BAHAN DAN METODE PENELITIAN. Objek yang digunakan adalah semen yang berasal dari lima kambing

III

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

2.1 Bahan/Objek Penelitian 2.1.1 Objek Penelitian

Objek yang digunakan adalah semen yang berasal dari lima kambing peranakan etawah (PE), berumur 2-3 tahun yang berada di breeding station Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran.

2.1.2 Alat dan Bahan Penelitian A. Alat Penelitian

1) Penampungan Semen

a. Satu set vagina buatan digunakan untuk menampung semen kambing peranakan etawah

b. Termos untuk menyimpan air panas yang digunakan untuk mengisi air pada vagina buatan

c. Thermometer untuk menghitung temperatur air yang akan digunakan 2) Evaluasi Semen

a. Mikroskop digunakan untuk mengamati semen secara mikroskopis b. Tabung reaksi sebagai tempat atau wadah bagi semen yang didapat

dari hasil penampungan

c. Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi yang digunakan d. Objek glass untuk menyimpan media yang akan diamati di mikroskop e. Cover glass untuk menutup media yang ada di objek glass

f. Pipet untuk mengambil semen atau larutan lainnya

g. Pipet haemocytometer batu merah untuk mengambil semen dengan ukuran yang jelas

h. Haemocytometer dan Kamar hitung Neubaeur untuk pengamatan konsentrasi total dan motilitas

i. Batang pengaduk untuk mengaduk campuran media

j. Pembakar Bunsen untuk mensterilkan alat dan sebagai pembakar pada preparat ulas

k. Kertas lakmus untuk mengukur pH semen 3) Pengenceran Semen

a. Kertas saring digunakan untuk menyaring bahan yang digunakan pada saat pengenceran semen

b. Timbangan analitik untuk menimbang bahan c. Alumunium foil untuk menutup tabung Erlenmeyer d. Mikro pipet untuk mengambil bahan dengan lebih akurat e. Tabung Erlenmeyer untuk menyimpan larutan

f. Gelas ukur untuk mengukur banyaknya larutan pengencer

g. Pinset steril untuk memecahkan kulit telur pada proses pembuatan pengencer

h. Beaker glass digunakan untuk pencampuran buffer dan kuning telur 4) Pembekuan Semen

a. Straw 0.25 ml sebagai tempat untuk semen beku

b. Pinset untuk memindahkan atau mengangkat straw dari N cair c. Goblet sebagai tempat menyimapan straw

d. Canister sebagai tempat menyimpan goblet

e. Container sebagai tempat menyimpan semen beku

5) Thawing

a. Termos digunakan untuk menyimpan air panas b. Thermometer untuk mengukur suhu air panas B. Bahan Penelitian

1) Penampungan Semen

a. Air hangat bersuhu 38 – 40 ˚C digunakan untuk penghangat vagina buatan

b. Vaselin digunakan untuk melicinkan area depan corong vagina buatan 2) Evaluasi Semen

a. Semen kambing Peranakan Etawah (PE) sebagai sampel penelitian b. NaCl fisiologis, NaCl 3% digunakan untuk pengamatan konsentrasi

spermatozoa dan motilitas spermatozoa

c. Pewarna eosin 2% digunakan untuk membuat preparat ulas ketika melihat abnormalitas sperma

d. Aquades untuk membersihkan peralatan yang telah digunakan 3) Pengenceran Semen

a. Semen kambing Peranakan Etawah (PE) sebagai bahan untuk diencerkan

b. Tris sebagai bahan pengencer yang terdiri dari tris, asam sitrat, fruktosa dan kuning telur

c. Natrium sitrat sebagai bahan pengencer d. Kuning telur sebagai anti coldshock e. Gliserol sebagai agen krioprotektan

f. Aquabidestilasi untuk melarutkan bahan pengencer

g. Streptomycin dan Penicillin sebagai antibiotik

4) Pembekuan Semen

a. N cair dengan suhu -196˚C digunakan untuk proses pembekuan semen

5) Thawing

a. Air panas dengan suhu 38˚C untuk pengenceran kembali atau thawing 6) Motilitas

a. Pengencer tris–sitrat digunakan untuk pengamatan motilitas spermatozoa

2.2 Metode Penelitian 2.2.1 Perlakuan Penelitian

Penelitian dilakukan dengan metode eksperimen menggunakan rancangan percobaan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 5 macam perlakuan dengan 5 kelompok , yaitu :

P1 = Semen + (Larutan pengencer Tris-Sitrat kuning telur) + Gliserol 5%

P2 = Semen + (Larutan pengencer Tris-Sitrat kuning telur) + Gliserol 6%

P3 = Semen + (Larutan pengencer Tris-Sitrat kuning telur) + Gliserol 7%

P4 = Semen + (Larutan pengencer Tris-Sitrat kuning telur) + Gliserol 8%

P5 = Semen + (Larutan pengencer Tris-Sitrat kuning telur) + Gliserol 9%

2.2.2 Prosedur Penelitian A. Penampungan Semen

1. Menyiapkan kambing pemancing (teaser) dan kambing yang akan ditampung semennya (pejantan)

2. Menyiapkan vagina buatan yang silindernya sudah diisi air panas bersuhu

38-40 ºC menggunakan thermometer

3. Mengoleskan vagina buatan dengan vaselin agar licin

4. Vagina Buatan di pegang oleh operator / penampung dengan tangan kanan, operator siap di sebelah kanan belakang pemancing.

5. Pejantan didekatkan pada pemancing hingga pejantan terangsang

6. Setelah dilakukan 2–3 kali False mount, pejantan diizinkan menaiki pemancing.

7. Operator penampung segera membelokkan arah penis ke arah mulut vagina buatan yang telah disiapkan.

8. Penis yang masuk ke dalam vagina buatan segera dilepaskan setelah terjadi hentakan keras (ejakulasi)

9. Melepaskan tabung penampung dari corong karet dan segera bagian yang terbuka ditutup dengan aluminium foil atau plastik.

10. Semen segera dibawa ke laboratorium untuk segera di evaluasi.

B. Penilaian Kualitas Semen

Penilaian kualitas semen dilakukan dengan pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis.

1. Pemeriksaan Makroskopik a. Volume Semen

Volume semen dihitung dengan melihat skala yang tertera pada tabung

penampung semen. Volume semen kambing bervariasi setiap penampungan yaitu

0,5–1,0 ml (Devendra dan Burns, 1994). Volume semen kambing PE rata-rata

0,95 ml, volume semen setiap penampungan untuk masing-masing ternak

berbeda-beda menurut bangsa, umur, ukuran ternak, dan makanan (Partodihardjo,

1992).

b. Warna Semen

Warna semen dari kambing PE rata-rata adalah putih sampai krem (Tambing dkk, 2001). Apabila terdapat kelainan warna seperti hijau itu terjadi karena adanya kontaminasi dengan feses dan merah terjadi kontaminasi dengan darah.

c. Bau Semen

Dapat diamati langsung dengan menggunakan panca indra penciuman (hidung)

d. Konsistensi atau Derajat Kekentalan

Kekentalan diamati dengan cara memiringkan tabung semen lalu ditegakan kembali, perhatikan dinding tabung semen. Apabila semen yang mengalir pada dinding lambat, maka konsistensinya tinggi (kental). Namun jika sebaliknya maka konsistensinya rendah (cair). Konsistensi yang ada pada semen kambing rata-rata memiliki konsistensi tinggi (kental) (Tambing dkk., 2001) e. pH Semen

pH semen dapat dihitung menggunakan kertas lakmus, dengan cara meneteskan semen lalu mencocokannya dengan warna pada kemasan kertas lakmus. pH rata-rata pada semen kambing PE berkisar sekitar 7,0 (Partodihardjo, 1992). Standar derajat keasaman semen kambing yang baik untuk dijadikan semen beku adalah 6,2–7,2 (Hafez, 1987)

2. Pemeriksaan Mikroskopik a. Mengamati Gerakan Massa Sperma

Gerakan massa diamati dengan melihat adanya kecenderungan bergerak

bersama-sama ke satu arah, membentuk gelombang yang tebal atau tipis, dan

bergerak cepat atau lambat. Semen hasil penampungan diteteskan sedikit ke atas

objek glass kemudian amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 × 10. Jika semen yang diamati gerakannya cepat berpindah dan berbentuk gumpalan tebal dan gelap, maka gerakan massanya bernilai (+++). Rata-rata gerakan massa sperma yang dihasilkan oleh kambing PE bernilai +++ (Tambing dkk, 2000).

Sementara jika hanya terlihat gerakan sperma saja dan tidak ada gumpalan, maka nilai gerakannya adalah (+)

b. Menghitung Konsentrasi Sperma

Penilaian konsentrasi spermatozoa bertujuan untuk menghitung jumlah spermatozoa. Perhitungan konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan menggunakan Hemocytoeter dan kamar hitung Neubaeur. Mula-mula mengisap semen dengan pipet erythrocyte yang belum di encerkan hingga tanda 0,5, lalu mengisap larutan NaCl 3 % hingga tanda 101. Mengocok pipet dengan gerakan membentuk angka delapan dengan tujuan agar sperma tercampur secara merata dan sel-selnya tidak rusak saat dilakukan pengocokan selama 2-3 menit.

Membuang beberapa tetesan pertama. Kemudian menteskan satu tetes semen pada sisi cover glass. Menghitung jumlah sel spermatozoa dalam 5 kamar dihitung menurut arah diagonal. Rata-rata konsentrasi dari sperma kambing PE adalah 2801,43±438,79 (Tambing dkk, 2000), dan sebesar 3720±100x10

⁶

spermatozoa/mL (Dorado dkk.,2010)

c. Menghitung Motilitas Sperma

Motilitas spermatozoa adalah kemampuan spermatozoa untuk melakukan

gerak maju atau progresif. Motilitas spermatozoa dihitung melalui cara yang

sama dengan perhitungan konsentrasi sperma total, tetapi pengencernya

menggunakan larutan isotonik, sehingga diperoleh konsentrasi sperma mati.

Rata-rata motilitas spermatozoa pada kambing PE 72,29 % (Kostaman dan Sutama, 2004)

Evaluasi semen yang dilakukan adalah untuk mengetahui kondisi semen yang nantinya akan dibekukan. Semen yang dihasilkan dari penampungan selain digunakan untuk evaluasi semen, digunakan juga untuk 5 perlakuan yang dilakukan dalam penelitian.

C. Pengenceran Semen 1. Bahan Pengencer (Buffer)

Buffer yang digunakan yaitu tris-sitrat kuning telur dengan bahan sebagai berikut:

A. Buffer Tris

a) Menyiapkan bahan pengencer tris yang terdiri dari tris 3,634 gr, asam sitrat 1,99 gr dan fruktosa sebanyak 0,50 gr

b) Melarutkan bahan pengencer tris ke dalam 100 ml aquades.

c) Memindahkan larutan kedalam labu Erlenmeyer 100 ml, lalu menutupnya dengan alumunium foil atau paraffin film

B. Buffer Sitrat

a) Menyiapkan bahan pengencer sitrat yang terdiri dari 2,9 gr Na-Sitrat dan 0,5 gr fruktosa

b) Melarutkan bahan pengencer tris ke dalam 100 ml aquades.

c) Memindahkan larutan ke dalam labu Erlenmeyer 100 ml, lalu menutupnya dengan alumunium foil atau paraffin film

Mencampurkan buffer tris dan sitrat kuning telur dengan perbandingan

75:25, selanjutnya memasukkan campuran bahan tris dan sitrat tersebut ke dalam

labu ukur 100 ml yang bersih. Simpan larutan tersebut dengan baik, untuk digunakan kemudian bila diperlukan.

C. Menyediakan Egg Yolk

a) Menyiapkan telur segar dan membersihkan kulitnya menggunakan kapas beralkohol 70%

b) Memecahkan kulit telur hingga 1/3-1/2 bagian dengan menggunakan pinset steril. Membuang semua cairan putih telur (albumen).

Memindahkan kuning telur yang utuh dan terbungkus vitellin ke atas kertas hisap untuk menghilangkan cairan putih telur yang tersisa c) Memecahkan selaput vitellin dan alirkan kuning telur ke dalam gelas

ukur melewati dinding tabung

d) Menuangkan larutan Tris-Sitrat dan kuning telur, lalu mengaduk hingga merata

e) Menambahkan antibiotic Penicillin 1000 IU dan Sterptomycin 1mg ke dalam setiap ml pengencer. Mengaduk larutan hingga merata

2. Pembuatan Pengencer

a. Menyiapkan larutan buffer tris-sitrat yang telah dibuat disiapkan sebanyak 80 ml

b. Menuangkan kuning telur sebanyak 20 ml ke dalam beaker glass c. Mengaduk kedua bahan tersebut dengan menggunakan batang

pengaduk secara perlahan hingga homogen d. Menutup beaker glass dengan alumunium foil 3. Pembuatan Semen Cair

Penambahan volume pengencer dilakukan dengan perhitungan

menggunakan rumus sebagai berikut:

Jumlah dosis inseminasi =

Keterangan:

V = Volume semen

KT = Konsentrasi Sperma Total

M = Motilitas

KSM = Konsentrasi Sperma Motil yang diinginkan

Perhitungan volume pengencer dan semen, serta perhitungan volume pengencer adalah sebagai berikut:

Volume Pengencer dan Semen = Jumlah Dosis × Volume Inseminasi Volume Pengencer = Volume pengencer dan semen – Volume semen

4. Gliserolisasi

Gliserolisasi dilakukan satu tahap pencampuran dengan cara;

1) Mencampurkan pengencer dengan semen sesuai dengan hasil perhitungan pengencer yang dibutuhkan.

2) Tabung semen yang telah dicampurkan dengan pengencer dibagi menjadi 5 bagian sebagai perlakuan yaitu penambahan gliserol P1=5%, P2=6%, P3=7%, P4=8%, dan P5=9%.

3) Menyimpan di dalam tabung reaksi serta diberi label pada tabung sesuai dengan masing- masing perlakuan.

4) Tabung reaksi masing-masing ditambahkan gliserol dengan cara mengeluarkan jumlah pegencer sesuai dengan jumlah gliserol yang akan dimasukkan, melakukannya secara perlahan pada suhu kamar.

5) Mengaduk secara perlahan hingga homogen V x KT x M

KSM

6) Melakukan proses ekuilibrasi yaitu

waktu yang dibutuhkan oleh spermatozoa untuk menyesuaikan diri sebelum dilakukan pembekuan, hal ini dilakukan di dalam lemari dengan temperatur 4-5 ˚C selama 4 jam

kemudian dilakukan pengemasan.

D. Pengemasan Semen (Filling dan Sealing)

Pengemasan larutan semen ini dilakukan di dalam lemari es / tempar yang bersuhu 4-5 ˚C agar temperaturnya tetap sama. Pengemasan dilakukan dengan menggunakan kemasan straw volume 0,25 ml.

1. Menyambungkan ujung straw dengan ujung yang memiliki sumbat kapas dengan selang penghisap

2. Meyambungkan ujung straw yang lainnya dengan pompa penghisap

3. Menuangkan semen dari beaker glass ke dalam cawan plastik khusus untuk pengisian straw

4. Menghidupkan pompa penghisap lalu biarkan cairan semen masuk ke dalam straw hingga penuh

5. Menutup ujung bebas straw dengan tepung polyvinyl alcohol, setelah straw terisi penuh

E. Pembekuan (Freezing)

Proses pembekuan dilakukan setelah adanya proses pre-freezing, proses pre-freezing dilakukan dengan cara:

1. Meletakkan straw pada uap nitrogen N cair pada container selama 9 menit pada suhu -80 sampai dengan -100

⁰

C

2. Gas nitrogen akan menguapi straw dengan jarak antara straw dan

permukaan cairan sekitar 4 cm

Setelah dilakukan proses pre-freezing, kemudian masuk pada proses pembekuan (freezing), dengan cara

1. Memasukan semen dalam straw yang telah membeku ke dalam goblet dengan menggunakan pinset. Memasukkan goblet yang telah bersi straw kedalam canister.

2. Menyimpan canister kedalam container yang berisi cair yang bersuhu - 196

⁰

C untuk dibekukan.

F. Pencairan Kembali Semen Beku (Thawing)

Mencairkan kembali (thawing) semen yang telah dibekukan pada keesokan harinya dengan air hangat bersuhu 38

⁰

C selama 35-40 detik.

G. Pemeriksaan Post Thawing

Semen yang telah di thawing, diteteskan pada objek glass lalu di evaluasi kembali. Khususnya evaluasi mengenai motilitas dan abnormalitas spermatozoa sebagai parameter dalam penelitian ini.

2.2.3 Peubah yang Diamati a. Motilitas

Motilitas spermatozoa adalah kemampuan spermatozoa untuk melakukan gerak maju atau progresif. Motilitas merupakan salah satu parameter dalam penilaian kualitas sprematozoa, karena mudah dan cepat dilakukan. Perhitungan motilitas pada spermatozoa dilakukan dengan mengamati spermatozoa yang hidup dan mati. Spermatozoa yang tidak bergerak progresif dan diam ditempat dapat dikategorikan sebagai spermatozoa yang mati.

Mengisap semen dengan menggunakan pipet haemocytometer batu merah

sampai pada tanda 0.5 kemudian isap pengencer tris-sitrat sampai tanda 101.

Menghomogenkan dengan membentuk angka delapan selama 2–3 menit, kemudian buang 2–3 tetes, lalu homogenkan kembali. Meneteskan larutan pada celah kamar hitung Neubauer, lalu tutup dengan cover glass. Melakukan pengamatan dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 40 dan hitung jumlah sel spermatozoa sebanyak lima lapang pandang.

Perhitungan persentase motilitas spermatozoa sebagai berikut:

Motilitas = b. Abnormalitas

Pengamatan abnormalitas spermatozoa yang diamati dalam penelitian ini adalah abnormalitas sekunder. Bentuk abnormalitas sekunder meliputi bagian ekor yang melipat, selubung akrosom yang terlepas dari kepala tanpa adanya ekor dan ekor yang terputus. Abnormalitas dihitung dengan menggunakan eosin 2 % (Toelihere,1993b). Jumlah spermatozoa yang abnormal dihitung bersama dengan spermatozoa yang normal.

Mengambil semen dengan menggunakan pipet kemudian meneteskannya diatas gelas objek, lalu mengambil pewarna eosin 2% dan meneteskannya diatas gelas objek yang sama, lakukan pencampuran, kemudian membuat preparat ulas dan melayangkan diatas nyala api bunsen hingga kering. Melakukan pengamatan dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 40 atau 10 x 10, lalu menghitung jumlah spermatozoa yang abnormal dalam spermatoa yang berjumlah 200.

Persentase sel spermatozoa yang abnormal adalah

Abnormalitas = x100%

∑spermatozoa total - ∑spermatozoa mati

∑spermatozoa total

∑spermatozoa abnormal

∑spermatozoa abnormal + ∑spermatozoa normal

2.2.4 Analisis Data

Analisis data yang digunakan yaitu dengan Rancangan Acak Kelompok (RAK) karena memiliki 5 perlakuan dan 5 kelompok, sehingga diperoleh 25 unit percobaan. Model matematika yang digunakan adalah :

Y

ijk

= µ + γ

i +

β

j +

ε

ijk

Keterangan:

Y

_ijk

: respon hasil pengamatan perlakuan ke-i kelompok ke- j µ : rataan umum

γ

i

: pengaruh aditif perlakuan ke- i β

j

: pengaruh aditif dari kelompok ke-j ε

ijk

: galat percobaan

i : banyaknya percobaan (1,2,3,4,5) j : banyaknya kelompok (1,2,3,4,5)

Hipotesis : Motilitas

H

0

: P

2

≤ P

1

, P

3,

P

4

, P

5

Berarti tidak ada perlakuan yang berpengaruh nyata.

H

1

: P

2

> P

1

, P

3,

P

4,

P

5

Berarti ada minimal satu perlakuan yang berpengaruh nyata.

Abnormalitas

H

0

: P

2

≥ P

1

, P

3,

P

4

, P

5

Berarti tidak ada perlakuan yang berpengaruh nyata.

H

1

: P

2

< P

1

, P

3,

P

4,

P

5

Berarti ada minimal satu perlakuan yang berpengaruh nyata.

Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan sidik ragam untuk

mengetahui pengaruh perlakuan penambahan berbagai level glierol terhadap

motilitas dan abnormalitas.

Tabel 1. Analisis Sidik Ragam

Sumber variasi db JK KT Fhit F

tabel 0,05

Kelompok (r-1) JK

k

KT

k

Perlakuan (p-1) JK

P

KT

P

KT

P

/KT

G

Galat p(r-1) JK

G

KT

G

Total (r-1)(p-1) JK

_T

Sumber : Gaspersz, 1995.

Keterangan:

db = Derajat bebas JK = Jumlah kuadrat KT = Kuadrat tengah p = Total Perlakuan r = Ulangan

Perbedaan pengaruh perlakuan dapat diketahui dengan menggunakan uji F dengan taraf kepercayaan 5% kaidah keputusan :

1. Apabila F

hit

≤ F

tabel 0,05

maka tidak berbeda nyata (terima H

0

).

2. Apabila F

hit

> F

tabel 0,05

maka berbeda nyata (tolak H

0

dan terima H

1

) artinya ada pengaruh perlakuan terhadap respon yang diamati

Apabila hasil sidik ragam menunjukan perlakuan berpengaruh nyata maka dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan, sebagai berikut:

S

x

= KTG

LSR = SSR x S

x

Keterangan :

S

x

= Standar error

KTG = Kuadrat Tengah Galat r = Ulangan periode

LSR = Least Significant Range (Jarak beda nyata terkecil) SSR = Student Significant Range

r

Bila selisih antara perlakuan dibanding dengan LSR, kaidah keputusan : 1. Bila d ≤ LSR (tidak berbeda nyata)

2. Bila d> LSR (berbeda nyata) Ket :

d = selisih antar perlakuan

1.2.5 Tata Letak Percobaan Tabel 2. Tata Letak

Kelompok Perlakuan Total

Kelompok

1 2 3 4 5

1 P

1

K

1

P

2

K

1

P

3

K

1

P

4

K

1

P

5

K

1

Y

1

2 P

1

K

2

P

2

K

2

P

3

K

2

P

4

K

2

P

5

K

2

Y

2

3 P

1

K

3

P

2

K

3

P

3

K

3

P

4

K

3

P

5

K

3

Y

3

4 P

1

K

4

P

2

K

4

P

3

K

4

P

4

K

4

P

5

K

4

Y

4

5 P

1

K

5

P

2

K

5

P

3

K

5

P

4

K

5

P

5

K

5

Y

5

Total Perlakuan Y

1

Y

2

Y

3

Y

4

Y

5

…

Rata-rata … … … … … …

Berdasarkan tabel tata letak diatas dapat dibuat hasil pengacakan perlakuan adalah sebagai berikut :

P

1

K

1

P

3

K

1

P

5

K

3

P

₄

K

₂

P

1

K

3

P

4

K

3

P

2

K

3

P

₃

K

₂

P

₅

K

₂

P

₁

K

₂

P

4

K

1

P

2

K

1

P

5

K

1

P

3

K

3

P

₄

K

₄

P

₅

K

₅

P

₂

K

₅

P

₁

K

₄

P

₄

K

₅

P

₂

K

₄

P

₁

K

₅

P

₃

K

₄

P

₃

K

₅

P

₅

K

₄

P

₂

K

₂