PRAKTIKUM ANALISIS KADAR ANTOSIANIN DAN PROTEIN
FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
Bayu Rezaharsamto (240210140033)Departemen Teknologi Industri Pangan Universitas Padjadjaran, Jatinangor
Jalan Raya Bandung-Sumedang Km. 21, Jatinangor, Sumedang 40600 Telp. (022) 7798844, 779570
Fax. (022) 7795780 Email: bayu.rezaharsamto@gmail.com
ABSTRAK
Antosianin adalah pigmen berwarna merah sampai biru yang ditemukan pada bahan pangan nabati. Antosianin merupakan senyawa flavonoid yang memiliki banyak manfaat bagi kesehatan yang didasarkan peranannya sebagai antioksidan sehingga analisis untuk mengetahui kandungan antosianin dalam bahan pangan diperlukan. Protein merupakan makromolekul yang sangat dibutuhkan oleh manusia sebagai sumber energi, zat pembangun, zat pengatur dll. Pengujian protein dapat dilakukan menggunakan metode biuret menggunakan prinsip spektrofotometri. Pengujian kadar antosianin dan protein ini bertujuan untuk mengetahui kandungan kedua senyawa tersebut dalam bahan pangan dan pengaruh senyawa lain yang terdapat dalam sampel tersebut. Hasil analisis menunjukkan bahwa sampel kacang koro benguk mengandung sebanyak 27,67% protein sementara kadar antosianin yang terkandung dalam sampel bubuk bunga telang akan semakin sedikit jika kandungan gula dalam sampel semakin banyak.
Kata Kunci: Antosianin, biuret, spektrofotometri
PENDAHULUAN
Antosianin merupakan kelompok pigmen yang berwarna merah sampai biru yang tersebar luas pada tanaman. Antosianin tergolong pigmen yang disebut flavonoid (Harbone, 1987). Antosianin banyak ditemukan pada pangan nabati yang berwarna merah, ungu, merah gelap seperti pada beberapa buah, sayur, maupun umbi, namun masih sangat sedikit penelitian tentang sumber antosianin dari bahan lokal.
Antosianin merupakan senyawa flavonoid yang dipercaya dapat memberikan manfaat bagi kesehatan manusia. Antosianin ini diketahui dapat diabsorbsi dalam bentuk molekul utuh dalam lambung biarpun tidak semuanya (Passamonti et al, 2003). Antosianin
memiliki aktivitas metabolik tinggi antara lain memperlihatkan aktivitas sistemik seperti antineoplastik, antikarsinogenik, antiatherogenik, antiviral, dan efek anti-inflammatory, menurunkan permeabilitas dan fragilitas kapiler dan penghambatan agregasi platelet serta immunitas, semua aktivitas ini didasarkan pada peranannya sebagai antioksidan (Clifford et al, 2000)
penerapannya tergantung umur atau tahap pertumbuhan dan perkembangan.
Analisis protein dalam bahan pangan sendiri bisa dilakukan menggunakan spektrofotometri menggunakan pereaksi biuret. Reaksi yang terjadi antara biuret dan protein akan menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 – 750 nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan.
Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk mengetahui kandungan antosianin dari sampel tepung … dan pengaruh kadar gula terhadap konsentrasi antosianin, selain itu untuk menentukan kadar protein dari sampel kacang koro dimana kedua tujuan ini dilaksanakan menggunakan metode spektrofotometri.
METODOLOGI
Alat dan Bahan
Analisis antosianin dan protein dengan pereaksi biuret menggunakan metode spektrofotometri menggunakan bahan-bahan seperti aquades, biuret, BSA, buffer asam asetat pH 4,5, buffer KCl pH 1, serbuk bunga telang, CuSO4.5H2O, etil eter, KI, Na.K tartrat, NaOH, dan TCA.
Alat yang digunakan dalam praktikum antara lain alat sentrifugasi, corong, kertas saring, labu ukur, pipet ukur, spektrofotometer, tabung reaksi, tabung sentrifugasi.
Analisis Kadar Protein
Sampel sebanyak 1-2 gram ditepatkan dalam labu ukur 25 ml dengan menggunakan akuades. Aliquot diambil 0,5 ml lalu ditepatkan dengan akuades hingga 1 ml dalam tabung sentrifugasi kemudian ditambahkan 1 ml TCA 10%
untuk menghilangkan residu. Sentrifugasi dilakukan selama 10 menit dalam 3000 rpm. Buang supernatan dan tambahkan 2 ml etil eter dalam tabung kemudian lakukan sentrifugasi lagi dan vortex selama 1 menit serta biarkan mengering di udara. Air sebanyak 4 ml ditambahkan lalu lakukan vortex selama 1 menit. Tambahkan 6 ml pereaksi biuret dan inkubasi selama 30 menit, lalu uji dengan spektrofotometer dalam 520 nm untuk mengetahui absorbansi sampel. Kadar protein dapat dihitung dengan rumus:
( )
protein
=
x
w
×
10
−1
× fp
Ket.
x = konsentrasi sampel w = berat sampel dalam mg/L
10-1 = untuk konversi satuan mg/g menjadi g/100g atau persen
fp = faktor pengenceran
Pembuatan Buffer KCl pH 1
KCl ditimbang sebanyak 1,89 gram lalu dilarutkan dalam 980 ml akuades. pH larutan diatur menggunakan HCl pekat lalu ditepatkan sebanyak 1 L.
Pembuatan Buffer Na-Asetat pH 4,5 Na-Asetat ditimbang sebanyak 54,43 gram lalu dilarutkan dalam 960 ml akuades. pH larutan diatur sampai 4,5 menggunakan HCl pekat lalu ditepatkan sebanyak 1 L.
Analisis Kadar Antosianin
diinkubasi selama 5 menit, lalu sampel dimasukkan dalam kuvet dan diukur absorbansi menggunakan spektrofotometer dalam panjang gelombang 510 nm dan 700 nm. Kadar antosianin dapat dihitung menggunakan rumus:
A
=(
A
510−
A
700)
pH1−(
A
510−
A
700)
pH4,5dan;
Kadar Antosianin
=
A × BM × Fp ×
1000
ε× b
Ket.
A = absorbansi
Kadar antosianin = kadar antosianin
(%)
ε
= absorptivitas molar sianidin-3-glukosida (26900 L/mol.cm)b = tebal kuvet (1 cm)
vBM = berat molekul sianidin – 3 – glukosida (448.8 g/mol)
Fp = faktor pengenceran
HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis Kadar ProteinAnalisis kadar protein dalam sampel kacang koro benguk dilakukan menggunakan metode biuret menggunakan spektrofotometri. Penambahan TCA 10% saat preparasi sampel dilakukan agar protein dapat mengendap karena terjadi denaturasi pada protein. Penambahan etil eter dilakukan untuk melarutkan senyawa – senyawa yang tidak diinginkan khususnya senyawa non polar seperti lemak. Endapan pada sampel cair dicuci dengan dietil eter untuk menghilangkan TCA yang digunakan untuk mengendapkan protein. Penambahan biuret berfungsi untuk menimbulkan warna pada sampel karena bereaksi dengan protein sehingga bisa
diukur absorbansi nya. Reaksi antara Cu2+ dalam reagen biuret dengan ikatan peptida akan menghasilkan warna ungu. Absorbansi sampel yang terbaca berbanding lurus dengan konsentrasi protein dalam sampel. Berikut merupakan hasil analisis kadar protein kacang koro benguk.
Tabel 1. Hasil Analisis Protein Sampel Kacang Koro Benguk
Absorbansi Konsentras i Sampel
Kadar Protein
(%) 0,175 619,33 27,83 0,173 612,67 27,52 0,174 616 27,67
Hasil analisis menunjukkan rata-rata kadar protein yang terkandung dalam sampel kacang koro benguk adalah 27,67%. Hasil ini cukup sesuai jika dibandingkan dengan literatur Bressani dan Sosa, 1990, yang menyebutkan bahwa kacang koro mengandung protein mencapai 26,9%.
Grafik 1. Kurva Standar BSA
Berdasarkan kurva standar BSA diatas didapat persamaan regresi yaitu Y = 0,0641X – 0,075 dengan nilai R2 sebesar 0,9969. Nilai R menguji sejauh mana dari kurva diatas, maka tingkat ketepatan analisis tersebut adalah 99,6%. Kadar konsentrasi sampel (x) dapat diketahui.
Analisis Kadar Antosianin
Sampel yang digunakan dalam penetapan kadar antosianin adalah sampel bubuk bunga telang yang mengandung konsentrasi gula yang berbeda-beda, yaitu 0%, 10%, dan 20%. Penetapan kadar antosianin dilakukan dengan
menggunakan perbedaan pH yaitu pH 1,0 dan pH 4,5. Hal ini dilakukan karena dalam larutan, antosianin berada dalam lima bentuk kesetimbangan tergantung pada kondisi pH. Antosianin pada pH sangat asam yaitu pada pH 1,0 akan menghasilkan warna berwarna merah dengan bentuk kation flavilium, sementara pada pH di atas 4 akan membentuk antosianin berwarna kuning (bentuk kalkon), senyawa berwarna biru (bentuk quinouid), atau senyawa yang tidak berwarna (basa karbinol). (Giusti dan Wrolstad, 2001). Sampel yang telah dilarutkan dengan larutan buffer pH berbeda-beda tersebut kemudian dimasukkan dalam spektrofotometer untuk menentukan absorbansi setiap larutan. Berikut merupakan tabel hasil absorbansi dari setiap larutan.
Efek penurunan antosianin terjadi karena adanya degradasi gula menjadi furfural dan 5-hydroxymethyl-furfural yang terbentuk pada kondisi asam dan gula dipanaskan secara bersamaan dan bereaksi dengan antosianin membentuk produk berwarna coklat (Cao, 2009). Dengan kata lain, kandungan gula dalam sampel membuat antosianin menjadi tidak stabil.
Selain disebabkan oleh kandungan gula, penurunan kadar antosianin dalam bahan dapat disebabkan oleh faktor lain. Faktor-faktor tersebut antara lain adalah cahaya, oksigen dan suhu. Penurunan total antosianin akan berpengaruh pada aktivitas antioksidan bahan. Cara yang baik untuk mempertahankan aktivitas antioksidan dalam bahan adalah dengan menggunakan pengemas yang dapat mempertahankan aktivitas antioksidan selama penyimpanan seperti plastik polipropilen (PP).
KESIMPULAN
Hasil analisis kadar protein pada sampel kacang koro benguk menunjukkan protein yang terkandung dalam sampel adalah 27,67%. Kadar protein kacang koro benguk ini berbanding lurus dengan besarnya absorbansi yang terukur. Kadar antosianin yang terdapat pada sampel bubuk bunga telang dengan konsentrasi gula 20% adalah 4,9468%, 10% adalah 5,0637%, dan untuk 0% adalah6,3815%. Hal tersebut menunjukkan semakin tinggi kadar gula dalam bahan, kadar antosianin dalam bahan akan semakin rendah.
DAFTAR PUSTAKA
Bressani, R. dan Sosa, J.L. 1990. Effect of Processing on the Nutritive Value of Canavalia Jackbeans (Canavalia
ensiformis (L)). Kluwer Academic Publishers, Plant Foods for Human Nutrition 40: 207-214
Cao, S. Liang, L. Qi Lu, Yuan Xu, Siyi Pan, Kexin Wang. Integrated Effects of Ascprbic Acid, Flavonoids and Sugars on Thermal Degradation of Anhocyanins in Blood Orange Juice. Eur Foof Res Technol. 2009. 2(28) 975-8983
Clifford, M. N. 2000. Anthocyanins – Nature, Occurrence and Dietary Burden. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80, 1063 – 1072
Giusti, M. M., and Worlstad R. E. 2001. Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy. Oregon State University. Availabel at http://does.org/masterli/facsample.ht m-37k. diakses pada 9 Mei 2016
Harbone, J. B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Diterjemahkan oleh Keokasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung.
