BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan selama 8 bulan, yaitu dari bulan Juni 2009 – Januari 2010. Pengambilan contoh kayu dilakukan pada kayu tunggak, kayu di Tempat Pengumpulan Kayu (TPK), kayu dengan asal-usul tidak jelas, serta kayu dari industri jenis Shorea laevis dari dua IUPHHK, yaitu IUPHHK PT. “X” (nama sebenarnya tidak disebutkan dalam tesis ini untuk menghindari “conflict of interest”)), Kabupaten Kotawaringin Timur, propinsi Kalimantan Tengah dan IUPHHK PT. “Y” (nama sebenarnya tidak disebutkan dalam tesis ini), Kabupaten Ketapang, propinsi Kalimantan Barat, serta untuk pengambilan kayu dengan asal-usul tidak jelas dilakukan di Pelabuhan Sunda Kelapa, Jakarta (Tabel 1). Posisi geografis tempat pengambilan kayu disajikan pada Tabel 2 dan Gambar 7. Analisis DNA Mikrosatelit dilakukan di Ruang Analisis Genetik, Bagian Silvikultur, Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor.
Tabel 1 Lokasi pengambilan sampel kayu Shorea laevis
No. Lokasi Jumlah contoh Jumlah Total Kayu Tunggak Kayu di TPK Kayu di Industri Kayu dengan asal-usul tidak jelas* 1 IUPHHK PT. “X” 20 20 20 40 160 2 IUPHHK PT. “Y” 20 20 20
* Keterangan: diambil di pelabuhan Sunda Kelapa, Jakarta
Tabel 2 Koordinat lokasi pengambilan sampel kayu S. laevis
No Lokasi Propinsi Perkiraan Lokasi Ketinggian
Tempat (m dpl) Longitude Latitude 1 TPK PT. “X” Kalimantan Tengah 112'03'13,7" E 01'40'58,3"S 135 2 Penebangan PT. “X” Kalimantan Tengah 112'03'13,7" E 01'40'58,3"S 135 3 Industri PT. “X” Jawa Tengah 110'18'20,1" E 06'55'53,3"S 18 4 TPK PT. “Y” Kalimantan Barat 110'49'54,2" E 01'31'07,2"S 432 5 Penebangan PT. “Y” Kalimantan Barat 110'49'12,8" E 01'30'49,3"S 305 6 Industri PT. “Y” Kalimantan Barat 109'57'56,2" E 01'47'55,7"S 13 7 Kayu asal-usul tidak
jelas Jakarta 106°50' E 6°11' S 8
Gambar 7 Peta pengambilan sampel kayu S. laevis (google 2010) Bahan dan Alat Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah berupa kayu dari tebangan, TPK, industri, dan kayu dengan asal-usul tidak jelas (Gambar 8). Sedangkan bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 3, sedangkan foto alat-alat penelitian disajikan pada Lampiran 1.
Tabel 3 Bahan dan alat teknik mikrosatelit Analisis
Tahapan Pekerjaan
Ekstraksi PCR Visualisasi DNA Analisis Data
Mikrosatelit
Alat: sarung tangan karet, gunting, tube 1.5 ml, spidol permanen, mortar, pestel, mikropipet, tips, rak tube, vortex, mesin sentrifugasi, waterbath, freezer, desikator. Bahan:buffer ekstrak, PVP 2%, chloroform IAA, isopropanol dingin, NaCl, etanol 95%, buffer TE. Alat:tube 0,2 ml, spidol permanen, alat tulis, mikro pipet, tips, mesin sentrifugasi, mesin PCR PTC-100. Bahan: DNA, aquabidest, H2O, sepasang primer mikrosatelit, Taq polymerase. Alat: mikropipet, tips, mesin sentrifugasi, bak elektroforesis, cetakan agar, erlenmeyer, sarung tangan, UVtransilluminator, alat foto DNA. Bahan:agarose, poliakrilamid, buffer TAE 1x, TBE 1x, blue juice 10x, DNA marker, EtBr, perak nitrat
Alat: komputer, softwere POPGENE versi 1.31, NTSYS versi 2.0., dan Microsoft excel IUPHHK PT. “Y” IUPHHK PT. “X”
Sunda Kelapa, Jakarta
(a) (Foto: Yunanto 2009)
(b) (Foto: Yunanto 2009)
(c) (Foto: Yunanto 2009)
(d) (Foto: Yunanto 2009)
Metode Penelitian Prosedur Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode mikrosatelit. Secara umum diagram alur penelitian dengan menggunakan metode mikrosatelit dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9 Bagan prosedur teknik mikrosatelit NTSys
Popgene Chi Square
Interpretasi dan analisis data PCR primer terbaik
Elektroforesis poliakrilamid Tidak
Pemotretan hasil amplifikasi Pewarnaan perak nitrat (staining)
Elektroforesis poliakrilamid PCR seleksi primer
Pewarnaan perak nitrat (staining) Pewarnaan EtBr (staining)
Elektroforesis agar 1% Tidak
Contoh uji kayu
Ruang Lingkup Penelitian
Metode utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah penanda mikrosatelit (Weising and Gardner 1999). Secara umum dalam penelitian ini dipecah menjadi tiga sub-penelitian, yaitu:
Sub- penelitian 1: Cross species amplification(Seleksi primer)
Penelitian ini mengujicobakan primer untuk jenis Shorea leprosula dan jenis Shorea curtisii pada DNA jenis Shorea laevis. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan primer yang menghasilkan pola pita polimorfik dari kedua jenis primer tersebut.
Sub- penelitian 2: Menduga asal-usul kayu yang tidak jelas serta menguji kesamaan DNA antara kayu tebangan, TPK, dan kayu industri masing- masing IUPHHK
Penelitian ini dilakukan untuk mengujicoba pendugaan asal-usul kayu yang tidak jelas dengan menggunakan database genetik hasil analisis mikrosatelit pada nuklear daun hasil penelitian sebelumnya (Siregar et al. 2009). Jumlah sampel yang diujicobakan adalah ± 40 sampel. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui asal-usul kayu tersebut.
Selain itu, pada penelitian ini juga dilakukan analisis mikrosatelit sampel kayu dari tebangan, TPK, dan kayu industri yang digunakan oleh kedua IUPHHK. Jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah: i) kayu tebangan = 20 sampel, ii) kayu TPK = 20 sampel, dan iii) kayu indsutri = 20 sampel untuk masing-masing IUPHHK. Jumlah total sampel yang digunakan adalah 120 sampel. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kesamaan DNA kayu baik kayu tebangan, kayu TPK, dan kayu industri yang digunakan oleh masing-masing IUPHHK.
Sub- penelitian 3: “Uji apple to apple” kayu tunggak dengan kayu TPK
Penelitian ini dilakukan untuk menganalisis sampel kayu tunggak dari pohon yang ada di area tebangan dengan sampel kayu yang ada di TPK, dimana kedua pohon tersebut memiliki nomor pohon yang sama. Jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah: i) kayu tebangan = 20 sampel dan ii) kayu TPK = 20 sampel yang hanya akan diambil dari salah satu IUPHHK sehingga jumlah total sampel yang digunakan adalah 40 sampel. Penelitian ini bertujuan
untuk mengetahui kecocokan DNA kayu antara pohon yang ada di area penebangan dengan pohon yang ada di TPK.
Analisis Mikrosatelit
Analisis DNA pada kayu Shorea laevis dilakukan dengan menggunakan metode mikrosatelit. Secara umum metode mikrosatelit terdiri dari dua tahapan, yaitu Ekstraksi DNA dan analisis mikrosatelit.
Ekstraksi DNA
Kegiatan ekstraksi DNA dari kayu jenis Shorea laevis dilakukan dengan menggunakan metode CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) hasil penelitian Siregar et al. (2008) yang telah dimodifikasi. Sampel kayu (± 2 gr) digerus dengan menggunakan nitrogen cair atau buffer ekstrak di dalam pestel yang bersih. Hasil gerusan selanjutnya dipindahkan ke dalam tube 1,5 mL, lalu ditambahkan 500-700 µl larutan buffer ekstrak (campuran Tris-HCl, EDTA, NaCl, CTAB, dan Air) dan 100 µl PVP 2%. Selanjutnya dilakukan proses inkubasi di dalam waterbath selama 45-60 menit pada suhu 65oC. Untuk mengikat DNA ditambahkan kloroform 500 µl dan fenol 10 µl, selanjutnya campuran tersebut dikocok agar menjadi homogen. Selanjutnya ditambahkan isopropanol dingin 500 µl dan NaCl 300 µl, lalu disimpan dalam freezer selama 45-60 menit untuk mendapatkan pelet DNA. Kegiatan selanjutnya adalah proses pencucian DNA dengan menambahkan etanol 100% sebanyak 300 µl, lalu disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama dua menit. Pelet DNA disimpan di dalam desikator selama ± 15 menit dan setelah itu ditambahkan larutan buffer TE 20 mikroliter, lalu divortek, dan selanjutnya disentrifugasi kembali.
Mikrosatelit
Prinsip proses PCR adalah suatu siklus berjangka pendek (30-60 detik) dengan tiga perubahan suhu yang berubah secara cepat. Reaksi PCR mikrosatelit dilakukan dengan menggunakan 15 µl volume larutan yang terdiri dari H20 2,5 µl,
primer forward dan primer reverse masing-masing 1,5 µl, Go Taq Green Master Mix Kit (Promega) 7,5 µl, dan 2 µl genomik DNA. Amplifikasi DNA dilakukan
dengan menggunakan mesin PTC-100 Progammable Thermal Cycler (MJ Research, Massachussetts, USA). Proses mikrosatelit dilakukan dengan menggunakan lima primer spesifik yang telah digunakan untuk jenis Shorea leprosula (Tabel 4) dan lima primer spesifik yang telah digunakan pada jenis Shorea curtisii (Tabel 5). Pengaturan suhu pada mesin PTC-100 untuk reaksi mikrosatelit adalah: i) pra-denaturasi pada suhu 950C selama 2 menit, ii) denaturasi pada suhu 950C selama 1 menit, iii) annealing pada suhu 45-560C selama 2 menit, dan iv) ekstensi pada suhu 720C selama 2 menit. Proses ini dilakukan atau diulang sebanyak 35 siklus.
Tabel 4 Primer spesifik pada jenis Shorea leprosula (Ng 2008)
No. Locus Repeat PCR Primer (5’ to 3’) PCR Product Length
Annealing Temp (0C)
1. SleE01 (AT)12 F:TCGTACTGATAATCGG
R:GTTTATAGGCTGATAATATGATTTA
179-188 45 2. SleE02 (AGC)9 F:GGAGGAGAGAAACGAAG
R:GTTTGAGGTAGTGAATAACGAGC
142-160 45 3. SleE05 (TA)9 F:ACTAATAATGCTTGTGGTAAT
R:GTTTGTAACTAACCTCTAATGCCT
175-191 45 4. SleE07 (GAA)7 F:AGAAGAATATGGGTACGACTG
R:GTTTGAATCAACTGGCACCTCTAT
175-190 45 5. SleE08 (AT)12 F:GGCTTCCTTTATATCCAATTT
R:GTTTGAGTTGGCTGCATATGA
177-197 45
Tabel 5 Primer spesifik pada jenis Shorea curtisii (Ujino et al. 1998)
No. Locus Repeat PCR Primer (5’ to 3’) PCR Product Length
Annealing Temp (0
C) 1. Shc01 (CT)8CT (CA),CTCA F:GCTAT TGGCA AGGAT GTTCA
R:CTTAT GAGAT CAATT TGACAG
152 56 2. Shc02 (CT)2CA(CT)5 F:CACGC TTTCC CAATC TG
R:TCAAGA GCAGA ATCCA G
149 54 3. Shc03 (CT)8 F:TTGAA GGGAA GGCTA TG
R:CTTCT CAACT ACCTT ACC
124 54 4. Shc04 (CT)16 F:ATGAG TAACA AGTGA TGAG
R:TATTG ACGTG GAATC TG
96 52 5. Shc07 (CT)8CA(CT)5CACCC(CTCA)3C
T (CA)16
F:ATGTC CATGT TTGAG TG R:CATGG ACATA AGTGG AG
169 54
Uji Kualitas dan Kuantitas DNA
Untuk menguji kualitas DNA hasil ekstraksi dari kayu dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose konsentrasi 1% (w/v) dengan menggunakan buffer TAE 1x. Campuran agar 1% tersebut dipanaskan di dalam microwave untuk selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan dan ditunggu sampai padat, kemudian disimpan di dalam bak elektroforesis yang berisi buffer TAE.
Setelah agar padat, 3 µl Blue Juice 10x dan 4 µl DNA dicampurkan dan dimasukkan ke dalam lubang-lubang cetakan agar. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan aliran listrik dengan tegangan 100 volt sekitar 30 menit. Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan dengan larutan Ethidium Bromida (EtBr) dengan konsentrasi 1% (v/v), dan selanjutnya pita DNA hasil isolasi dilihat dengan menggunakan alat UV transilluminator.
Untuk menguji kualitas DNA hasil PCR mikrosatelit, dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel poliakrilamid hasil campuran dari larutan akrilamid, TEMED dan Ammonium persulfat (APS). Campuran gel poliakrilamid dip anaskan, dan untuk selanjutnya gel diinjeksikan ke dalam cetakan berupa 2 kaca yang direkatkan dengan bahan perekat yang berisi sisir untuk membuat lubang elektroforesis. Buffer yang digunakan untuk kegiatan elektroforesis adalah buffer TBE 1x. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan aliran listrik sebesar 120 W selama 1-3 jam. Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan menggunakan larutan perak nitrat dengan menggunakan shaker selama 30 menit. Selanjutnya pita DNA hasil PCR mikrosatelit dilihat dan didokumentasikan dengan menggunakan alat kamera digital.
Pembuatan Gel Poliakrilamid
Pembuatan gel poliakrilamid terdiri dari beberapa tahapan, yaitu: 1. Pencucian Piringan Kaca
Pir ingan kaca kecil dicuci dengan 5 ml etanol menggunakan paper towel/tissue. Kemudian kaca dikeringkan selama dua menit dan diulang kembali. Kaca tersebut kemudian diberi perlakuan dengan menggunakan 15 µl ? -methacryloxy-propyltrimethoxyselane (Bind Silane, M-6514, Sigma) dalam 4 ml etanol dan 1,25 ml asam asetat. Kemudian sisanya dibersihkan dengan tissue yang dilembabkan dengan etanol. Pir ingan kaca besar dicuci dengan 5 ml etanol menggunakan tissue kemudian dikeringkan selama dua menit, dan diulangi kembali.
2. Pembuatan Larutan Akrilamid
Pembuatan gel akrilamid dibuat dengan mencampur TBE 10X dengan 500 µl ammonium persulfat, Bisacrilamid, dan 50 µl TEMED (sigma). Larutan gel
diletakkan pada lempengan gel (ketebalan 1,5 mm), selanjutnya gel didiamkan untuk berpolimerisasi selama 30 menit.
3. Loading Sample
Hasil amplifikasi kemudian didenaturasi selama 2 menit pada suhu 92-95oC di dalam thermocycler dan disimpan di lemari es sebelum diaplikasikan ke gel. Kegiatan elektroforesis dilakukan pada 350 V, 40 mA, 80 W selama 75 menit setelah pre-run gel selama 30-60 menit Buffer yang digunakan untuk running atau elektroforesis adalah buffer TBE 1x yang mengandung 18 mM Triz- HCl, 8,9 mM asam borat dan 2 mM Na2EDTA.
4. Metode Pewarnaan
Metode pewarnaan yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan pada hasil penelitian Benbouza et al. 2006 yang dimodifikasi. Metode ini meliputi beberapa langkah atau tahapan. Setelah dilakukan elektroforesis, gel dicuci dalam 1000 ml air larutan (900 ml aquades, 100 ml etanol 95%, dan 50 µ Asam asetat) dingin selama lima menit. Tahap selanjutnya adalah mencuci gel dengan melakukan perendaman selama enam sampai tujuh menit pada suhu ruangan (22-24 oC) dalam 1000 ml larutan. Impregnasi dengan perak nitrat (1000 ml aquades, 1,5 g perak nitrat, dan 1,5 ml formaldehid 37%) dilakukan pada ruangan dengan kondisi cahaya penuh.
Tahap selanjutnya adalah gel development yaitu dengan menggunakan larutan campuran dari 1000 ml aquades, 1,5% NaOH, dan 3 ml formaldehid 37% sampai pita nampak pada intensitas rendah (tiga sampai lima menit). Jika intensitas yang diharapkan telah nampak pada intensitas rendah (tiga sampai lima menit), maka selanjutnya gel diimpregnasi dalam larutan akhir 1000 ml aquades, 10% etanol, dan 0,5% asam asetat selama dua menit. Semua tahapan tersebut dilakukan dalam kontainer plastik. Kemudian lembaran gel selanjutnya digerakkan dalam shaker selama proses pewarnaan. Semua larutan disiapkan dengan menggunakan air ultra pure atau aquades. Gel selanjutnya dikeringkan pada suhu ruangan dan pita DNA akan secara langsung terlihat dengan bantuan white light box, dan kemudian difoto.
Analisis Data
Hasil dari kegiatan mikrosatelit pada kayu difoto dan dianalisis dengan melakukan skoring pola pita yang muncul (Gambar 10). Hasil interpretasi foto kemudian dianalisis dengan menggunakan software POPGENE 32 Versi 1.31 dan NTSYS Ver 2.0 (Rohlf 1998). Pengujian “apple to apple” (lacak balak) pada pohon yang sama antara kayu tunggak dengan kayu TPK dilakukan dengan membandingkan struktur genotipik kayu tunggak dengan kayu di TPK dengan uji chi kuadrat (chi square) dan uji kesesuaian genotipe. Chi-kuadrat adalah uji nyata (goodness of fit) apakah data yang diperoleh benar menyimpang dari nisbah yang diharapkan dan tidak secara kebetulan (Crowder 1986).
Perhitungan chi-kuadrat dilakukan dengan rumus (Crowder 1986): ?² = (o - e)2
e
dimana : ?² = Nilai chi-kuadrat.
o = Jumlah genotipeyang diamati (observed). e = Jumlah genotipeyang diharapkan (expected).
Perhitungan chi kuadrat dilakukan dengan Microsoft excel sehingga diperoleh ?²hitung yang kemudian dicocokkan dengan ?²tabel pada selang
kepercayaan 95 %. Adapun hipotesis yang diuji adalah:
H0: Struktur genotipik contoh uji kayu di tunggak sama dengan contoh uji
kayu di TPK.
H1: Struktur genotipik contoh uji kayu di tunggak tidak sama dengan contoh uji
kayu di TPK. Lokus Individu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-1 Lokus Individu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-1 12 12 12 22 12 11 12 11 22 11 12
