ANALISIS HISTAMIN PADA BERBAGAI JENIS IKAN
PELAGIS DENGAN METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)
SILVIA SULISTIAWATI
JURUSAN TEKNOLOGI PENGOLAHAN HASIL PERIKANAN POLITEKNIK PERTANIAN NEGERI PANGKAJENE DAN KEPULAUAN
ANALISIS HISTAMIN PADA BERBAGAI JENIS IKAN
PELAGIS DENGAN METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)
SILVIA SULISTIAWATI
Tugas Akhir
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Ahli Madya Perikanan
Pada
Jurusan Teknologi Pengolahan Hasil Perikanan
POLITEKNIK PERTANIAN NEGERI PANGKAJENE DAN KEPULAUAN 2014
Judul Tugas Akhir : Analisis Histamin pada Berbagai Jenis Ikan Pelagis dengan Metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Nama Mahasiswa : Silvia Sulistiawati NIM : 1122121
Program Studi : Teknologi Pengolahan Hasil Perikanan Tanggal lulus : 20 Agustus 2014
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
DR. Ir. Sitti Nurmiah M.Si Muh. Ali Arsyad S.Pi, M.Si Pembimbing I Pembimbing II
Diketahui Oleh
Ir. Andi Asdar Jaya M.Si Rivaldi Badron ST, M.Si
Direktur Ketua Jurusan
HALAMAN PERSETUJUAN PENGUJI
Judul Tugas Akhir : Analisis Histamin pada Berbagai Jenis Ikan Pelagis dengan Metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Nama Mahasiswa : Silvia Sulistiawati NIM : 1122121
Program Studi : Teknologi Pengolahan Hasil Perikanan Tanggal lulus : 20 Agustus 2014
Disahkan oleh : Tim Penguji
1. DR. Ir. Sitti Nurmiah M.Si ( ...)
2. Muh. Ali Arsyad S.Pi, M.Si ( ...)
3. Rivaldi Badron ST, M,Si (...)
4. Ernawati Jassin S.Si, M.Si ( ...)
i
RINGKASAN
SILVIA SULISTIAWATI (1122121). Analisis Histamin pada Berbagai Jenis Ikan Pelagis dengan Metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dibimbing oleh SITTI NURMIAH dan MUH. ALI ARSYAD.
Histamin adalah senyawa yang terdapat pada daging ikan pelagis atau ikan yang telah mengalami penurunan mutu yang di dalam dagingnya terdapat kadar histidin yang tinggi. Histamin di dalam daging ikan dihasilkan dari pemecahan histidin oleh enzim histidine dekarboksilase. Melalui proses dekarboksilasi (pemotongan gugus karboksil) dihasilkan histamin. Salah satu proses analisis kandungan histamin pada daging ikan yaitu dengan melakukan pengujian kadar histamin, keberhasilan analisis ini dipengaruhi oleh hasil waktu retensi dan analisis standar histamin sebelumnya.
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kadar histamin yang terkandung pada beberapa jenis daging ikan pelagis yang diuji, analisis ini dilakukan dengan metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Berdasarkan pengujian yang dilakukan diperoleh data kandungan histamin pada daging ikan
ikan wahoo sebesar 12.22 ppm, ikan marlin 14.63 ppm, ikan mahi-mahi 27.44 ppm, hasil ini menunjukkan kadar yang dibawah standar batas ambang
maksimal kandungan histamin yang masih dapat ditoleransi untuk dikonsumsi yaitu maksimal sebanyak < 100 ppm. Hasil ini menunjukkan bahwa ikan tersebut masih aman untuk dikonsumsi.
Kata kunci : High Performance Liquid Chromatography (HPLC), histamin, ikan pelagis.
ii
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kita panjatkan kehadirat Allah SWT, karena limpahan Rahmat dan Hidayah-Nya lah sehingga tugas akhir yang berjudul “analisis kandungan histamin pada berbagai jenis ikan dengan metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dapat terselesaikan, tidak lupa pula kami kirimkan Salam dan Salawat kepada junjungan Nabi Besar Muhammad SAW beserta para keluarganya.
Laporan tugas akhir ini bertujuan untuk menentukan kadar histamin pada berbagai jenis ikan dengan metode pengujian High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Tugas Akhir ini tidak dapat terselesaikan tanpa adanya dukungan dan bantuan dari berbagai pihak serta do’a dan semangat dari orangtua penulis. Oleh karena itu penulis juga ingin mengucapkan banyak terima kasih kepada pihak-pihak yang telah ikut membantu dalam penyusunan laporan ini, yakni:
1 Ibu Dr. Ir. Sitti Nurmiah M.Si selaku Dosen Pembimbing I dan bapak Muh. Ali Arsyad S.Pi., M.Si selaku Dosen Pembimbing II.
2 Bapak Rivaldi Badron ST., M.Si, selaku Ketua Jurusan Teknologi Pengolahan Hasil Perikanan Politeknik Pertanian Negeri Pangkajene dan Kepulauan.
3 Bapak dan Ibu dosen di Politeknik Pertanian Negeri Pangkajene dan Kepulauan, terkhusus pada Teknologi Pengolahan Hasil Perikanan.
4 Bapak Ir. Fatkhur Rozaq selaku kepala UPT. Laboratorium Pengendalian dan Pengujian Mutu Hasil Perikanan (LPPMHP) Surabaya.
5 Staf analis histamin Aswari Syafroni, S.Pi yang telah banyak membantu dalam memberikan informasi untuk keperluan penyusunan tugas akhir ini.
6 Seluruh mahasiswa Politeknik Pertanian Negeri Pangkajene dan Kepulauan terkhusus teman-teman seperjuangan jurusan TPHP dan teman-teman di UKM Taekwondo PPNP.
iii
Penulis menyadari bahwa penulisan laporan tugas akhir ini masih memiliki banyak kekurangan dan sangat jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, saya sangat mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun untuk memperbaiki penyusunan laporan tugas akhir ini.
Pangkep, 12 Mei 2014
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL iv DAFTAR GAMBAR v DAFTAR LAMPIRAN vi I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang 11.2 Tujuan dan Kegunaan 2
II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Deskripsi Ikan 3
2.2 Proses Kemunduran Mutu Ikan 5
2.3 Histamin 7
2.4 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 11
III METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat 18
3.2 Alat dan Bahan 18
3.3 Metode Pengambilan Data 18
3.4 Prosedur Analisa 19
3.5 Prosedur Kerja HPLC 20
3.6 Proses Pembacaan Kadar Histamin 20
IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil 22
4.2 Pembahasan 22
V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan 23
5.2 Saran 23
DAFTAR PUSTAKA 24
LAMPIRAN 26
iv
DAFTAR TABEL
Halaman
v
DAFTAR GAMBAR
Halaman 2.1 Ikan Wahoo 3 2.2 Ikan Marlin 4 2.3 Ikan Mahi-mahi 52.4 Mekanisme Reaksi Histidin Menjadi Histamin 10 2.5 Alat High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 13 2.6 Mekanisme kerja High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 13 2.7 Posisi Penyuntikan Sampel 16
vi DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Dokumentasi Kegiatan 26
1
I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Keamanan pangan merupakan isu pangan yang selalu menjadi tuntutan utama konsumen baik di pasar lokal, nasional, maupun internasional. Para pelaku industri pangan wajib meresponnya dengan menerapkan sistem jaminan mutu dan keamanan hasil perikanan. Demikian pula di perdagangan sektor perikanan, saat ini tuntutan akan jaminan keamanan pangan dengan segala sistem dan pendukungnya semakin dipertanyakan oleh masyarakat dunia. Nilai kesegaran atau mutu ikan sebagai bahan mentah ataupun sebagai tambahan dalam pengolahan makanan lebih lanjut sangat ditentukan oleh baik buruknya penanganan ikan sejak mulai ditangkap. Penurunan kesegaran ikan dapat diminimalisasi dengan proses pengawetan dan pengolahan, namun proses penurunan kesegarannya masih mungkin terjadi hanya kecepatannya berbeda. Penurunan tingkat kesegaran ikan itulah dapat dilihat dari parameter pengujian kadar histamin.
Histamin adalah senyawa turunan dari asam amino histidin yang banyak terdapat pada daging ikan yang merupakan hasil dari aktivitas enzim kemudian dilakukan oleh bakteri yang mempunyai aktivitas dekarboksilasi histidin (histidine decarboxylase positive). Histamin ini dapat menyebabkan keracunan berupa gejala mual, muntah, perut mengejang, diare dan sakit kepala atau termasuk gatal-gatal, kulit berbintik merah yang disertai demam. Namun Sakit yang ditimbulkan oleh histamin biasanya tidak berlangsung lama dan merupakan sakit yang ringan atau sering disebut dengan alergi (Kim et al 2002). Demikian pula Food and Drug Administration melaporan bahwa salah satu penyebab refusal terhadap produk-produk perikanan dari Indonesia adalah adanya kandungan histamin yang melebihi 100 ppm (FDA 2009). Maka perlu dilakukan pengujian untuk mengetahui kadar histamin yang terkandung pada daging ikan.
2 1.2 Tujuan dan Kegunaan
Tujuan penelitian ini adalah menentukan kadar histamin pada ikan wahoo, ikan marlin dan ikan mahi-mahi menggunakan metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
Kegunaan penelitian ini sebagai informasi tentang analisis kandungan histamin pada ikan dengan metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
3
II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Deskripsi Ikan 2.1.1 Ikan Wahoo
Wahoo (Acanthocybium solandri), yang masih keluarga dekat dengan king fish merupakan spesies ikan laut yang lebih dikenal sebagian masyarakat Indonesia dengan sebutan tenggiri, disebabkan bentuknya yang menyerupai ikan tenggiri dengan warna tubuh abu-abu terang. Namun ikan wahoo memiliki perbedaan warna tubuh abu-abu dengan garis-garis vertikal hijau/biru di tubuhnya serta bentuk giginya yang membedakan ikan wahoo dari ikan tenggiri. Wahoo merupakan ikan jenis pemangsa (predator) yang di habitatnya bisa hidup berkumpul atau sendiri-sendiri di wilayah perairan tropis dan sub tropis dengan ukuran rata-rata 5-20 kg, ikan ini biasa berada di tubiran karang dan selalu berpindah tempat, bermigrasi ke tempat-tempat yang mudah dijumpai.
Adapun klasifikasi ikan wahoo menurut Lacepède 1801 adalah sebagai berikut:
Filum : Animali Sub Filum : Chordata Class : Actinopterygii Ordo : Perciformes Famili : Scombridae Spesies : A. solandri Genus :Scomberomorus
4 2.1.2 Ikan Marlin
Ikan marlin merupakan ikan yang termasuk “scombroid fish”, yang terdiri
dari ±5 spesies dan hidup di daerah yang bersuhu tropis di seluruh dunia, di kedalaman 400-500 meter di bawah permukaan laut dan mengadakan migrasi
(ruaya) untuk bertelur. Badannya berbentuk cerutu dan panjangnya kira-kira 14.5 ft (4.5 meter) dan beratnya mencapai 1190 pounds (540 kg) untuk marlin
terbesar yang pernah ditemukan. Ikan ini termasuk ikan perenang cepat, dan termasuk ikan pemakan daging atau karnivora (Abdiawan 2008).
Klasifikasi Ikan Marlin menurut (Abdiawan 2008) adalah : Kingdom : Animalia
Filum : Chordata Sub filum : Vertebrata Class : Asteichthyes Ordo : Perciformer Famili : Scombroidei Genus : Xiphias
Gambar 2.2 Ikan Marlin
2.1.3 Ikan Mahi-mahi
Ikan mahi-mahi (Hippurus coryphaena) dikenal juga dengan nama dolphin. Ikan ini merupakan salah satu ikan pelagis dan salah satu komoditi dari perairan Indonesia yang termasuk ikan buas. Ikan ini ditemukan perairan tropis dan
subtropis di seluruh dunia, berat rata-rata yang berhasil ditangkap adalah 7 sampai 13 kg, jarang melebihi 15 kg. Ikan ini mempunyai warna yang cantik,
5
dewasa memiliki dahi yang menonjol di atas kepala, sedangkan betina memiliki kepala yang bulat.
Di Indonesia ikan ini sering disebut ikan lemadang, ikan ini banyak terdapat di wilayah perairan Maluku, bagian Utara Jawa, bagian Selatan Jawa, dan perairan Sulawesi.
Gambar 2.3 Ikan Mahi-mahi
2.2 Kemunduran Mutu Ikan
Kemunduran mutu ikan tidak dapat dihindari sebab ikan merupakan produk pangan yang high perishable (mudah rusak) sehingga memerlukan penanganan khusus. Proses kemunduran ikan dimulai sejak penangkapan, pengolahan sampai penyajian. Kemunduran mutu ikan berlangsung cepat di daerah beriklim tropis dengan suhu dan kelembaban tinggi ditambah dengan proses penangkapan yang tidak baik dapat menyebabkan ikan mengalami kemunduran mutu. Menurut (Junianto 2003), Kemunduran mutu ikan digolongkan menjadi 4 tahap yaitu
prerigor, rigormortis, postrigor dan pembusukan oleh bakteri. Sedangkan (Gram & Dalgaard 2002), kemunduran mutu pada ikan disebabkan adanya reaksi
kimia dan pembusukan oleh mikroba. Jika dilihat dari keberadaan kandungan dan besarnya unsur biokimia makro yang terdapat di dalam tubuh ikan, perubahan utama yang terjadi pada proses kemunduran mutu ikan umumnya bersumber dari perubahan atau kerusakan komponen protein dan lemak yang terdapat dalam tubuh ikan.
Proses kemunduran mutu ikan selama penyimpanan diawali dan didominasi oleh proses autolisis dan kemudian dilanjutkan oleh perubahan akibat aktivitas bakteri (Mahmoud et al 2006). Adapun tahap kemunduran mutu ikan adalah sebagai berikut :
6 2.2.1 Prerigor
Tahap prerigor merupakan perubahan yang pertama kali terjadi setelah ikan mati. Fase ini ditandai dengan pelepasan lendir cair, bening, atau transparan yang menyelimuti seluruh tubuh ikan. Proses ini disebut hiperemia yang berlangsung 2-4 jam. Lendir yang dikeluarkan ini sebagian besar terdiri dari glukoprotein dan musin yang merupakan media ideal bagi pertumbuhan bakteri (Junianto 2003).
Tahap prerigor terjadi ketika daging ikan masih lembut dan lunak. Perubahan awal yang terjadi ketika ikan mati adalah peredaran darah berhenti sehingga pasokan oksigen untuk kegiatan metabolisme berhenti. Di dalam daging ikan mulai terjadi aktivitas penurunan mutu dalam kondisi anaerobik. Pada fase ini terjadi penurunan ATP dan keratin fosfat melalui proses aktif glikolisis. Proses glikolisis mengubah glikogen menjadi asam laktat yang menyebabkan terjadinya penurunan pH.
2.2.2 Rigormortis
Morkore et al 2006 menyatakan bahwa fase rigormortis adalah tahap yang terjadi ketika ikan mengalami kekakuan (kekejangan). Fase ini ditandai dengan terjadinya penurunan pH akibat akumulasi asam laktat. Faktor yang mempengaruhi lamanya fase rigormortis yaitu jenis ikan, suhu, penanganan sebelum pemanenan, kondisi stress pra kematian, kondisi biologis ikan, dan suhu penyimpanan prerigor (Skjervold et al. 2001). Nilai pH daging ikan selama fase rigormortis turun dari 7-6. Fase rigormortis sangat penting dalam industri perikanan karena fase ini merupakan tahapan sebelum terjadinya kebusukan oleh mikroba. Selama berada dalam tahap ini, ikan masih memiliki kualitas yang baik dan diterima oleh konsumen. Fase ini dihindari oleh industri fillet karena daging ikan yang kaku sulit untuk diproses.
2.2.3 Postrigor
Fase postrigor merupakan fase awal kebusukan ikan. Fase ini terjadi ketika daging dan otot ikan secara bertahap menjadi lunak kembali. Hal ini disebabkan terjadinya degradasi enzimatik di dalam daging ikan (Papa et al. 1997 diacu dalam Ocano-Higuera et a.l 2011). Proses autolisis berlangsung pada tahap postrigor, disebabkan adanya enzim-enzim endogenous yang ada di dalam otot ikan (Ocano-Higuera et al 2009). Penurunan nilai pH menyebabkan enzim-enzim dalam
7
jaringan otot menjadi aktif. Katepsin yaitu enzim proteolitik yang berfungsi menguraikan protein menjadi senyawa sederhana, merombak struktur jaringan
protein otot menjadi lebih longgar sehingga rentan terhadap serangan bakteri.
Hal ini mengakibatkan daging ikan menjadi lunak kembali (Iriyanto & Giyatmi 2009).
2.2.4 Pembusukan oleh bakteri
Mikroorganisme dominan yang berperan penting di dalam proses penurunan kesegaran ikan adalah bakteri. Dekomposisi berjalan intensif, khususnya setelah ikan melewati fase rigormortis, pada saat jaringan otot longgar terisi oleh cairan (Irianto & Giyatmi 2009).
Bakteri mengeluarkan getah pencernaan, enzim yang merusak dan menghancurkan jaringan. Bakteri pada daging menyebabkan perubahan bau dan rasa yang pada mulanya terasa masam, beraroma seperti rumput atau asam. Bau dan rasa ini dapat berubah secara bertahap menjadi pahit atau sulfida serta dapat berubah menjadi ammonia pada tahap akhirnya. Selain perubahan bau dan rasa, bakteri menyebabkan perubahan tampilan dan ciri fisik lendir. Lendir pada kulit dan insang dapat berubah dari yang biasanya tampak jernih dan berair menjadi keruh dan kehitaman. Warna kulit ikan hilang dan menjadi tampak pucat dan pudar. Lapisan perut menjadi pucat dan hampir lepas dari dinding bagian dalam tubuh (DKP & JICA 2008).
2.3 Histamin
Histamin adalah racun yang terdapat pada produk perikanan yang dapat menyebabkan keracunan dengan istilah Histamin Fish Poisoning (HFP). Hal ini dikarenakan daging ikan memiliki tingkat asam amino histidin yang tinggi dan secara alami mengalami perubahan dari histidin menjadi histamin akibat adanya aktivitas bakteri. Histamin merupakan senyawa turunan dari asam amino histidin yang banyak terdapat pada ikan. Asam amino ini merupakan salah satu dari sepuluh asam amino esensial yang dibutuhkan oleh anak-anak dan bayi tetapi bukan asam amino esensial bagi orang dewasa. Di dalam tubuh kita, histamin memiliki efek psikoaktif dan vasoaktif. Efek psikoaktif menyerang sistem saraf transmiter manusia, sedangkan efek vasoaktif-nya menyerang sistem vaskular.
8
Pada orang-orang yang peka, histamin dapat menyebabkan migrain dan meningkatkan tekanan darah.
Histamin tidak membahayakan jika dikonsumsi dalam jumlah yang rendah. Keracunan ini biasanya akan timbul karena tingginya kadar histamin yang terdapat pada ikan yang kita konsumsi. Menurut Food and Drug Administration (FDA) 2001, keracunan histamin akan berbahaya jika seseorang mengkonsumsi ikan dengan kandungan histamin 50 mg/100 g ikan. Sedangkan kandungan histamin sebesar 20 mg/100 g ikan, terjadi karena penanganan ikan yang tidak hiegenis. Batas ambang maksimal kandungan histamin yang masih dapat ditoleransi untuk dikonsumsi maksimal sebanyak < 100 ppm, namun pada beberapa orang yang mengkonsumsi ikan dengan kandungan histamin 50 ppm ada juga yang mengalami gejala keracunan seperti gatal-gatal, pusing, mual bahkan muntah. Jika kadar histamin pada ikan sudah mencapai bahkan melebihi 100 ppm maka ikan hampir dipastikan tidak layak untuk dikonsumsi karena dapat menimbulkan alergi atau gejala keracunan pada konsumen yang memakannya. Gejala keracunan yang disebabkan oleh histamin umumnya dimulai 1 jam setelah masuknya toksin. Gejala tersebut berupa mual, muntah, perut mengejang, diare dan sakit kepala. Gejala lain yang timbul akibat racun ini yaitu gatal-gatal, kulit berbintik-bintik merah yang disertai demam (Kim et al. 2002).
2.3.1 Pembentukan histamin pada daging ikan
Tingginya kandungan histidin bebas pada daging ikan berkorelasi positif terhadap kandungan histamin pada daging ikan. (Yoshinaga & Frank 1982) menyatakan bahwa kandungan histamin pada daging ikan menyebar secara tidak merata.
Selain histidin bebas yang terdapat pada daging ikan, kandungan histamin juga dipengaruhi oleh aktivitas enzim histidine decarboxylase yang terdapat pada bagian intestinal ikan. Namun pada umumnya aktivitas dekarboksilasi histidin menjadi histamin lebih banyak dilakukan oleh bakteri dari pada oleh enzim dari ikan itu sendiri. Bakteri yang mampu merombak histidin menjadi histamin adalah bakteri histidin decarboxylase positif yang juga mempunyai kemampuan menghasilkan enzim histidine decarboxylase (Yoshinaga & Frank 1982). Histamin dibentuk oleh bakteri sebagai hasil metabolit sekunder untuk
9
penyeimbang kondisi lingkungan yang semakin asam bagi pertumbuhannya. Bakteri yang dapat menghasilkan histamin adalah Morganella morganii, Lactobacillus buchneri, Clostridium perfingens, Micrococcus SP, Klesbiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Vibrio anguillarum dan Hafnia alvei (Kim et al. 2002).
Pertumbuhan bakteri dan pembentukan histamin pada ikan segar dapat dihambat dengan menggunakan pendinginan pada suhu dibawah 4oC. Perombakan histidin menjadi histamin berlangsung secara intraseluler. Histidin bebas masuk ke dalam sel bakteri melalui sistem transportasi aktif. Masuknya histidin bebas yang bermuatan positif kedalam sel menyebabkan proton gradien sehingga menimbulkan energi. Proses perombakan histidin menjadi histamin juga menimbulkan energi pada histamin pathway. Namun besarnya energi yang dihasilkan dari proses pembentukan histamin belum diketahui secara pasti. Selain sebagai penghasil energi, histamin yang disekresikan ke luar sel akan menyebabkan naiknya pH lingkungan karena histamin bersifat alkalis (basa). Sehingga kondisi lingkungan yang semakin asam akibat proses dekomposisi
maupun proses fermentasi dapat dielimasi dengan adanya histamin (Molenaar et al. 1993).
Daging merah dan daging putih pada ikan
Penyebab utama antara daging putih dan daging merah adalah kandungan pigmennya, dimana mioglobin menjadi pigmen utama yang terdapat pada daging merah (Winarno 1984). Menurutnya myoglobin mirip dengan hemoglobin berbentuk lebih kecil, yaitu kira-kira satu per empat bagian dari besar hemoglobin. Satu molekul myoglobin terdiri dari satu rantai polipeptida yang terdiri dari 150 buah asam amino.
Berdasarkan sifat fisiknya, myoglobin merupakan bagian dari protein sarkoplasma daging, bersifat larut dalam air dan laruta garam encer, beberapa faktor yang mempengaruhi jumlah hemoglobin dan myoglobin pada daging antara lain tingkat aktivitas jaringan, suplai darah, tingkat kebutuhan oksigen serta umur dan spesies. Pada jenis warna daging ikan, daging putihlah yang tinggi histaminnya sedangkan daging yang merah jauh lebih sedikit. Untuk konsumsi manusia daging merah lebih aman daripada daging putihnya bila dipandang dari segi histamin.
10
Mengapa daging merah kecil kandungan histaminnya, hal itu disebabkan daging merah tinggi kandungan trimetil amina oksida (TMAO) yang berfungsi menghambat proses terbentuknya histamin (Winarno, 1993)
2.3.2 Perubahan histidin menjadi histamin
Gambar 2.4 Mekanisme reaksi histidin menjadi histamin
Di dalam proses pembusukan oleh bakteri, protein daging ikan terurai menjadi komponen penyusunnya yaitu asam amino. Asam amino histidin yang semula berada dalam bentuk terikat sebagai protein kemudian menjadi bebas dan diubah oleh bakteri dari kelompok Enterobacteriaceae menjadi histamin melalui proses yang disebut dekarboksilasi atau pembebasan gugus karboksil. Pengubahan ini memerlukan ensim dekarboksilase yang hanya dimiliki oleh bakteri tertentu dalam kelompok Enterobacteriaceae, antara lain Morganella, Klebsiella dan Hafnia, dan terjadi pada suhu 4,10˚C atau lebih. Pembentukan histamin di dalam jaringan daging ikan seiring dengan penambahan jumlah bakteri pembentuk histamin pada ikan tersebut. Semakin banyak kandungan bakteri pada ikan maka kemungkinan kandungan histamin semakin besar. Sebagian besar bakteri pembentuk histamin pada ikan berasal dari kulit, insang, dan bagian intestinal ikan sebagai normal flora.
Kemampuan bakteri untuk tumbuh dan membentuk histamin pada daging ikan sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan dan media tempat tumbuh. Suhu yang optimum untuk pertumbuhan dan pembentukan histamin pada beberapa bakteri berkisar antara 25-38oC. Pada spesies ikan yang berbeda, jenis bakteri yang membentuk histamin juga berbeda.
11 2.4 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir
tahun 1960 dan awal tahun 1970. Kromatografi cair berperforma tinggi High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu teknik
kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi dengan tekanan sampai 400 atm. HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu, dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.
2.4.1 Kegunaan dari HPLC
1 HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
2 Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3 Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4 Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
5 Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
6 Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
7 Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
2.4.2 Kelebihan dan Kekurangan dalam Penggunaan HPLC
Penggunaan HPLC sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:
1 Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi.
12
2 Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan analisis.
3 Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi. 4 Kolom dapat digunakan kembali.
5 Waktu analisa cukup singkat.
6 HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
7 Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya. 8 Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar. Kelemahan dari alat HPLC antara lain:
1 Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
2 Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
3 Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.
2.4.3 Derivatisasi pada High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah :
1 Meningkatkan deteksi.
2 Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik.
3 Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik. 4 Menstabilkan analit yang sensitif.
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %) produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi.
13 2.4.4 Prinsip Dasar dan Prinsip Kerja HPLC
Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya. Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia (analit) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detektor (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang terhubung on-line dengan alat tersebut.
Gambar 2.5 Alat High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Gambar 2.6 Mekanisme kerja High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
14
Fase Normal HPLC
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
Fase Balik
Fase balik ukuran kolom sama tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Air mengandung buffer atau garam untuk membantu dalam pemisahan komponen analit. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.
Wadah Fase Gerak dan Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel, untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang
15
analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril, untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.
Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 6000 psi sampai 10.000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit, untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 ml/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tempat Penyuntikan Sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Injeksi sample seluruhnya otomatis. Terjadi pada tingkat dasar dan jauh lebih rumit, karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.
16 Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel
Gambar 2.7 Posisi Penyuntikan Sampel Kolom dan Fase Diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
1 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
2 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
3 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
17
Interpretasi output dari detektor
1 Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
2 Penggunaan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh (sepanjang dilakukan kontrol terhadap kolom).
18
III METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penulisan tugas akhir ini berdasarkan pengujian yang dilakukan selama 3 bulan di UPT. Laboratorium Pengendalian dan Pengujian Mutu Hasil Perikanan (LPPMHP) Surabaya Jawa Timur.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam pengujian kadar histamin adalah : 1 Box sampel 2 Rak tabung 3 Timbangan analitik 4 Baki 5 Spatula 6 Pisau 7 Tabung centrifuge 8 Centrifuge refrigerated 9 Vortex 10 Absekjon 11 Sonics 12 Gelas ukur 13 Tabung ukur 10ml 14 Mikrotup 15 Tabung vial 16 Blender 3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam pengujian kadar histamin adalah ikan wahoo, ikan marlin, ikan mahi-mahi, larutan Ultrat Pure Water (UPW), larutan standar, larutan metanol 75% 20ml, larutan NaH2PO4, larutan NaOH.
3.3 Metode Pengambilan Data
Metode pengambilan data yang digunakan dalam penyusunan tugas akhir ini adalah berdasarkan hasil pengujian di UPT. Laboratorium Pengendalian dan Pengujian Mutu Hasil Perikanan (LPPMHP) Surabaya Jawa Timur dengan berperan aktif pada setiap tahapan pelaksanaan dan pengambilan data dengan melakukan analisa kandungan histamin dengan metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC) serta mencari studi pustaka mengenai histamin dan High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
19 3.4. Prosedur Analisa
3.4.1 Persiapan sampel
Sampel dipotong kecil-kecil lalu dimasukkan ke dalam wadah sampel secukupnya,
Sampel dihaluskan dengan menggunakan blender,
Sampel yang telah dihaluskan kemudian dimasukkan ke dalam tabung centrifuge lalu dilakukan penimbangan menggunakan timbangan analitik seberat 5,000 g,
Setelah penimbangan, sampel ditambahkan larutan metanol 75% sebanyak
20ml, kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex selama 1 menit,
Sampel kemudian dihomogenkan kembali dengan menggunakan absekjon selama 15 menit,
Setelah diabsekjon, sampel diinkubasi pada waterbath dengan suhu 60oC selama 30 menit,
Setelah sampel diinkubasi, sampel diabsekjon kembali selama 15 menit,
Kemudian disentrifus menggunakan centrifuge refrigerated dengan daya 4000 rpm selama 10 menit,
Setelah disentrifus, larutan supernatan diambil pada bagian lapisan atas sampel sebanyak 1.5 ml lalu dipindahkan ke dalam mikrotup,
Sampel disentrifus kembali dengan daya 12.000 rpm selama 5 menit.
3.4.2 Tahap pembuatan reagent
Larutan NaH2PO4 ditimbang sebanyak 2.875 g,
Sampel dilarutkan ke dalam larutan 2.5 liter Ultrat Pure Water (UPW),
Kemudian dihomogenkan dengan menggunakan alat sonics selama 15 menit,
3.4.3 Tahap derivatisasi
Sampel yang telah disentrifus 12.000 rpm, larutan supernatan diambil dengan takaran 135 mikron lalu dipindahkan ke dalam botol vial,
Sampel ditambahkan dengan larutan Ultrat Pure Water (UPW) sebanyak 850 mikron dan larutan NaOH 1 N sebanyak 400 mikron lalu divortex,
20 Sampel siap diinjeksikan kedalam alat High Performance Liquid
Chromatography (HPLC).
3.5 Prosedur kerja metode HPLC
Kondisi katup pada HPLC harus terbuka terlebih dahulu, sehingga fase gerak berfungsi,
Sampel yang siap diinjeksikan ke HPLC kemudian dimasukkan ke dalam wadah injeksi,
Sampel diinjeksi, jarum HPLC kemudian mangambil UPW untuk mencuci jarum yang telah menginjeksi sampel,
Jarum HPLC kemudian mengambil UPT lalu mengocoknya selama 3 menit untuk menghomogenkan/mengikat UPT dengan sampel,
Jarum kembali mengambil UPW untuk mencuci jarum yang telah menginjeksi sampel sebelumnya,
Sampel yang telah dihomogenkan terus mengalir ke detektor,
Setelah ke detektor terus mengalir ke kolom HPLC, pada kolom inilah terjadi pemisahan analit-analit sehingga histamin dapat terbaca sesuai waktu retensi yang digunakan,
Pembuangan sisa pembacaan,
Kadar histamin terbaca di monitor yang terhubung langsung dengan HPLC.
3.6 Proses pembacaan kadar histamin
HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Chromatography. Alat ini digunakan untuk memisahkan komponen berdasarkan dua fase yaitu fase diam dan fase gerak dengan metode kolom. Pemisahan ini dapat digunakan untuk proses secara kualitatif maupun kuantitatif. Pengukuran yang didasarkan secara kualitatif yaitu dengan ditunjukan oleh waktu retensi. waktu retensi yaitu waktu yang dibutuhkan oleh komponen dari mulai diijeksikan hingga sampel terbaca di detektor. Sedangkan pengukuran yang ditentukan dengan kuantitatif dapat dilihat dengan penggunaan luas area. Luas area yang dihasilkan berhubungan atau erat kaitannya dengan konsentrasi komponen yang dianalis. Semakin besar konsentrasi maka semakin besar juga luas areanya atau dapat dikatakan luas area sebanding dengan konsentrasi. Kromatogram adalah hubungan antara waktu retensi
21
dengan miliport detektor terhadap komponennya. Peak yang baik yang dihasilkan pada pemisahan dengan HPLC adalah peak yang tajam.
