32 mmHg d. Hitung leukosit > 12.000/mm3 atau > 10 % sel immatur
Sepsis adalah SIRS ditambah tempat infeksi yang diketahui (ditentukan dengan biakan positif terhadap organisme dari tempat tersebut). Berdasarkan konferensi internasional pada tahun 2001 terdapat tambahan terhadap kriteria sebelumnya. Dimana pada konferensi tersebut menambahkan beberapa kriteria baru untuk sepsis. Bagian yang terpenting adalah dengan memasukkan petanda biomolekuler yaitu procalcitonin (PCT) dan C reactive protein (CRP) sebagai langkah awal dalam diagnosa sepsis (Guntur, 2008).
5. Hepatitis viral B dan C
Pada hepar, TNF-α terlibat dalam patofisiologi hepatitis virus (Schwabe, 2006).
6. Merokok
Merokok berhubungan dengan inflamasi saluran nafas dan sistemik. Berbagai penelitian menunjukkan bahwa perokok mengalami peningkatan kadar sitokin pro-inflamasi antara lain CRP, TNF-α, dan IL-6 (Tanni, 2010). 7. Konsumsi alkohol
Keterkaitan pola-U telah dilaporkan antara asupan alkohol dan tingkat kesehatan, yang menunjukkan bahwa asupan alkohol dapat mempengaruhi kadar acute-phase reactant (Wang, 2008).
8. Obesitas
Obesitas didefinisikan dengan IMT ≥ 30 kg/m2
. Pada sebagian besar pasien obes, obesitas terkait dengan inflamasi dalam derajat rendah pada jaringan lemak putih akibat aktivasi kronis sistem imun innate. Pada obesitas, inflamasi jaringan lemak putih ditandai oleh peningkatan produksi dan sekresi sejumlah molekul inflamasi antara lain TNF-α dan IL-6 (Bastard, 2006).
Pasien yang memenuhi kriteria inklusi dan ekslusi selanjutnya dilakukan randomisasi.
. E. Tehnik Sampling
Subyek penelitian diberikan informed consent. Subyek dibagi dua kelompok dengan cara diundi memakai gulungan kertas bertuliskan angka 1-34. Satu kelompok (yang berangka genap) mendapatkan perlakuan dengan SOD, dan kelompok yang lain (berangka ganjil) mendapatkan perlakuan dengan plasebo. Kelompok yang mendapat perlakuan SOD sebelum pengobatan diambil sampel darahnya, kemudian diperiksa kadar Glicated Albumin dan hs-CRP. Kemudian selama 4 minggu menjalani pengobatan SOD 1000 mg pada kelompok perlakuan, diambil kembali sampel darahnya dan dilakukan pemeriksaan ulang. Demikian juga dengan kelompok kontrol dengan pemberian plasebo.
1.Perlakuan:
a. Kelompok uji : GLISODIN 1000mg/hari, dosis terbagi diminum antara jam 09.00- 12.00 - 18.00-21.00, selama 30 hari. b. Kelompok kontrol : Diberikan plasebo.
a. Dilakukan monitoring tiap dua minggu untuk mengetahui efek samping yang timbul dengan wawancara dan pemeriksaan fisik. Dicari adanya fatiq, mual, muntah dan kelemahan serta keluhan lain terkait efek samping pemakaian glisodin.
b. Dilakukan penghitungan jumlah obat tiap kali kontrol, dikatakan patuh bila jumlah obat yang minum 90 – 110 %.
c. Selama perlakuan, subyek akan dieksklusi bila terdapat salah satu dari berikut ini; kepatuhan minum obat <80% atau >120%, efek samping serius dari obat yang diteliti dan masuk rumah sakit.
3.Tindakan bila ada efek samping:
a. Penanganan efek samping sesuai indikasi.
b. Melaporkan kejadian tersebut ke Komisi Etik secepatnya. 4. Pengambilan darah dan penanganan spesimen:
Teknik pengambilan darah
a. Pemeriksaan kadar Glicated Albumin dan hs-CRP dilakukan sebelum dan sesudah perlakuan.
b. Darah yang akan dilakukan pemeriksaan Glicated Albumin dan hs-CRP diambil melalui vena antecubiti pada ruangan yang tenang dengan temperatur terkontrol (24 – 25 0C) pada 2 jam setelah hemodialisis.
c. Proses penanganan spesimen untuk sampel darah yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang sudah diberi kode dan dibiarkan membeku. Sampel darah yang sudah membeku dipusingkan selama 5 – 10 menit dengan kecepatan 4000 rpm.
d. Pemeriksaan glicated albumin dan hs-CRP dilakukan setelah semua sampel sebelum dan sesudah perlakuan terkumpul semua, untuk menghindari rusaknya kit, bila pemeriksaan dilakukan tidak secara bersamaan.
e. Pemprosesan darah untuk diambil plasmanya, penyimpanan plasma pada suhu – 20 0C dan pemeriksaan glicated albumin dan hs-CRP dilakukan RS.dr. Moewardi Surakarta
Sampel yang digunakan adalah whole blood. Stabilitas sampel 1 hari pada suhu 15-30 c dan 7 hari pada suhu 2-8 c, dengan metode enzim kolorimetri
6. Teknik pemeriksaan high sensitif -CRP
Prinsip pemeriksaan hs-CRP (Metode Imunochemiluminescent) : Sampel yang telah diencerkan, ligand berlabel antibodi monoclonal anti hs-CRP dimasukkan ke dalam test unit yang mengandung anti ligand, dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 C dengan sesekali pengocokan. Selama pengocokan, hs-CRP dalam sampel membentuk kompleks sandwich antibody yang berikatan dengan anti ligand pada fase padat. Konjugat yang tidak berikatan dibuang pada pencucian berputar, kemudian ditambahkan substrat dan test unit diinkubasi selama 10 menit. Substrat chemiluminescent, ester phosphate dari adamantyldioxetan, mengalami hidrolisis dengan adanya alkaline phosphatase menghasilkan emisi cahaya yang terus menerus, jadi memperbaiki presisi dengan menyediakan jendela pembacaan multipel. Ikatan kompleks dan photon yang dihasilkan, diukur dengan luminometer sebanding dengan konsentrasi hs-CRP dalam sampel.
E. Identifikasi Variabel 1. Variabel tergantung :
a. High Sensitif C Reactive Protein b. Glicated Albumin
2. Variabel bebas : SOD
F. Definisi Operasional 1. Penyakit Ginjal diabetik
adalah Salah satu komplikasi mikroangiopati diabetik pada ginjal, yang dapat berakhir pada penyakit ginjal kronik. Penyakit Ginjal diabetik didefinisikan sebagai sindrom klinis pada pasien diabetes melitus yang ditandai dengan albuminuria menetap (>300 mg/24 jam atau 200 µg/menit) pada minimal dua kali pemeriksaan dalam kurun waktu 3 sampai 6 bulan (Hendromartono, 2006).
Pada pasien, Penyakit Ginjal diabetik penanda biologis inflamasi tidak hanya berkorelasi dengan fungsi ginjal namun juga dengan albuminuria. TNF-α, IL-6, TNFR2, ICAM-1, dan protegerin meningkat seiring dengan meningkatnya rasio albumin/kreatinin urin (Upadhyay dkk., 2011).
.2. High Sensitif C Reactive Protein
Adalah protein darah yang terikat dengan C- Polisakarida, pentamer 120 kDa dan merupakan salah satu protein fase akut di mana kadarnya dalam darah meningkat pada infeksi akut sebagai respons imunitas nonspesifik. Pengukuran dilakukan secara kuantitatif dengan menggunakan metode Imunochemiluminescent di Laboratorium Prodia Surakarta. Kadar Hs-CRP normal adalah < 10 mg/L. Skala variabel : rasio.
3. Glicated Albumin adalah :
Glicated Albumin (GA), adalah albumin terglikasi yang dihitung dengan metode kolorimetri dengan prinsip highperformance liquid chromatography (HPLC), (Bio-Rad Laboratories, Inc. USA), menggunakan alat Advia 1800. Hasil dinyatakan dalam satuan %. Skala variabel : rasio.
4. SOD
Yang digunakan adalah Superoxide dismutase dengan merek dagang Glisodin peroral sehari 1000 mg dengan dosis terbagi selama 4 minggu pada kelompok perlakuan.
5. Plasebo
Adalah zat yang secara fisik menyerupai obat aktif tetapi sebetulnya tidak memiliki kandungan obat yang sesungguhnya. Dalam hal ini plasebo adalah kapsul yang menyerupai glisodin namun berisi gandum. Plasebo 2x500mg gandum.
G. Analisis Statistik
Data yang diperoleh kemudian dilakukan analisis statistik menggunakan SPSS.15 for windows. Karakteristik penelitian yang berupa variabel kualitatif, uji homogenitas dilakukan menggunakan uji Chi Square. Karakteristik penelitian yang berupa variabel kuantitatif, uji homogenitas dilakukan menggunakan uji beda 2 mean sampel independen. Uji beda dua rerata menggunakan uji parametrik (uji t) jika data variabel berdistribusi normal atau uji non parametrik (Mann-Whitney / Wilcoxon Signed Rank Test) jika data variabel berdistribusi tidak normal untuk menilai kemaknaan
perbedaan dua rerata, yaitu antara kadar glicated albumin dan hs-CRP pada pasien penyakit ginjal diabetik stadium V yang menjalani haemodialisis pasca 4 minggu pemberian glisodin 1X1000 mg dibandingkan kadar glicated albumin dan hs-CRP pada pasien penyakit ginjal diabetik stadium V pasca 4 minggu pemberian plasebo.
I. Alur Penelitian
Penderita Nefropati DM stadium V
Randomisasi
Kelompok kontrol
Sampel darah Pre Test GA dan CRP
Glisodin 2X500mg selama 8 minggu
Sampel darah Pre Test GA dan CRP
Plasebo 2x500mg selama 8 minggu
Sampel darah Post Test GA dan CRP
Sampel darah Post Test GA dan CRP
Analisis Statistik Kriteria inklusi eksklusi
Kelompok perlakuan
