BAB III
METODE PENELITIAN
A. RANCANGAN PENELITIAN
Penelitian ini merupakan uji klinis eksperimental kuasi dengan pendekatan
pretest-posttest control group design pada kelompok intervensi dan kontrol.
B. TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian dilakukan di RSUD Dr. Moewardi Surakarta pada 23 Desember 2015 – 2 Februari 2016.
C. POPULASI PENELITIAN
Populasi target penelitian ini adalah penderita pneumonia. Populasi terjangkau adalah penderita pneumonia yang menjalani rawat inap di RSUD Dr. Moewardi Surakarta pada 23 Desember 2015 – 2 Februari 2016.
D. PEMILIHAN SAMPEL
Sampel penelitian ini adalah penderita pneumonia yang menjalani rawat inap di RSUD Dr. Moewardi Surakarta. Pengambilan sampel dilakukan dengan cara
consecutive sampling yaitu memilih subjek penelitian yang datang dan memenuhi
kriteria pemilihan, dimasukkan dalam penelitian sampai jumlah sampel yang diperlukan terpenuhi.
E. BESAR SAMPEL
Besar sampel ditentukan berdasarkan jenis penelitian analitis dengan rumus: ( Z√2PQ + Z√P1Q1+P2Q2 ) 2
n = n1 =
( P1-P2 )2 n = besar sampel
P1 = proporsi normalisasi kadar serum IL-6 pada penderita yang menerima vitamin C 1 gram/hari = 80%
P2 = proporsi normalisasi kadar serum IL-6 pada penderita yang menerima placebo = 20%
P = ( P1 + P2 )/2 = 0.50 Q = (1 - P) = 0.50
α = tingkat kemaknaan, bila α = 0.05 maka Zα = 1,960 ᵦ = kekuatan/power = 0.10 maka Zᵦ = 1,282
( 1,960 √ 2x0.50x0.50 + 1.282 √ 0.8x0.2 + 0.2x0.8) 2 n = n1 =
( 0.8-0.2 )2 (Sastroasmoro dan Ismael, 2011)
n = n1 = 13
Besar minimal sampel yang diperlukan adalah 13x2 = 26
Toleransi jumlah sampel 10% tiap kelompok, sehingga besar total sampel yang diperlukan adalah 30 orang
F. KRITERIA INKLUSI, EKSKLUSI, DAN DISKONTINYU
1. Kriteria inklusi
a. Penderita pneumonia laki-laki dan perempuan berusia lebih dari 18 tahun b. Penderita pneumonia yang dirawat inap:
Diagnosis pneumonia ditegakkan apabila didapatkan infiltrat atau air
bronchogram pada foto toraks disertai gejala berupa batuk, perubahan
karakteristik sputum atau purulen, suhu tubuh ≥380C (aksila) atau riwayat demam, dan sesak. Pemeriksaan fisik didapatkan tanda-tanda konsolidasi, suara napas bronkial, dan ronki, sedangkan hasil pemeriksaan laboratorium darah didapatkan leukosit ≥10.000 atau <4500.
- Pneumonia komunitas dengan skor pneumonia severity index (PSI) lebih dari 70 (Perhimpunan Dokter Paru Indonesia, 2014)
- Pneumonia komunitas dengan skor PSI kurang dari 70 tetapi memenuhi salah satu dari kriteria: frekuensi napas >30 kali per menit, PaO2/FiO2 <250 mmHg, foto toraks menunjukkan infiltrat multilobus, tekanan sistolik <90 mmHg, tekanan diastolik <60 mmHg
Health care associated pneumonia adalah pneumonia yang telah terjadi
sebelum masuk rumah sakit pada penderita yang memiliki salah satu dari faktor risiko yaitu pernah rawat inap di rumah sakit minimal selama dua hari dalam 90 hari terakhir sebelum infeksi pneumonia terjadi, penghuni panti jompo atau penghuni fasilitas perluasan perawatan kesehatan, perawatan di rumah dengan terapi menggunakan infus (termasuk antibiotik), menjalani hemodialisis rutin terutama pada 30 hari terakhir, perawatan luka di rumah, dan adanya anggota keluarga serumah yang memiliki riwayat terinfeksi patogen multi-drug resistant (MDR).
c. Dirawat di RSUD dr.Moewardi Surakarta d. Setuju ikut penelitian
2. Kriteria eksklusi
a. Pneumonia nosokomial b. Tuberkulosis aktif
c. Titer antibodi HIV positif (berdasarkan data dari rekam medik) d. Wanita hamil (berdasarkan data dari rekam medik)
e. Gagal ginjal kronik 3. Diskontinyu
a. Muncul efek samping terhadap vitamin C selama penelitian berlangsung. b. Penderita meninggal selama follow up
c. Mengundurkan diri
G. VARIABEL PENELITIAN
1. Variabel bebas
Vitamin C injeksi intravena dosis 1000 mg/orang/hari 2. Variabel tergantung
- Kadar serum IL-6
- Lama pencapaian perbaikan klinis (penilaian perbaikan klinis berdasarkan kriteria ATS/IDSA, 2007 seperti dijelaskan pada definisi operasional)
H. DEFINISI OPERASIONAL VARIABEL PENELITIAN
Asam askorbat merupakan zat aktif vitamin C yang memiliki efek antioksidan dan antiinflamasi. Vitamin C dosis tunggal 1000 mg dimasukkan ke dalam 100 mL NaCl 0,9% diberikan secara intravena dengan kecepatan maksimal 0,5 g/ menit. Vitamin C diberikan setiap pagi sampai tercapai perbaikan klinis. Plasebo berupa cairan NaCl 0,9 % sebanyak 100 mL intravena dan diberikan setiap pagi sampai tercapai perbaikan klinis. Skala data nominal, dengan skala ukur 1000 mg/orang/hari.
2. Interleukin-6
Interleukin-6 merupakan sitokin proinflamasi yang peningkatan kadarnya pada
reaksi inflamasi terjadi lebih awal dibandingkan sitokin lain dan memiliki waktu paruh lebih panjang sehingga sangat berguna sebagai marker aktivasi sitokin proinflamasi. Pengukuran kadar serum IL-6 dilakukan di laboratorium Biomedik FK UNS dengan metode ELISA. Skala data numerik (rasio), dengan skala ukur pg/ml.
3. Lama pencapaian perbaikan klinis
Perbaikan klinis dinilai berdasarkan kriteria klinis stabil menurut ATS/IDSA (2007) yaitu tanda vital stabil dalam waktu 24 jam (suhu tubuh aksiler < 37,8oC, laju pernapasan ≤ 24 kali per menit, denyut jantung ≤ 100 kali per menit, tekanan darah sitolik ≥ 90 mmHg) dan SpO2 ≥ 90% atau tekanan PaO2 ≥ 60 mmHg saat bernapas dengan oksigen ruangan, mampu mempertahankan intake oral, dan status mental normal. Dikatakan perbaikan jika kriteria di atas terpenuhi semua (tujuh kriteria) atau minimal satu kriteria tidak terpenuhi. Sebagian besar penderita pneumonia menunjukkan perbaikan klinis dalam 72 jam pertama setelah pemberian antibiotik awal (Perhimpunan Dokter Paru Indonesia, 2014). Lama pencapaian perbaikan klinis merupakan lama hari penderita pneumonia mencapai perbaikan klinis, dihitung dengan cara lama perbaikan klinis ditotal dalam hitungan jam kemudian dibagi 24 jam, apabila sisanya <12 jam dibulatkan ke bawah sedangkan ≥12 jam dibulatkan ke atas. Penghitungan lama pencapaian perbaikan klinis dimulai saat penderita pneumonia dinyatakan sebagai subjek penelitian. Skala data numerik (rasio), dengan skala ukur dalam hari.
Plasebo adalah zat atau obat tidak aktif yang tampak sama dan diberikan dengan cara sama seperti obat aktif atau pengobatan yang diuji. Penelitian ini menggunakan NaCl 0,9% 100 ml sebagai plasebo, merupakan cairan infus tidak berwarna, jernih, steril, dan nonpirogenik. Osmolaritas sebesar 308 mOsmol/L, Na+ 154 mOsmol/L, dan Cl- 154 mOsmol/L. Dapat digunakan sebagai pelarut obat parenteral, pengganti defisit cairan ekstraselular dan elektrolit, serta irigasi steril. Efek yang tidak diinginkan dapat berupa demam, infeksi pada tempat suntikan, trombosis vena atau flebitis. Pemberian berlebihan dapat menyebabkan hipernatremia, hipokalemia, dan asidosis.
I. INSTRUMEN PENELITIAN
Human Interleukin-6 Platinum nomor katalog BMS213/2 dari eBioscience (range
deteksi alat 3-300 pg/ml) Alat dan bahan:
- Kantong aluminium dengan microwell plate dilapisi antibodi monoklonal
terhadap IL-6 manusia 1 buah
- Konjugat Biotin antibodi monoklonal anti IL-6 manusia 1 vial (70 µl)
- Streptavidin HRP 1 vial (150 µl)
- Standar IL-6 manusia, lyophilized, rekonstitusi >200 pg/ml 2 vial
- Kontrol tinggi 1 vial
- Kontrol rendah 1 vial
- Konsentrat buffer untuk 20 kali pemeriksaan 1 vial (5 ml) - Konsentrat buffer untuk 20 kali pencucian 1 botol (50 ml) - Larutan substrat (tetramethyl-benzidine) 1 vial (15 ml) - Stop solution (1 M phosphoric acid) 1 vial (15ml)
- Adhesive films 4 buah
J. PROSEDUR PENGUMPULAN DATA
1. Penderita yang datang ke RSUD Dr. Moewardi Surakarta yang telah terdiagnosis pneumonia komunitas atau HCAP sebagai subjek diberikan penjelasan tentang tujuan penelitian.
2. Subjek yang bersedia ikut dalam penelitian diminta untuk menandatangani lembar persetujuan (informed consent).
3. Subjek yang memenuhi kriteria inklusi diberikan edukasi, dicatat identitas, riwayat merokok, penyakit lain yang diderita, dan lain-lain pada formulir yang disediakan. Data awal subjek diperoleh dari anamnesis, pemeriksaan fisik, laboratorium darah, dan foto toraks. Dilakukan penilaian jumlah skor PSI berdasarkan PORT untuk penderita pneumonia komunitas, serta diambil darah vena untuk memeriksa kadar IL-6 (lampiran 3).
4. Subjek dibagi menjadi dua kelompok. Kelompok pertama mendapat vitamin C 1 gram/hari, diencerkan dalam NaCl 0,9 % 100 mL, diberikan secara intravena (pagi hari sesudah makan) selama dirawat sampai tercapai perbaikan klinis. Kelompok kedua mendapat plasebo berupa NaCl 0,9 % 100 mL secara intravena sekali sehari.
5. Antibiotik dan terapi suportif lainnya diberikan sesuai terapi empirik atau definitif apabila sudah didapatkan data kultur.
6. Penderita kemudian di follow-up sampai kondisi klinis stabil. Kondisi klinis stabil dapat dicapai antara hari ke-3 sampai ke-6 yang dinilai berdasarkan kriteria: tanda vital stabil dalam waktu 24 jam (suhu tubuh <37,80C, laju pernapasan ≤24 kali per menit, denyut jantung ≤100 kali per menit, tekanan darah sistolik ≥90 mmHg, SpO2 ≥90% atau PaO2 ≥60 mmHg pada oksigen ruang) , mampu mempertahankan intake oral, dan status mental normal (Mandell
et al. 2007).
7. Setelah tercapai kondisi klinis stabil, penderita diambil lagi darah vena untuk pemeriksaan kadar IL-6. Respons terapi setelah pemberian vitamin C diukur berdasarkan penurunan kadar serum IL-6 dan makin cepat tercapainya perbaikan klinis.
K. TEKNIK PEMERIKSAAN
1. Penilaian skor PSI
Subjek dicatat identitas, dilakukan anamnesis, pemeriksaan fisik, pemeriksaan darah rutin, kimia darah, elektrolit darah, analisis gas darah, dan
foto toraks, kemudian untuk pneumonia komunitas dihitung skor PSI berdasarkan PORT (lampiran 3)
2. Pemeriksaan kadar serum IL-6 serum
Media yang diteliti adalah darah vena yang pengambilannya dilakukan dua kali yaitu pada saat penderita pneumonia dinyatakan sebagai subjek penelitian dan saat tercapai kondisi klinis stabil. Pengambilan darah menggunakan tabung
serum separator tube (SST) yang pertama dilakukan ≤ 2 jam setelah penderita
masuk IGD (sebelum diberikan antibiotik) dengan volume darah kurang lebih 3 cc. Darah kemudian segera dikirim ke laboratorium Biomedik FK UNS apabila pengambilannya dilakukan pada saat jam kerja (hari Senin sampai Jum’at jam 08.00-15.00 WIB) untuk disentrifus dan diambil serumnya untuk diperiksa. Apabila pengambilan darah dilakukan di luar jam kerja laboratorium Biomedik FK UNS, maka darah dalam tabung SST disentrifus terlebih dahulu di laboratorium cito Patologi Klinik RS Dr. Moewardi dan disimpan dalam freezer bersuhu -60C sampai saatnya sampel dikirim ke laboratorium Biomedik FK UNS. Pengukuran kadar serum IL-6 menggunakan teknik ELISA, dengan satuan pg/ml.
Prosedur pemeriksaan IL-6:
- Semua reagen dan sampel ditempatkan pada suhu kamar sebelum digunakan dengan jumlah rangkap dua.
- Semua reagen dan standar kerja disiapkan sesuai petunjuk.
- Strip microwell plate yang berlebihan dihapus dari tepi plate, dikembalikan ke kantong foil berisi paket pengering, dan ditutup kembali.
- Ditambahkan 100 mikroliter (μL) assay buffer berisi presipitat. Diaduk rata sebelum dan selama digunakan.
- Ditambahkan 100 μL standar, sampel atau kontrol tiap plate. Ditutup dengan strip perekat yang disediakan, kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang.
- Diaspirasi dan dicuci 4 kali. Pencucian:
- Cairan dari plate dibersihkan dengan aspirasi atau membalik plate dan menuang isinya.
- Kelebihan cairan dihapus dengan memegang dan mengetuk plate secara terbalik pada handuk kertas sebanyak 5 kali.
- Plate diisi dengan 200 µL wash buffer menggunakan botol semprot, pipet
multi channel, dispenser, atau autowasher.
- Cairan dari plate dihapus dengan diaspirasi atau membalik piring dan menuang isinya.
- Ditambahkan 200 μL IL-6 conjugate pada setiap plate dan ditutup dengan strip perekat baru. Diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar.
- Ditambahkan 200 μL dari substrate solution untuk setiap plate. dan ditutup dengan strip perekat baru. Diinkubasi selama 20 menit di suhu ruang.
- Ditambahkan 50 μL stop solution pada tiap plate.
- Ditentukan optical density (OD) masing-masing plate dalam 30 menit menggunakan micro-plate reader yang disetel pada nilai 450 nm.
3. Lama perbaikan klinis
Lama perbaikan klinis merupakan lama hari penderita pneumonia mencapai perbaikan klinis, dihitung dengan cara lama perbaikan klinis ditotal dalam hitungan jam kemudian dibagi 24 jam, apabila sisanya <12 jam dibulatkan ke bawah sedangkan ≥12 jam dibulatkan ke atas. Penghitungan lama perbaikan klinis dimulai saat penderita pneumonia dinyatakan sebagai subjek penelitian.
L. ETIKA PENELITIAN
Penulis mengajukan persetujuan penelitian ke Panitia Kelaikan Etik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta sebelum dilakukan penelitian. Setiap subjek penelitian diberikan penjelasan yang benar dan terperinci tentang tujuan dan manfaat penelitian sebelum dilakukan prosedur penelitian, setelah subjek mengerti dan setuju mengikuti penelitian maka diminta menandatangani lembar persetujuan dan isian data penderita.
M. ANALISIS DATA
1. Uji Beda
Uji beda adalah hasil uji untuk melihat perbedaan sampel perlakuan dengan pemberian vitamin C dan sampel kontrol dengan pemberian plasebo. Penelitian ini menggunakan sampel berpasangan dengan uji parameter t test. Batas kemaknaan:
- nilai p > 0,05: tidak bermakna - nilai p ≤ 0,05: bermakna
- nilai p < 0,01: sangat bermakna 2. Korelasi
Korelasi merupakan suatu metode untuk mencari hubungan timbal balik antara dua variabel. Hubungan antara variabel numerik dan numerik akan dilakukan dengan uji korelasi Pearson, tetapi apabila syarat tidak terpenuhi maka menggunakan uji korelasi Spearman. Korelasi antara dua variabel dinyatakan positif apabila nilai satu variabel meningkat maka akan meningkatkan variabel lainnya, dan sebaliknya apabila satu variabel menurun maka akan menurunkan variabel lainnya.
Korelasi antara dua variabel atau lebih dinyatakan negatif apabila nilai satu variabel meningkat maka akan menurunkan variabel lainnya, dan sebaliknya apabila nilai satu variabel menurun maka akan meningkatkan variabel lainnya. Batas kemaknaan:
- nilai p ≤ 0,01 : terdapat korelasi sangat bermakna antara dua variabel yang diuji.
- nilai p ≤ 0,05 : terdapat korelasi yang bermakna antara dua variabel yang diuji. - nilai p > 0,05: tidak terdapat korelasi yang bermakna antara dua variabel yang
N. ALUR PENELITIAN
Gambar 20. Alur penelitian pengaruh vitamin C terhadap kadar serum IL-6 dan lama pencapaian perbaikan klinis penderita pneumonia.
Anamnesis , pemeriksaan fisik, laboratorium darah,
foto toraks Penderita datang di IGD
Pneumonia (komunitas dan
HCAP) Memenuhi kriteria
inklusi
Hitung skor PSI (untuk pneumonia komunitas)
Penjelasan, penawaran persetujuan (informed concern)
Setuju ikut penelitian Tidak setuju ikut
penelitian
Eksklusi Pemeriksaan IL-6 Penilaian klinis dan laboratorium
Antibiotik/terapi standar
Plasebo (NaCl 0,9% 100 mL sampai tercapai perbaikan
klinis) Vitamin C intravena 1000 mg/orang/hari
dalam NaCl 0,9% 100 mL (sampai tercapai perbaikan klinis)
Analisis statistik
Penilaian perbaikan klinis (kriteria klinis stabil),
pemeriksaan IL-6 Penilaian perbaikan klinis
(kriteria klinis stabil), pemeriksaan IL-6
