Memahami Urutan. Genom

Memahami Urutan

Kuliah Umum 22 Janu 22 Janu Habib R Laboratorium Genom

Genom

m BB Biogen ari 2013 ari 2013 Rijzaani

Manual Kehidupan

"Life DOES come

read

VisiGen on DN

n

with

instructions

,

them."

NA Sequencing

Gen vs. Genom

„ Gen:

„ Genetika (genetics)

„ 1 atau beberapa gen

„ zoom-in

„ Genom:

„ Genomika (genomics)

„ Banyak atau seluruh ge

„ zoom-out

-om & -omika

„ Genom (gen+kromoso 1920), genomika (1980 „ -om: obyek kajian, -om „ Arti: total atau keseluru „ genom+bioinformatika „ Genomika, metagenom epigenomika, proteomik nutrigenomika, farmako toksikogenomika, glikom „ http://omics.org

m, Prof. Hans Winkler, 0-an), -omika (1990-an)

ika: bidang kajian uhan (2000-an): mika, transkriptomika, ka, metabolomika, ogenomika, mika, ekspresomika ... g

-omika

„ “Omika adalah istilah u bidang ilmu sains dan t interaksi obyek informa 'om' [ ] Fokus utamanom . [...] Fokus utaman obyek informasi sepert 2) menemukan jalinan merekayasa jaringan d memahami dan meman pengaturan; dan 4) me dan sub-bidang -omika

„ omics.org

mum untuk sebuah

teknik yang mempelajari asi hayati dalam berbagai

nya adalah: 1) pemetaan nya adalah: 1) pemetaan

i gen, protein dan ligan; interaksi antar obyek; 3) an obyek untuk

nipulasi mekanisme

nggabungkan aneka -om a.”

Pengurutan Genom

„ Sanger, 1975 „ Berbasis kloning, PCR (gel/kapiler) „ 500-1000 pb

m Gen. 1

R dan elektroforesis

Sanger utk. Genom

„ Shotgun sequencing „ Genom bakteri Haemophilus influenzae „ 1,830,137
 pb „ 25.000
 potongan (50K reads) „ Program bionformatika utk.

merakit urutan genom utuh

Shotgun Sequenci

Gen Bacaa Berjenjang Bacaa Pera Ran Urutan

ing

nom an acak Seluruh Genom an acak akitan ngka Genom

Pengurutan Genom

„ 2005 (30 tahun setelah

m: Gen. 2

Pengurutan Genom

„ Next-generation seque „ Tanpa kloning! „ Pemain (kimia)( ) „ 454/Roche (pyrosequen „ Solexa/Illumina (reversi „ Solid/ABI (sequencing-b

m: Gen. 2

ncing (NGS) ncing) ible terminator) by-ligation)

Illumina/Solexa seq

„ P „ P „ P „ P

quencing

Pemotongan genom Penambahan adapter

„ Pustaka DNA genom

Pembentukan gugus

„ Perbanyakan potongan

genom pada flow cell lewat PCR

„ Solid-state cloning

Penyiapan Pustaka

„ Pemotongan Genom

„ Nebulizer (gas)

„ Sonicator (suara)

„ g-Tube (gaya sentrifuga

„ g Tube (gaya sentrifuga

„ Transposon (enzim)

a Genom

al) al)

Penyortiran ukuran

„ Proses pembentukan g DNA oleh mesin sekue panjang potongan DNA

n potongan

gugus dan pembacaan enser hanya efektif pada

Penempelan adaptter

„ Adapter untuk

manipulasi dalam proses lanjutan

„ Barcode, indeks

„ Pemilihan ukuran & kuantifikasi

cBOT

Pembentukan Gug

Penempelan potongan DNA dari pustaka genom ke flow

cell & perbanyakan molekul

DNA membentuk gugus 1000-an molekul melalui PCR

Pembacaan urutan

„ Illumina: pengurutan m (sequencing-by-synthe

n DNA

elalui sintesis sis, SBS)

Pembacaan urutan

Siklus 1 Siklus 2 Siklus 3 Siklus 4 Siklus 5, ... 1 2

n DNA

„ Bacaan 1: GCTGA „ Bacaan 2: AGCCG

„ 1 lajur flow cell =>

100-200 juta gugus/bacaan 200 juta gugus/bacaan

Pembacaan urutan

„ Single-end & Paired-e

„ Bacaan ujung tunggal

n DNA

nd reads

Pengurutan Genom

„ Tanpa perbanyakan po

„ Langsung dari 1 molek

„ Nanoteknologi, semikon H li „ Helicos „ Ion Torrent „ Mendeteksi pelepasan dNTP oleh polimerase „ Pacific Biosciences

„ Single molecule real tim

m: Gen. 3

otongan DNA!

kul DNA

nduktor, sensor plasma

proton saat penyisipan

Perbandingan

„ Sanger 8 „ Roche / 454 4 „ AB / SOLiD 2x „ Illumina / Solexa 2x 800 nt ~80 kb 450 nt 0.5 Gb 50 nt 60 Gb 100 nt 300 Gb

bases 1 Gb 10 Gb AB sho ( 100 Gb

Perbandingan

rea per machine run 10 bp 10 1 Gb 100 Mb 10 Mb 1 Mb B/SOLiDv3, Illumina/GAII ort-read sequencers 454 GS FLX 10+Gb in 50-100 bp reads, >100M reads, 4-8 days)

From John McPherson, OICR

ad length

1,000 bp 00 bp

ABI capillary sequencer

454 GS FLX pyrosequencer

(100-500 Mb in 100-400 bp reads, 0.5-1M reads, 5-10 hours)

(0.04-0.08 Mb in 450-800 bp reads, 96 reads, 1-3 hours)

Perakitan urutan g

Selayang pandang proses pembacaan selur

Reads PotonganDNA genom Contigs Scaffolds Pemetaan scaffolds Peta genom

enom

Gambaran menyeluruh dari semua

reads yang saling bersambung dan

membentuk sebuah contig.

Perakitan urutan g

Tampilan dekat: urutan basa dari tiap read

(bacaan) dan posisinya dalam contig

(sambungan).

Tampilan dekat: urutan basa dari contig yang

terbentuk.

Istilah

„ Read (bacaan) „ Contig (sambungan) „ Scaffold (rangka) „ Scaffold (rangka) „ Gap (celah)

„ Celah fisik dan celah ur

„ Coverage (liputan) „ Depth (kedalaman)

„ Quality score (skor kua

rutan

Coverage depth (d

„ Coverage is the term u to which a large assem instances of smaller ob in which coverage is m read coverage of a gen read coverage of a gen contig

„ Ukuran genom 1 Mb

„ Sekuensing: 1 juta bac „ Liputan: panjang total b

„ (1 juta X 100 pb) / 1 juta

alamnya liputan)

sed to quantify the extent mbly object is covered by

bjects. The three contexts ost often discussed are nome read coverage of a nome, read coverage of a

aan, 100 pb

bacaan/ukuran genom

Panjang potongan genom:

n

L

Panjang potongan genom: jumlah bacaan: n

panjang tiap bacaan: l

Definisi: Coverage C = n

Berapa liputan yang cukup? Model Lander-Waterman

Dengan asumsi sebaran C=10 akan menghasilkan nukelotida. L C L L n l / L n:

bacaan yang seragam, n 1 celah per 1 juta

Q30

„ Skor kualitas basa „ Skala phred „ QV = - 10 * log10(Pe) P g ( ) „ Pe= kemungkinan salah. „ Q30: kemungkinan salah 1/1000 „ 99.9% benar

Phred Quality P_error(obs. base)

3 50.12% 5 31.62% 10 10.00% 15 3.16% 20 1.00% 25 0.32% 30 0.10% 35 0.03% 40 0.01%

Hasil pembacaan

@HWI_0023:1:1:16103 TTATGTGTTTATTACGTTN TTTACGGGTTATTTA + + hhhhhhghhhhhhghdeeB hhghfffaehghhcX

„ Berkas format Fastq

„ Setiap basa memiliki ko

3:1200 N:0:1

NTTTG...AATGTTTA

Bee__...hfhhghhg

Penerapan

„ Pengurutan DNA, anali analisa ekspresi RNA, variasi DNA struktural, protein-DNA (Chip-Seq analisa small RNA de analisa small RNA, de metatranskriptomika, se „ Mesin sama, pendekata

„ Penyiapan sampel/pust

„ Analisa data/bioinforma

isa pengaturan gen, penemuan SNP dan

GWAS, analisa interaksi q), analisa DNA metilasi,

novo metagenomika novo metagenomika, ekuensing amplikon,... aan berbeda dalam:

taka genom atika

Genomika Fungsio

„ Sekuen genom + „ Koleksi mutan „ Penyisipan T-D t ki i mutagen kimia

„ Profil ekspresi gen men

„ Microarray, ES

„ Sekuen genom lain

„ Plasma nutfah

„ Anotasi

„ Prediksi struktu

ontology), seku

onal

DNA, penandaan transposon, i

awi

nyeluruh

ST, pustaka cDNA, transkriptom

terkait, spesies lain

ur dan fungsi gen (gene uen pengatur

Anotasi

>contig-1 GAAAGATCGCTGGTTA CTCTAATCACTTTTTT TCGCGGTTTCTGCGG ATCCGAGTTAAACGC AAGAACCACAGAAAA CGTCGTTTCTCGTTCT

APA

CAACCGAATATACAGC TTCTGCTCTGTAATCGT GCCATAAAATAAAGTAA CTGATAGTCGCGCCTG AAACAGAAAATATCTCC TCGTTTCCG

A INI?

Anotasi

>gi|359806297Glycine ma DATE 3A-like (LOC100 ATGGACCCTCTTGTCAT AGATGTTTTGGAGCC TCTCTTA FEATURES Location/Q source 1..522 /organism="Glycin /chromosome="18 gene 9..122 /note="protein HE ax protein HEADING 815541) TTGGACGTGTAGTAGG CTTTCACTAGTTGCGTC Qualifiers ne max" 8"

Anotasi

„ Memahami urutan geno „ Urutan genom (sambun

„ Tingkat DNA:g „ Dimana exon, translasi, prom „ Tingkat protein: „ Motif, domain, „ Tingkat proses: „ Seluler, lokasi biokimia om ngan/rangka)

intron, situs awal transkripsi, moter, homologi

situs aktif, enzim

Penerapan

„ De novo Sequencing

„ Perakitan genom tanpa

„ Draft vs. Finished „ Contig (sambungan) da „ Contig (sambungan) da panjang „ Chromosome „ Targeted Resequencin

„ Fokus pada daerah tert

„ Multiplex (sekali perunu

rujukan

an scaffold (rangka) yang an scaffold (rangka) yang

g

tentu: exon, motif, family utan, banyak sampel)

Penerapan

„ Epigenetika

„ Metilasi DNA (ChipSeq)

„ Modifikasi histon

„ Kemudahan akses krom

„ Metagenomika „ De novo sequencing sa „ Keragaman 16S DNA „ metatranskriptom ) matin ampel lingkungan

Contoh

„ A complete reference g indeed a valuable reso improvement is finding variation.

„ Urutan genom rujukan i

pemuliaan tanaman ada memanfaatkan variasi g

genome sequence is

urce, but the key to crop and exploiting genetic

itu berharga, tetapi kunci alah menemukan dan

Contoh

A map of rice genome va of cultivated rice „ Nature. 20 S i „ Sequencing: „ 1529 genom padi: „ 446 Oryza rufip „ 1083 Oryza sa „ 15 genom pembanding coverage) „ 1 O. Rufipogon (100X c outgroug (50X coverage

ariation reveals the origin

012 Oct 25;490(7421):497-501.

pogon (paired-end, 2X coverage) ativa (paired-end, 1X coverage)

(outgroup, wild oryza 3X

coverage, de novo), 1 e)

Metode

„ Pemetaan thd. genom

„ Identifikasi SNP

„ Genetika populasi

„ GWAS

„ Populasi pemetaan, BIL

„ Asosiasi fenotipe

„ Anotasi

„ BLAST, prediksi model

rujukan

L & CSSL

Contoh

„ Resequencing 50 acce wild rice yields markers agronomically importan

„ Xun Xu, Susan McCouc

„ nature biotechnology V JANUARY 2012 „ Cultivar: 40 „ Japonica: 24 „ Indica: 12 „ Wild type: 10 „ Rufipogon: 5 „ Nivara: 5

essions of cultivated and s for identifying

nt genes

ch et al

Hasil

„ Jutaan SNP teridentifik „ Menguak proses dome

„ Japonica dan indica sec

didomestikasi

„ Japonica bernenek moy

China

„ Penemuan gen

„ Ribuan gen terseleksi s

mungkin penting secara

„ Penemuan marka

„ SNP untuk pemuliaan p

kasi

estikasi padi:

cara independen

yang O. Rufipogon dari

selama proses domestikasi, a agronomis