III
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1 Bahan/Objek Penelitian 3.1.1 Objek Penelitian
Objek penelitian adalah semen kambing yang berasal 5 ekor kambing Peranakan Etawah yang berumur 1,5-3 tahun yang dipelihara di Breeding Station
Fakultas Peternakan, Universitas Padjadjaran.. Pakan yang diberikan yaitu berupa hijauan sebanyak 5-6 kg/hari/ekor serta diberi tambahan berupa konsentrat sebanyak 700-800 gr/hari/ekor.
3.1.2 Alat dan Bahan Penelitian A. Alat Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Semen kambing peranakan etawah digunakan untuk sampel penelitian. 2. Air hangat 38-40oC digunakan untuk penghangat vagina buatan dan
dimasukan ke dalam vagina buatan saat akan dilakukan penampungan. 3. Vaseline digunakan untuk melicinkan daerah vagina buatan atau bibir
vagina buatan.
4. Larutan NaCl 3% digunakan untuk pengamatan konsentrasi spermatozoa. 5. Larutan Gliserol yang digunakan sebagai krioprotektan saat pembekuan. 6. Buffer (tris (hydroxymethyl) aminomethane, fruktosa, asam sitrat
monohidrat, dan Natrium Sitrat).
7. Kuning telur digunakan sebagai nutrisi bagi spermatozoa dan bahan pencampur untuk pengenceran.
9. Penicillin dan streptomycin digunakan sebagai antibiotik yang ditambahkan pada bahan pengencer.
10. Glukosa digunakan sebagai nutrisi bagi spermatozoa. 11. N2 cair digunakan sebagai media pembekuan semen. 12. Air hangat 38oC yang digunakan untuk thawing.
13. Formalin 1% untuk melakukan pengamatan tudung akrosom utuh. 14. Aquadest untuk mencuci peralatan yang telah digunakan.
B. Peralatan Penelitian
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Satu set vagina buatan untuk menampung semen kambing PE.
2. Termos untuk menyimpan air hangat yang akan digunakan untuk vagina buatan.
3. Mikroskop untuk mengevaluasi mikroskopis semen.
4. Tabung penampung semen yang digunakan untuk menyimpan semen kambing PE hasil tampungan.
5. Objek glass sebagai tempat media untuk mengevaluasi mikroskopis dibawah meja mikroskop.
6. Cover glass digunakan untuk mengevaluasi mikroskopis gerakan individu. 7. Pipet untuk mengambil semen dari ampul.
8. Batang pengaduk digunakan untuk mengaduk semen dengan pengencer. 9. Pembakar bunsen untuk mensterilkan peralatan sebelum evaluasi
mikroskopis.
10. Kertas lakmus digunakan untuk menentukan pH semen.
11. Haemocytometer dan kamar hitung Neubauer digunakan untuk menghitung konsentrasi sperma.
12. Pipet erythrocyte digunakan untuk menghisap semen.
13. Timbangan Analitik digunakan untuk menimbang sampel yang akan digunakan.
14. Kertas saring digunakan untuk memisahkan kuning telur dengan albumen. 15. Tabung Erlenmeyer digunakan untuk menyimpan pengencer.
16. Aluminium foil digunakan untuk menutup tabung reaksi atau tabung
Erlenmeyer.
17. Gelas ukur digunakan untuk menghitung jumlah atau volume pengencer yang digunakan.
18. Straw dengan volume 0,25 ml digunakan sebagai tempat penyimpanan semen+pengencer yang akan dibekukan.
19. Canister dan Goblet digunakan untuk menyimpan straw yang disimpan didalam container.
20. Container digunakan untuk menyimpan Nitrogen (N2) cair dan juga
Canister dan Goblet.
21. Tissu untuk mengeringkan peralatan.
3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Prosedur Penelitian
A. Penampungan Semen
Teknik penampungan dengan metode VB sebagai berikut : 1. Persiapan Penampungan
a. Menyiapkan pemancing dan juga kambing yang akan ditampung semennya.
c. VB diisi dengan air panas dan atur suhu saat persiapan (45 ºC) dan pada waktu penampungan (40 ºC) dengan menggunakan termometer
2. Prosedur penampungan :
a. VB dipegang oleh operator/penampung dengan tangan kanan. b. Operator siap di sebelah kanan belakang pemancing
c. Mendekatkan pejantan dengan pemancing
d. Menarik kembali pejantan dan lepaskan agar mendekati pemancing dan ulangi 2-3 kali (False Mount)
e. Mengarahkan penis ke arah mulut VB yang telah disiapkan bila kambing telah dalam posisi siap
f. Menurunkan pejantan perlahan-lahan dan bersamaan dengan itu VB. Letakkan VB agak miring sedikit ke bawah sampai penis keluar secara perlahan.
g. Menegakkan VB agar semen turun ke dalam tabung penampung h. Melepaskan tabung penampung dari karet VB
i. Membawa semen yang telah ditutup aluminium foil ke laboratorium untuk segera di evaluasi
B. Evaluasi Semen
Evaluasi semen dilakukan di laboratorium untuk menentukan kualitas semen dan tingkat reproduksi pejantan. Evaluasi semen meliputi dua kategori :
1. Evaluasi Makroskopis a. Volume
Volume semen dapat dilihat langsung pada skala tabung penampung setelah semen ditampung. Volume semen setiap penampungan untuk masing-masing ternak berbeda-beda menurut bangsa, umur, ukuran
ternak, dan makanan (Partodihardjo, 1992). Volume semen kambing bervariasi setiap penampungan yaitu 0,5–1,0 ml (Devendra dan Burns, 1994). Apabila semen yang dihasilkan pada penampungan pertama (ejakulat ke-1) < 0,5 ml, maka dilanjutkan dengan penampungan kembali (ejakulat ke-2) dengan selang waktu 5-10 menit. Selanjutnya semen dicampurkan dari semen ejakulat ke-1 dengan semen ejakulat ke-2. Pada parameter volume semen terlihat lebih beragam, hal ini selain dipengaruhi oleh perbedaan rumpun kambing, dapat pula dipengaruhi cara pengambilan, frekuensi penampungan dan umur kambing (Setiadi dkk., 2002).
b. Warna
Dilihat langsung menggunakan panca indra (mata). Warna rata-rata untuk kambing Peranakan Etawah yaitu krem-putih susu (Tambing dkk, 2000).
c. Konsistensi
Konsistensi atau derajat kekentalan dapat dilihat dengan cara mememiringkan tabung penampung berisi semen segar secara perlahan dan lihatlah kecepatan semen itu dapat kembali ke posisi awal. Apabila kecepatan semen itu kembali keposisi awal lambat berarti konsistensinya tinggi (kental) dan sebliknya bila cepat maka konsistensinya rendah (encer). Rata-rata konsistensi pada kambing Peranakan Etawah adalah kental (Tambing dkk, 2000). Konsistensi semen sangat bergantung pada perbandingan spermatozoa dan plasma semen (Evans dan Maxwell, 1987 dalam Hastono dkk., 2002)
Dapat diamati langsung dengan menggunakan panca indra penciuman (hidung)
e. pH (Derajat keasaman)
Keasaman atau pH semen diukur menggunakan pH meter/kertas lakmus. pH rata-rata semen kambing berkisar sekitar 7,0 (Partodihardjo, 1992). 2. Evaluasi Mikroskopis
a. Gerakan Massa
Gerakan massa spermatozoa merupakan petunjuk derajat keaktifan bergerak sperma, dan ini dapat dijadikan sebagai indikator tingkat atau presentase sperma hidup dan aktif dalam semen.
1. Meletakkan satu tetes semen di atas gelas objek
2. Mengamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10x10
Rata-rata nilai gerakan massa pada semen kambing Peranakan Etawah adalah +++ (Tambing dkk, 2000).
b. Konsentrasi Spermatozoa Total
Penilaian konsentrasi spermatozoa bertujuan untuk menghitung jumlah spermatozoa per mililiter semen. Faktor ini sangat menentukan kriteria kualitas semen dan menggambarkan sifat-sifat semen, serta sangat berguna untuk menentukan jumlah betina yang dapat diinseminasi menggunakan semen tersebut.
Penghitungan ini dilakukan dengan menggunakan Hemocytometer dan kamar hitung Neubauer. Cara penghitungan adalah sebagai berikut : 1. Menghisap semen segar dengan pipet erythrocyt sampai tanda 0,5 2. Kemudian isap larutan NaCl 3 % sampai tanda 101.
3. Dikocok hati-hati dengan gerakan membentuk angka 8 selama 2–3 menit
4. Beberapa tetesan pertama dibuang dan dikocok lagi
5. Menyiapkan kamar hitung Neubauer dan tutup dengan gelas penutup. 6. Meneteskan satu tetes semen pada sisi gelas penutup.
7. Menghitunglah jumlah sel spermatozoa.
8. Melakukan Pengamatan dibawah mikroskop dengan pembesaran 10x40, perhitungannya spermatozoa total dikalikan 107 spermatozoa per ml. Rata-rata konsentrasi sperma pada semen kambing Peranakan Etawah adalah 2801,43±438,79 (Tambing dkk., 2000)
c. Motilitas
Motilitas Spermatozoa digunakan untuk melihat pergerakan sperma, metode perhitungannya sama dengan perhitungan konsentrasi sperma total. Motilitas spermatozoa dihitung menggunakan haemocytometer
dengan kamar hitung neubauer. Pengamatan motilitas spermatozoa yaitu dengan menghitung jumlah spermatozoa mati dan spermatozoa yang tidak bergerak progresif sehingga diperoleh konsentrasi sperma mati.
Motilitas =
Rata-rata motilitas spermatozoa pada kambing PE 72,29 % (Kostaman dan Sutama, 2004). Motilitas spermatozoa dipengaruhi oleh suhu lingkungan dan persentase sperma hidup yang normal (Toelihere, 1981). Rata-rata kualitas semen kambing Peranakan Etawah yang dapat dilanjutkan untuk pengenceran semen dan pembekuan, berdasarkan
∑spermatozoa total - ∑spermatozoa mati ∑spermatozoa total
pengamatan makroskopis dan mikroskopis adalah volume semen kambing Peranakan Etawah rata-rata 0,95 ml, konsistensi kental, warna putih sampai krem, konsentrasi spermatozoa 2,94 milyar/ml, pH 7,13, gerakan massa +++, persentase motilitas 72,79%, persentase hidup spermatozoa 82,54% dan persentase abnormalitas spermatozoa 10,17% (Tambing dkk, 2001).
C. Bahan Pengencer dan Cara Pembuatan Semen Cair 1. Cara pembuatan Sediaan buffer tris-sitrat/ 100 ml
a. Menimbang bahan campuran tris, ( (hydroxymethyl) aminomethane 3,634 gram, fruktosa 0,5 gram, asam sitrat monohidrat 1,99 gram).
b. Menimbang bahan campuran sitrat, (Natrium Sitrat 2,9 gram, fruktosa 0,5 gram).
c. Tris yang telah dibuat dengan sitrat dicampurkan dengan perbandingan (tris 75% : sitrat 25%).
d. Memasukkan campuran bahan tris dan sitrat tersebut ke dalam labu ukur 100 ml yang bersih. Tambahkan aquabidestilata steril sampai mencapai 100 ml. Pindahkan larutan ke dalam labu Erlenmeyer 100 ml. Tutup dengan aluminium foil atau paraffin film. Simpan larutan tersebut dengan baik, untuk digunakan kemudian bila diperlukan.
2. Cara menyediakan Egg Yolk
a. Telur ayam dicuci sampai bersih dan keringkan b. Membaasahi telur dengan alkohol 70%.
c. Memecahkan telur dan pisahkan antara putih dan kuning telurnya d. Egg yolk dipindahkan ke atas kertas isap steril
e. Selaput vitelinnya dipecahkan dan bagian egg yolk dialirkan pada beaker glass yang kecil (20 ml), dan egg yolk siap digunakan
3. Cara membuat pengencer
a. Menyiapkan 80 ml larutan buffer (tris-sitrat)
b. 20 ml kuning telur dituangkan ke dalam beaker glass 100 ml
c. Aduk hingga merata dengan menggunakan batang pengaduk gelas. Pengadukan lakukan dengan hati-hati agar tidak terbentuk busa yang berlebihan.
d. Kemudian, ditambahkan 100.000 internasional unit (IU) Penicillin dan 100 mg Streptomycin kedalam larutan Natrium sitrat Kuning Telur (1000 IU Penicillin dan 1 mg Streptomycin untuk setiap milliliter pengencer) e. Menutup mulut beaker glass dengan aluminium foil.
f. Larutan pengencer siap digunakan D. Pembuatan Semen Cair
Penambahan volume pengencer dilakukan dengan perhitungan menggunakan rumus sebagai berikut:
Jumlah dosis inseminasi =
Keterangan:
V = Volume semen
KT = Konsentrasi Sperma Total M = Motilitas
KSM = Konsentrasi Sperma Motil yang diinginkan V. Pengencer dan semen = Jumlah dosis x Volume inseminasi V. pengencer = Volume pengencer dan semen – Volume semen E. Pengenceran
1. Menyiapkan pengencer di dalam gelas ukur (125 ml) V x KT x M
2. Menambahkan semen perlahan melalui dinding tabung dan dihomogenkan perlahan.
3. Tabung yang berisi semen cair ditutup dengan aluminium foil. Masukkan semen cair ke dalam lemari es dengan temperature 5 oC.
4. Melakukan gliserolisasi
5. Pengencer dibagi menjadi 5 bagian
6. Simpan di dalam tabung reaksi serta beri label pada tabung sesuai dengan masing-masing perlakuan.
7. Mengisi tabung yang berisi pengencer + semen dengan : Tabung 1: Gliserol 5%
Tabung 2: Gliserol 6% Tabung 3: Gliserol 7% Tabung 4: Gliserol 8% Tabung 5: Gliserol 9%
F. Pengemasan Semen (Filling and Sealing)
Volume tiap straw yang digunakan sebesar 0,25 ml. Pengemasan semen ke dalam straw dilakukan di dalam lemari es agar temperaturnya tetap pada 5 oC
a. Semen dari beaker glass dituangkan ke dalam cawan plastik khusus untuk pengisian straw
b. Menghidupkan pompa penghisap
c. Mencelupkan ujung straw yang bebas ke dalam cawan plastik yang berisi semen cair dan biarkan cairan semen memasuki straw sampai penuh
d. Menutup ujung bebas straw dengan bubuk kuning polyvinyl alcohol
atau dijepit dengan menggunakan pinset yang sudah dipanaskan. G. Pre Freezing
Simpan semen cair yang telah ditambakan pengencer dan gliserol serta dikemas kedalam lemari es dengan temperatur 5 0C selama 2-4 jam untuk proses equibrasi. Equlibrasi merupakan periode yang dibutuhkan spermatozoa sebelum pembekuan agar beradaptasi dengan pengecer maupun suhu ligkungannya. Selanjutnya dilakukan prefreezing dengan cara :
a. Menyiapkan container, canister, dan cek N2 cair yang tersedia. b. Memasukan straw yang telah diberi label ke dalam goblet, lalu
masukkan kedalam canister.
c. Membiarkan gas Nitrogen menguapi straw, yang berjarak sekitar 4 cm dari permukaan cairan (pada leher container), selama 9 menit. Suhu uap Nitrogen saat itu antara -80 sampai -100 oC.
H. Pembekuan Semen
Penurunan suhu semen dari 5 ke -196 oC dilakukan secara bertahap. Langkah selanjutnya adalah pembekuan semen dengan cara memasukkan straw-straw yang telah membeku kedalam container yang berisi N2 cair dengan suhu -196 oC.
I. Metode Pencairan kembali semen beku (Thawing)
Semen yang telah dibekukan selama satu malam, kemudian dilakukan pencairan kembali (thawing) akan dilakukan pada keesokan harinya dengan cara sebagai berikut :
b. Siapkan air hangat (38 oC) ke dalam termos
c. Masukkan straw ke dalam termos yang berisi air hangat selama 30 detik.
J. Pemeriksaan Post-Thawing
Keringkan straw yang akan digunakan, potong kedua ujung straw, tampung semen ke dalam tabung eppendorf 0,5 ml, lalu amati :
a. Daya Hidup
Daya Hidup diamati dengan cara mengamati berapa lama spermatozoa dapat bertahan hidup sampai akhirnya dia mati semua (0%). Pengamatan dilakukan setiap 3 jam sekali setelah dilakukan thawing sampai sperma mati total, setelah penurunan atau motilitas sekitar 10-20%, maka pengamatan dilakukan setiap 1 jam sekali. Pengamatan dilakukan seperti halnya melakukan pengamatan motilitas.
b. Tudung Akrosom Utuh
Tudung akrosom merupakan bagian terpenting dari spermatozoa dan berperan dalam proses pembuahan. Prosedur pengamatannya adalah sebagai berikut :
1. Siapkan semen yang telah dithawing
2. Larutkan 0,9 ml NaCl dengan Aquabidestilasi hingga mencapai 100 ml
3. Tambhkan 1 ml formalin kedalam 99 ml NaCl
4. Campurkan semen dengan pelarut tersebut di atas sampai homogen 5. Buat preparat ulas dan tutup dengan cover glass
3.2.2 Peubah Yang Diamati a. Daya Hidup Spermatozoa
Daya tahan hidup spermatozoa dilihat dari seberapa lama spermatozoa dapat bertahan hidup sampai spermatozoa tersebut benar-benar mati semua saat dilakukan pengamatan post thawing (perjam). Pengamatan dilakukan seperti halnya pengamatan motilitas.
b. Tudung Akrosom Utuh (TAU)
Kerusakan tudung akrosom dicermati dengan menggerakkan titik fokus pada wilayah pandang di bawah mikroskop untuk memperjelas kondisi tiap tudung kepala spermatozoa. Tudung akrosom dinilai rusak bila tidak terlihat garis pembungkus pada bagian kepala, garis cincin nukleus serta tidak terdapat warna lebih gelap pada bagian atas kepala (Bag dkk., 2004). Perhitungan tudung akrosom rusak dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut (Ichwandi, 2004):
TAU = x 100%
3.2.3 Perlakuan Penelitian
Perlakuan yang diberikan pada penelitian ini adalah metode pencampuran gliserol (gliserolisasi) pada suhu yang berbeda. Pada proses ini semen dibagi menjadi 5 (lima) perlakuan:
P1: Semen + (pengencer tris-sitrat kuning telur+Gliserol 5%) P2: Semen + (pengencer tris-sitrat kuning telur+Gliserol 6%) P3: Semen + (pengencer tris-sitrat kuning telur+Gliserol 7%) P4: Semen + (pengencer tris-sitrat kuning telur+Gliserol 8%) P5: Semen + (pengencer tris-sitrat kuning telur+Gliserol 9%)
Spermatozoa bertudung akrosom utuh Spermatozoa yang diam mati
3.2.4 Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental dengan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) sebagai kelompok adalah kambing jantan. Menggunakan 5 (lima) perlakuan dan 5 (lima) kelompok sehingga ada 25 unit percobaan. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam. Apabila terdapat perbedaan diantara perlakuan maka dilakukan uji Duncan. Model matematik yang digunakan adalah model linier, dengan persamaan:
Yij = µ + γi + βj + εij Keterangan:
Yij : nilai pengamatan ke-i dalam kelompok ke- j µ : nilai tengah populasi
γi : pengaruh perlakuan ke- i βj : pengaruh kelompok ke-j εij : galat percobaan
i : banyaknya percobaan (1,2,3,4,5) j : banyaknya kelompok (1,2,3,4,5) Asumsi :
1. nilai εij menyebar normal dan bebas satu sama lain 2. nilai harapan εij = 0 atau S (εij) = 0
3. ragam dari εij = d atau S (εij2) = d2 , maka εij ~ NID (0, d) Hipotesis yang diuji:
H0 : Pengaruh perlakuan P2 ≤ P1, P2, P3, P4, P5, berarti tidak ada perlakuan yang berpengaruh nyata
H1 : Pengaruh perlakuan P2 > P1, P2, P3, P4, P5 atau paling sedikit ada satu perlakuan yang berbeda yang mempengaruhi daya hidup dan keutuhan tudung akrosom semen.
Berdasarkan model matematik di atas, Hasil analisis data penelitian yang didapat, akan disajikan dalam tabel sidik ragam.
Tabel 1. Daftar Sidik Ragam
Sumber Keragaman db JK KT Fhit F0,05
Kelompok (r-1) 4 JKK JKK/db
Perlakuan (t-1) 4 JKP JKP/db KTP/KTG Galat ((r-1)(t-1)) 16 JKG JKG/db
Total (tr-1) 24 JKT
Keterangan: db = Derajat bebas JK = Jumlah kuadrat KT = Kuadrat tengah
Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan menggunakan analisis ragam untuk mengetahui pengaruh level gliserol dalam pengencer tris-sitrat kuning telur terhadap daya hidup dan tudung akrosom utuh semen kambing Peranakan Etawah post thawing. Untuk mengetahui perbedaan pengaruh perlakuan digunakan uji F dengan taraf kepercayaan 5% kaidah keputusan :
1. Bila Fhitung ≤ F0.05 berbeda tidak nyata (non significant), maka terima H0 dan
tolak H1.
2. Bila Fhitung > F0.05 berbeda nyata (significant), maka tolak H0 dan terima H1.
Apabila hasil sidik ragam menunjukan perlakuan berpengaruh nyata maka dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan :
Sx = KTG
LSR = SSR x Sx Keterangan :
Sx = Galat Baku
KTG = Kuadrat Tengah Galat r = Ulangan Periode
LSR = Least Significant Range (Jarak beda nyata terkecil) r
SSR = Studentized Significant Range
Kaidah keputusan:
1. Bila selisih antar perlakuan ≤ LSR (tidak berbeda nyata) 2. Bila selisih antar perlakuan > LSR (berbeda nyata)
3.2.4 Tata Letak Percobaan Tabel 2. Tata Letak
Kelompok Perlakuan Total
Kelompok 1 2 3 4 5 1 P1K1 P2K1 P3K1 P4K1 P5K1 Y1 2 P1K2 P2K2 P3K2 P4K2 P5K2 Y2 3 P1K3 P2K3 P3K3 P4K3 P5K3 Y3 4 P1K4 P2K4 P3K4 P4K4 P5K4 Y4 5 P1K5 P2K5 P3K5 P4K5 P5K5 Y5 Total Perlakuan Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 … Rata-rata … … … …
Berdasarkan tabel tata letak diatas dapat dibuat hasil pengacakan perlakuan adalah sebagai berikut :
P1K1 P3K1 P5K3 P4K2 P1K3 P4K3 P2K3 P3K2 P5K2 P1K2 P4K1 P2K1 P5K1 P3K3 P4K4 P5K5 P2K5 P1K4 P4K5 P2K4 P1K5 P3K4 P3K5 P5K4 P2K2
