Dampak dari asam oleat sebagai co-substrat glukosa pada efect " jangka pendek" dan "jangka panjang" efek Crabtree pada
Saccharomyces cerevisiae
Abstrak
Latar Belakang
Optimasi dari industri biomassa diarahkan pada proses yang memberikan hasil biomassa tertinggi. Namun, beberapa ragi yang berguna seperti
Saccharomyces cerevisiae tunduk pada efek Crabtree di bawah kelebihan glukosa. Fenomena ini dapat terjadi pada tangki skala besar dimana terdapat heterogenitas dalam konsentrasi glukosa. Oleh karena itu ragi menghadapi lingkungan lokal dengan kelebihan glukosa yang menyebabkan terjadinya produksi etanol yang dapat menghambat pembentukan biomassa. Sebelumnya kami menunjukkan bahwa asam oleat sebagai co-substrat dalam chemostat terbatas glukosa diperbolehkan untuk menunda dan memodulasi efek "jangka pendek" efek Crabtree pada Saccharomyces cerevisiae. Disini kita meneliti lebih lanjut pengaruh dari asam oleat sebagai modulator dari efek Crabtree.
Hasil
Kesimpulan
Penelitian ini menunjukkan dengan jelas bahwa gangguan oleh asam oleat sebagai co-substrat mengakibatkan penurunan efek "jangka pendek" dan "jangka panjang" efek Crabtree. Dampak ini tergantung strain dan reversibel. Dengan demikian, aplikasi strategi industri biokimia ini bisa dipertimbangkan untuk mengatasi masalah heterogenitas dalam tangki skala besar atau untuk mempersiapkan starter ragi untuk berbagai aplikasi.
Kata Kunci
Saccharomyces cerevisiae, fermentasi etanol, asam oleat, efek Crabtree, Accelerostat, Batch, Fed-batch.
Latar Belakang
Represi jalur oksidatif oleh aktivitas glikolitik mengakibatkan fermentasi dan respirasi simultan bernama "efek Crabtree" [1-3]. Hasil oksido-reduktif ditandai dengan pembentukan produk sampingan (etanol, gliserol dan asam lemah), pengurangan dalam hasil biomassa dan terbatasnya tingkat penyerapan oksigen. Hal ini dinamakan efek "jangka panjang" ketika batch kelebihan glukosa dan fed-batch atau dalam chemostat terbatas glukosa pada tingkat pengenceran yang melebihi tingkat dilusi kritis (Dc), yang melibatkan adaptasi metabolisme sel, sementara itu bernama efek "jangka pendek" setelah pulse glukosa dalam chemostat terbatas glukosa berada pada tingkat pengenceran dibawah Dc [4].
menggunakan pendekatan rekayasa genetika. Namun, delesi terisolasi atau over-ekspresi dari berbagai gen yang mengkode enzim dalam kapasitas pernafasan tidak berhasil membawa keluar setiap reaksi terbatas tunggal [7-15].
Modulasi transisi metabolisme berhasil dilaporkan setelah rekayasa fungsi regulasi global. Delesi dari MIG1 dan MIG2, coding untuk regulator positif dalam represi glukosa menyebabkan Dc 5 % lebih tinggi, pada 0.274h-1 [16]. Over-ekspresi dari HAP4, coding untuk regulator positif gen yang terlibat dalam metabolisme pernapasan, menyebabkan Dc 10 % lebih tinggi, pada 0.33h-1 [17]. Penurunan rasio intraseluler NADH/NAD+ oleh coding ekspresi gen heterolog untuk oksidase mitokondria (AOX1) juga menyebabkan Dc 10 % lebih tinggi, pada 0.32h-1 [18]. Selain itu, modulasi "jangka pendek" efek Crabtree juga dilaporkan melalui penambahan co-substrat. Penambahan asam oleat sebagai co-substrat glukosa memungkinkan untuk menunda dan memodulasi transisi metabolisme "jangka pendek" dalam sel [19].
"efek substrat" bukanlah efek utama yang bertanggung jawab untuk penurunan transisi dari pernapasan untuk metabolisme fermentatif. Kedua, asam oleat mungkin telah memicu "efek genetik", yang bertindak pada tingkat transkripsi dan/atau translasi melalui regulasi sistem yang kompleks. Namun, asam ini dikenal dapat menginduksi proses transkripsi berbagai gen yang memiliki ORE (Oleate Response Element) berurutan pada promotornya [23]. Hipotesis terakhir ini diperkuat oleh observasi dari meningkatnya aktifitas spesifik enzim yang dikodekan oleh gen yang ada pada asam oleat [19].
Upaya-upaya sebelumnya telah memberikan gambaran bagaimana dampak asam oleat pada efek "jangka pendek" efek Crabtree. Meskipun demikian, proses yang digunakan untuk aplikasi industri dimana efek Crabtree tidak diinginkan, seperti starter ragi atau produksi protein heterolog, bisa menyebabkan efek "jangka panjang" serta "jangka pendek" efek Crabtree. Selain itu, berbagai strain S. cerevisiae digunakan dalam industri luas dan perilakunya sebagian besar berbeda dari CEN.PK 113-7D. Berdasarkan pengamatan ini, penelitian Feria-Gervasio et al. [19] sebelumnya perlu diselesaikan. Jadi dalam penelitian ini, kami meneliti lebih lanjut dampak dari asam oleat termasuk penentuan spesifisitas dengan menggunakan strain industri (S. cerevisiae CA10/pCD63), penentuan tingkat pengenceran kritis untuk metabolisme oksidatif murni (Dc), investigasi efek reversibilitas dan yang terakhir ditandai oleh efek daya tahan dibawah kondisi yang mengakibatkan terjadinya efek “jangka panjang” efek Crabtree.
Hasil dan Pembahasan
mengkarakterisasi efek ini, dampak dari asam oleat diteliti secara khusus dari spesifik strain, daya tahan dan efek reversibilitas.
Dampak Asam Oleat Tidak Spesifik Untuk Strain CEN.PK 113-7D
Untuk mengevaluasi spesifisitas strain dari dampak asam oleat pada transisi dari oksidatif untuk metabolisme oksido-reduktif, percobaan pulse glukosa dilakukan dalam steady state dari chemostat terbatas glukosa dengan dan tanpa asam oleat dengan strain CA10/pCD63. Hasilnya dibandingkan dengan yang diperoleh sebelumnya dengan S.c. CEN.PK 113-7D. Gambar 1 menunjukkan evolusi konsentrasi etanol dan Respiratory Quotient (indikasi rasio antara pemanfaatan jalur fermentasi dan oksidasi) setelah pulse glukosa pada 10 g L-1 untuk kedua strain. Adanya asam oleat dalam chemostat dari S.
cerevisiae CA10/pCD63 menyebabkan penurunan dalam produksi etanol (16%) dan asetat (hasil tidak ditunjukkan) setelah pulse glukosa. Profil RQ juga lebih rendah dengan adanya asam oleat dan dikonfirmasi pemanfaatan yang lebih rendah dari jalur fermentasi dalam kondisi ini. Nilai maksimalnya mengalami penurunan sebesar 27% dan 25% masing-masing untuk CA10/pCD63 dan CEN.PK 133-7D. Akhirnya, strain CA10/pCD63 menunjukkan penundaan 6 menit yang menimbulkan pergeseran metabolik pada pulse glukosa (dihitung sebagai perbedaan antara titik data pertama dimana etanol terdeteksi dalam kultur dengan dan tanpa asam oleat). Penundaan itu ditemukan sama dengan 15 menit untuk strain CEN.PK 113-7D dibawah kondisi yang sama.
Gambar 1 Perubahan konsentrasi etanol dan RQ pada pulse glukosa. Pulse glukosa 10 g L-1 (ditunjukkan oleh panah) dilakukan pada steady
state chemostat terbatas glukosa strain CA10/pCD63 dan CEN.PK 113-7D pada glukosa dalam tanpa (simbol terbuka) atau dengan tambahan asam oleat (simbol penuh) pada Dole = 0.0041h-1 (CA10/pCD63) dan Dole =
0.0073h-1 (CEN.PK 113-7D). Keseimbangan karbon dievaluasi pada
Dengan demikian, dampak dari asam oleat pada profil dinamis dari produksi etanol dan RQ adalah sama untuk kedua strain, namun sedikit kurang jelas untuk S. cerevisiae CA10/pCD63.
Asam Oleat Berdampak Pada Tingkat Pengenceran Krtis (Dc)
Untuk menentukan tingkat pengenceran kritis untuk S. cerevisiae CEN.PK 113-7D dengan dan tanpa asam oleat sebagai co-substrat (D=0.0073h-1), kultur accelerostat dilakukan dengan meningkatkan tambahan glukosa sebagai fungsi dari waktu. Tingkat pengenceran meningkat dari nilai awal 0,16h-1 ke nilai akhir 0,3h-1 dengan percepatan konstan 0,005h-2.
Terjadinya transisi dari pernapasan untuk metabolisme oksido-reduktif, sesuai dengan Dc, ditandai dengan peningkatan produksi etanol dan penurunan hasil biomassa (Yx/s). Hal ini terjadi di 0,24h-1 pada glukosa tunggal (Gambar 2A) tetapi adanya asam oleat dalam kaldu fermentasi menyebabkan peningkatan 8 % di 0,26h-1 (Gambar 2B). Perbedaan Dc berada di urutan yang sama besarnya dengan yang ditemukan dalam literatur dengan strain mutan. Sebuah studi pertama menghapus MIG1 dan MIG2, coding untuk regulator yang terlibat dalam represi glukosa, menyebabkan peningkatan 5 % dalam Dc yang ditentukan dengan teknik yang sama [16]. Over-ekspresi faktor transkripsi Hap4p menyebabkan perkiraan peningkatan 10 % Dc dalam kultur chemostat [17]. Akhirnya, Vemuri et al. [18] menunjukkan 10 % peningkatan di Dc oleh ekspresi oksidase heterologus selama kultur productostat [25].
Gambar 2 Laju spesifik produksi etanol dan hasil biomassa selama kultur A-stat. Laju spesifik produksi etanol (▲) dan hasil biomassa (■) selama kultur A-stat pada glukosa tanpa (ASGCG; A) atau dengan
tambahan asam oleat (ASGOCGO; B) pada Dole=0.0073h-1. Garis mewakili
8% yang menyebabkan terjadinya transisi metabolik, 16,5 - 17,8 mCmol gDCW-1 h-1 (Gambar 3). Studi sebelumnya dari Feria-Gervasio et al. [19] menunjukkan bahwa modulasi transisi ini tidak berkorelasi dengan kapasitas rantai transpor elektron. Dengan demikian, kedua pengamatan menunjukkan bahwa penambahan asam oleat mengakibatkan peningkatan "kapasitas pernafasan" (model kotak hitam termasuk jalur metabolik sitosol dan mitokondria yang bertanggung jawab pada katabolisme pernapasan piruvat), memungkinkan sel untuk memetabolisme glukosa pada tingkat yang lebih tinggi tanpa menggunakan cara fermentasi.
Gambar 3 Laju spesifik produksi etanol sebagai fungsi dari tingkat konsumsi spesifik glukosa dan karbon selama kultur A-stat. Laju spesifik produksi etanol diberikan sebagai fungsi dari tingkat konsumsi spesifik glukosa (A) dan tingkat konsumsi spesifik karbon (B) selama kultur A-stat pada glukosa tanpa (ASGCG, garis padat) atau dengan
tambahan asam oleat (ASGOCGO; garis bertitik) pada Dole=0.0073h-1.
Kultur A-stat pada Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D dilakukan antara D=0.16h-1 dan D=0.3h-1.
Dalam kaitan dengan tingkat serapan karbon total (glukosa dan asam oleat), Dc sama dengan tingkat penyerapan karbon 15% lebih tinggi pada A-stat oleat-glukosa, dari 16.5-19.0 mCmol gDCW-1 h-1 (Gambar 3), % untuk perhitungan karbon asam oleat.
Efek Asam Oleat Reversibel Sebagian
Kultur batch dilakukan untuk menentukan reversibilitas dampak oleat. Sel-sel pra pertumbuhan pada sumber karbon oleat-glukosa ditransfer dalam kultur batch glukosa dengan atau tanpa asam oleat sebagai co-substrat (BGCGO dan BGOCGO). Hasil etanolnya dibandingkan dengan kontrol batch glukosa dengan sel prekultur dari glukosa saja (BGCG).
glukosa + asam oleat sebagai sumber karbon (BGCGO) menyajikan keterlambatan 1 jam lebih besar di awal produksi etanol dibandingkan sel pregrown pada glukosa saja (BGCG) (Gambar 4). Orientasi penataan ulang dari metabolisme biomassa tetap dipertahankan bahkan ketika oleat telah dihapus dari kultur kaldu. Namun, sel prekultur pada glukosa + asam oleat sebagai sumber karbon dan ditransfer dalam batch yang mengandung glukosa dan asam oleat (BGOCGO) menunjukkan penundaan 1 jam lebih besar daripada ketika pertumbuhan pada glukosa saja (BGCGO). Akibatnya, tekanan konstan asam oleat tampaknya diperlukan untuk mempertahankan seluruh dampak metabolisme sel dalam jangka waktu yang lama. Oleh karena itu, pengamatan ini mengindikasikan reversibilitas parsial pengaruh efek asam oleat dalam sel tunggal setelah asam oleat dihapus.
Gambar 4 Konsentrasi etanol selama kultivasi batch aerobik. Kultivasi batch Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D diinokulasi dengan kumpulan sel pada steady state chemostat terbatas glukosa pada D=0.16h-1 (batch glukosa (B
GCG);) atau dengan kumpulan sel pada
steady state chemostat terbatas glukosa di D=0.16h-1 dengan tambahan
oleat pada Dol =0.0073h-1 (batch glukosa (BG CGO);■) dan batch glukosa
dengan asam oleat (BGO CGO);▲). Garis mewakili kalkulasi profil evolusi
dengan karbon dan kesetimbangan derajat reduksi.
Dampak Asam Oleat Efektif Untuk Beberapa Jam Selama Fermentasi VHEP dibawah Tekanan Oleat
Kinetika biomassa dan produksi etanol menyarankan bahwa tambahan asam oleat dalam medium mempercepat pertumbuhan ragi sehingga mengurangi produksi etanol dan menyebabkan waktu fermentasi lebih pendek (Gambar 5). Hal ini diperkuat dengan mengingat hasil global pada konsumsi glukosa (Tabel 1). Hasil biomassa meningkat sebesar 35 % serta konsentrasi akhir sebesar 73 %. Hasil etanol mengalami penurunan sebesar 8 % dan titer akhir etanol sebesar 7 % (116,2 vs 126,8 g L-1), meskipun secara statistik hasilnya tidak berbeda. Tingkat produksi maksimal dari etanol dan gliserol masing-masing mengalami penurunan sebesar 67 % dan 39 % (Tabel 1). Hal menjelaskan bahwa asam oleat berdampak negatif pada kapasitas fermentasi dari sel selama kultur fed-batch aerobik. Metabolisme karbon diarahkan khusus terhadap produksi biomassa meskipun tidak ada variasi yang diamati untuk laju spesifik maksimal pertumbuhan.
Gambar 5 Evolusi biomassa dan kumulatif massa etanol selama kultur fed-batch aerobik. (☐) biomassa dan (△) produksi etanol pada Saccharomyces cerevisiae CENPK 113-7D. Simbol terbuka merupakan fed-batch kelebihan glukosa dengan sel tidak diadaptasi (FBGCG),
Tabel 1 menunjukkan produksi yang lebih besar dari suksinat dalam sel prekultur pada glukosa + asam oleat (FBGOCGO). Konsentrasi akhir, hasil global dan laju spesifik maksimal produksi asam organik ini masing-masing meningkat sebesar 34 %, 67 % dan 114 % ketika oleat ditambahkan dalam kaldu fermentasi. Pengukuran tidak menemukan adanya konsumsi oleat selama percobaan fed-batch FBGOCGO. Selain itu kesetimbangan massa karbon ditemukan hampir 100% dengan mempertimbangkan hanya glukosa sebagai substrat yang mengkonfirmasikan bahwa tidak ada asam oleat yang dikonsumsi. Oleh karena itu, sintesis suksinat dari katabolisme asam oleat melalui jalur β-oksidasi dan glioksilat tidak dapat dipertimbangkan. Siklus asam trikarboksilat kemudian seharusnya menjadi sumber ekskresi suksinat dibawah metabolisme fermentasi dengan glukosa sebagai sumber karbon tunggal, seperti yang disebutkan sebelumnya oleh Camarasa et al. [26]. Selain itu, HCO3- diketahui menghambat berbagai enzim seperti suksinat dehidrogenase dalam siklus TCA [27]. Selama percobaan kami, suksinat diproduksi pada fase pertama dari fed-batch, dengan sedikit memperpanjang fase tumbuh, sesuai ketika laju tertinggi produksi CO2 terjadi (hasil tidak ditunjukkan). Dengan asumsi bahwa asam suksinat dari siklus trikarboksilat, meningkatkan ekskresi suksinat dapat diinterpretasikan sebagai aktivitas tertinggi siklus TCA. Observasi ini diperkuat dengan peningkatan konsumsi oksigen yang diamati dengan adanya asam oleat (data tidak ditampilkan) dan sebelumnya dijelaskan oleh Feria-Gervasio et al. [19] pada chemostat aerobik.
literatur dengan cara modulasi aerasi [29], dengan mengurangi produksi gliserol melalui kontrol RQ atau pendekatan rekayasa metabolik [18,31].
Mengingat perbedaan pada produksi suksinat, piruvat, gliserol dan konsumsi oksigen, kita cukup bisa membuat pernyataan bahwa adanya asam oleat meningkatkan kapasitas pernapasan global dalam S. cerevisiae.
Gambar 6 menyajikan keuntungan hasil biomassa dan kerugian hasil etanol fed-batch oleat-glukosa dibandingkan dengan fed-batch glukosa. Dalam grafik ini, berkurangnya μ dan qEtOH dapat dihubungkan dengan kemajuan percobaan dan memperlihatkan gambaran pada evolusi dampak kekuatan oleat pada metabolisme sel. Keuntungan hasil biomassa menurun selama bagian utama dari fase pertumbuhan, dari faktor awal 3,2 ke yang lebih rendah dari 1,5. Selain itu, kerugian hasil etanol menurun dari faktor 0,57 pada awal kultur menjadi 1,04 pada akhir fase pertumbuhan, yaitu untuk qEtOH dibawah 0,18 g g-1 h-1. Ketika produksi etanol yang terjadi tidak ditambah, yaitu untuk laju spesifik produksi etanol di bawah 0,18 g g-1 h-1, faktor ini hanya di antara 1 dan 1,04. Ini jelas mengungkapkan kerugian terus menerus dari dampak kekuatan asam oleat pada metabolisme sel dengan kemajuan kultur. Ketika fase pertumbuhan berakhir, dampak ini bahkan hampir menghilang. Dengan demikian, dampak asam oleat mempengaruhi metabolisme sel ketika terjadi pertumbuhan selama percobaan VHEP.
Gambar 6 Evolusi dari keuntungan hasil biomassa dan kerugian hasil etanol selama kultur fed-batch aerobik. Evolusi dari keuntungan hasil biomassa sebagai fungsi dari laju pertumbuhan (A) dan kerugian hasil etanol sebagai fungsi laju spesifik dari produksi etanol (B) selama kultivasi fed-batch aerobik Saccharomlyces cerevisiae CEN.PK 113-7D. Keuntungan merupakan selisih pada hasil yang diperoleh dengan kultivasi oleat-glukosa terhadap kultivasi glukosa. Panah putus-putus mewakili kemajuan fermentasi.
Pemahaman dan pengendalian proses produksi biomassa menyajikan suatu hal yang menarik dari sudut pandang ekonomi. Mikroorganisme utama yang digunakan untuk proses ini adalah Saccharomyces karena pemanfaatannya dalam berbagai industri makanan. Van hoek et al. [32] menunjukkan bahwa kualitas ragi roti komersial (S. cerevisiae) ditentukan oleh banyak parameter termasuk penyimpanan, stabilitas, osmotolerance, resistensi beku-cair, resistensi rehidratasi dan warna.
Dalam kondisi aerobik, pembentukan etanol terjadi ketika konsentrasi glukosa sisa lebih tinggi dari 0,1 g L-1 dimana laju pertumbuhan spesifik melebihi nilai kritis Dc [4,33-35].
Namun demikian, kekhasan ini cukup tidak diinginkan selama produksi biomassa karena mengurangi hasil biomassa pada bahan baku karbon. Untuk alasan ini, produksi industri starter ragi dilakukan secara aerobik, kultur fed-batch terbatas gula. Optimalisasi proses produktivitas kemungkinan memerlukan peningkatan yang lebih tinggi dari laju pertumbuhan spesifik dan/atau dari hasil biomassa. Proses optimasi sejauh ini berdasarkan strain pilihan dan optimasi empiris dari parameter lingkungan seperti pH, suhu, laju aerasi, dan profil tambahan gula, nitrogen dan fosfor [36-38].
penundaan terjadinya pergeseran metabolisme setelah peningkatan tiba-tiba dari konsentrasi glukosa dalam kisaran beberapa menit.
Dengan demikian, penggunaan asam oleat oleh industri dalam proses tersebut dapat menyebabkan pengelolaan yang lebih baik dalam masalah heterogenitas ketika terjadi efek Crabtree yang tidak diinginkan. Selain itu, kami menunjukkan bahwa dampak oleat tidak tergantung strain tetapi reversibel. Oleh karena itu, persiapan starter ragi dengan oleat sebagai co-substrat glukosa dapat digunakan dalam berbagai aplikasi, menerapkan efek Crabtree atau tidak.
Kesimpulan
Dalam penelitian ini kami menunjukkan bahwa penambahan asam oleat sebagai co-substrat glukosa diperbolehkan untuk mengurangi terjadinya efek "jangka pendek" serta "jangka panjang" efek Crabtree. Dalam kedua kasus, produksi biomassa secara luas ditingkatkan dengan mengorbankan etanol, dan telah dilaporkan peningkatan 8 % dalam tingkat pengenceran kritis. Karena fenomena biokimia menunjukkan bukti tidak tergantung strain tetapi reversibel, aplikasi industri secara rasional digambarkan dalam berbagai keperluan yang membutuhkan kontrol yang lebih efisien dari efek Crabtree.
Metode
Strain dan Media
yang dijelaskan oleh Feria-Gervasio et al. [19], kecuali untuk teknik fed-batch. Bila menggunakan strain CA10/pCD63 media mineral dilengkapi dengan adenin dan histidin dalam kolam medium di 0,2 g L-1. Medium yang digunakan untuk percobaan fed-batch mengandung per liter : KH2PO4, 6 g; (NH4)2SO4, 12 g; MgSO4, 1 g. Vitamin sekuensial dan strategi tambahan trace elemen didasarkan pada profil pertumbuhan yang diterapkan [46] untuk mencapai per liter : EDTA, 0,03 g; ZnSO4.7H2O, 0,009 g; MnSO4.H2O, 0,002 g; CoCl2.6H2O, 0,0006 g; CuSO4.5H2, 0,0006 g; Na2MoSO4.2H2O, 0,008 g; CaCl2.2H2O, 0,009 g; (NH4)2Fe(SO4)6.6H2, 0,006 g; H3BO3, 0,002 g; D-biotin, 0,00024 g; D-L-asam pantotenat, 0,005 g; asam nikotinat, 0,005 g; myo– inositol, 0,125 g; tiamin, 0,005 g; pirodoksin, 0,005 g; asam para-aminobenzoat, 0,001 g.
Kultur Chemostat Dengan S. cerevisiae CA10/pCD63
Kultur chemostat dengan glukosa sebagai sumber karbon tunggal dan dengan penambahan oleat-glukosa dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Feria-Gervasio et al. [19]. Tingkat pengenceran yang ditetapkan sebesar 0,18h-1 untuk S. cerevisiae CA10/pCD63 untuk menjaga sel-sel di bawah metabolisme oksidatif murni. Bioreaktor diberi tambahan media mineral dengan glukosa pada 38 g L-1 untuk chemostat glukosa dan 39 g L-1 untuk chemostat oleat-glukosa. Chemostat oleat-glukosa ini juga fed dengan 720 g L-1 larutan asam oleat pada tingkat pengenceran 0,0041h-1.
Setelah pembentukan steady state, enam sampel independen diambil selama periode 40 jam untuk karakterisasinya. Kemudian pulse glukosa dilakukan dengan menyuntikkan larutan glukosa yang volumenya diketahui 600 g L-1 untuk mendapatkan konsentrasi dalam reaktor 10 g L-1. Pompa influen dan efluen berjalan terus menerus selama percobaan. Percobaan ini dilakukan dua kali untuk setiap kondisi dalam dua chemostat independen.
Teknik accelerostat (A-Stat) terdiri dari prosedur kultivasi berkelanjutan yang dikontrol komputer dengan perubahan kecil dari tingkat pengenceran [47]. Kultur accelerostat dilakukan dengan strain CEN.PK 113-7D dalam kondisi yang sama seperti untuk kultur chemostat, dengan konsentrasi glukosa 37 g L -1 untuk A-stat glukosa dan 38 g L-1 untuk A-stat oleat-glukosa. A-stat yang
diluncurkan ketika kultur chemostat steady state yang stabil pada D0=0,16h-1 oleh peningkatan linear laju pengenceran dengan laju percepatan konstan α = 0,005h-2, dimana Dt berubah dengan waktu mengikuti :
Dt = D0 + α * t
Dimana: Dt adalah tingkat pengenceran untuk instan "t"; D0 mewakili tingkat pengenceran awal; α adalah tingkat percepatan konstan dan t waktu dalam jam.
Kultur Batch Dengan S. cerevisiae CEN.PK 113-7D
Kultivasi VHEP Fed-batch Dengan S. cerevisiae CEN.PK 113-7D
kultur chemostat oksidatif pada oleat-glukosa [48]. Ketika trehalosa sepenuhnya dikonsumsi, tambahan glukosa mencapai 100 g L-1 dan kultur dilakukan seperti dijelaskan di atas. Perkiraan etanol dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Pagliardini et al. [31] dan diperhitungkan untuk perhitungan untuk lebih lanjut.
Analisis Off-gas
Komposisi gas inlet dan outlet dianalisis dengan spektrometri massa. Untuk chemostats dan A-stat, analisis dilakukan setiap 5 menit selama steady state, setiap 45 s selama akselerasi A-stat dan setiap 5 s selama pulse dinamis dengan PRIMA 600s (gas VG, Manchester, Inggris). Untuk batch dan fed-batch, analisis dilakukan setiap 5 menit dengan Proline Dycor (Instrument Proses Ametek, Berwyn, USA). Aerasi dimulai 1 jam setelah inokulasi untuk menghindari kehilangan CO2 dari media dan kemudian mencegah fase lag. Tingkat produksi CO2 dan tingkat konsumsi O2 dihitung seperti yang dijelaskan oleh Poilpre et al. [49] untuk chemostats, A-stat dan batch, dan mempertimbangkan evolusi volume cairan dan gas, aliran udara inlet, suhu dan tekanan. Respiratory Quotient (RQ) diberikan oleh rasio molar antara rCO2 dan rO2.
Penentuan Biomassa
dengan 500 μl iso-propanol untuk menghilangkan asam oleat. Campuran divortex selama 1 menit dan disentrifugasi selama 3 menit pada 12.000×g. Butiran diresuspensi dalam 500 μl air untuk pengukuran spektrofotometri. Untuk penentuan berat kering sel, membran dicuci setelah penyaringan dengan heksana dan air untuk menghilangkan asam oleat. Hal ini untuk memeriksa bahwa iso-propanol dan heksana tidak merusak sel-sel.
Penentuan Viabilitas Sel
Pewarnaan sel dengan metode metilen biru [50] digunakan untuk menjelaskan penentuan viabilitas sel [46]. Dengan adanya oleat, suspensi sel disiapkan seperti suspensi sel untuk menjelaskan prosedur sebelum pewarnaan.
Analisis Metabolit
Sampling untuk analisis metabolit dilakukan dengan sampling kaldu langsung dari bioreaktor melalui membran poliamid steril dengan ukuran pori 0,45 pM (Sartorius AG, Göttingen, Jerman). Permeat dapat dianalisis langsung (chemostats dan A-stat) atau dibekukan pada -20 ° C untuk analisis lebih lebih lanjut (batch dan fed-batch).
Dalam percobaan, konsentrasi glukosa dianalisa dengan metode enzimatik dengan YSI Model analyzer 27 A (YSI Life Science, Yellow Springs, USA). Penentuan akurat glukosa, etanol, gliserol dan asam organik dari permeat dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) seperti yang dijelaskan oleh Alfenore et al. [46]. Untuk chemostats dan A-stat, konsentrasi etanol dan asam asetat ditentukan dengan kromatografi gas seperti yang dijelaskan oleh Feria-Gervasio et al. [19].
menggunakan kolom 250*4,6 mm C18 (Interchim, Montluçon, Prancis). Suhu kolom ditetapkan pada 50°C dan 3% (v/v) asam asetat dalam larutan metanol yang digunakan sebagai pembawa dengan laju alir 1 ml min-1. Deteksi dilakukan dengan refraktometer. Kedua, supernatan diolah dengan 0,2 mol L-1 trimetilsulfonium hidroksida dalam larutan metanol untuk mengubah asam lemak menjadi molekul volatil oleh metilasi fungsi karboksiliknya. Kemudian sampel dianalisis dengan kromatografi gas menggunakan 50 m*0,25 mm CP-select CB untuk FAME leburan silika WCOT (Varian, Palo Alto, USA). Suhu injektor diatur pada 140°C dan suhu kolom awalnya ditetapkan pada 50°C, kemudian ditingkatkan menjadi 240°C dengan profil sebagai berikut: 8°C min-1 selama 3 menit; 13°C min-1 selama 5 menit; 1.5°C min-1 selama 27 menit; 5°C min-1 selama 12 menit dan isoterm akhir dari 10 menit. Gas Nitrogen digunakan sebagai pembawa dengan laju alir 50 ml.min-1 dan deteksi dilakukan oleh FID pada 250°C.
Kepentingan Bersaing
Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki kepentingan untuk bersaing.
Kontribusi Penulis
JM, DFG dan JRM bekerja sama pada proyek ini dan ketiganya dianggap sebagai penulis pertama. JM, DFG dan SG berkontribusi pada percobaan kultur sel SG memikirkan studi ini, dan berpartisipasi dalam desain dan membantu untuk menyusun naskah. Semua penulis membaca dan menyetujui naskah akhir.
Pengakuan
Futurol. Penulis berterimakasih kepada OSEO Innovation untuk partisipasinya dalam pendanaan proyek Futurol dan C.O.N.A.C.Y.T (Meksiko) untuk dukungan doktor keuangan Mr. Feria-Gervasio.
Daftar Pustaka
1. Crabtree HG: Observations on the carbohydrate metabolism of tumours. Biochem J 1929, 23:536–545.
2. De Deken RH: The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. J Gen Microbiol 1966, 44:149–156.
3. Fiechter A, Fuhrmann GF, Käppeli O: Regulation of glucose metabolism in growing yeast cells. Adv Microb Physiol 1981, 22:123–183.
4. Petrik M, Käppeli O, Fiechter A: An expanded concept for the glucose effect in the yeast Saccharomyces uvarum : involvement of short-and long-term regulation. J Gen Microbiol 1983, 129:43–49.
5. Beck C, von Meyenburg HK: Enzyme pattern and aerobic growth of Saccharomyces cerevisiae under various degrees of glucose limitation. J Bacteriol 1968, 96:479–486.
6. Käppeli O, Sonnleitner B: Regulation od sugar metabolism in Saccharomyces cerevisiae-type yeast: experimental and conceptual considerations. Crit Rev Biotechnol 1986, 4:299–325.
7. Van Urk H, Schipper D, Breedveld GJ, Mak PR, Scheffers WA, van Dijken JP: Localization and kinetics of pyruvate-metabolizing enzymes in relation to aerobic alcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 and Candida utilis CBS 621.
Biochim Biophys Acta 1989, 992:78–86.
8. Verduyn C, Postma E, Scheffers WA, Van Dijken JP: Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation. Yeast
1992, 8:501–517.
growth of Saccharomyces cerevisiae on glucose. Yeast 1996, 12:247–257.
10. Meaden PG, Dickinson FM, Mifsud A, Tessier W, Westwater J, Bussey H, Midgley M: The ALD6 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes a cytosolic, Mg(2+)-activated acetaldehyde dehydrogenase. Yeast
1997, 13:1319–1327.
11. De Jong-Gubbels P, Van Den Berg MA, Luttik MA, Steensma HY, Van Dijken JP, Pronk JT: Overproduction of acetyl-coenzyme A synthetase isoenzymes in respiring Saccharomyces cerevisiae cells does not reduce acetate production after exposure to glucose excess. FEMS Microbiol Lett 1998, 165:15–20.
12. Van Hoek P, Flikweert MT, van der Aart QJ, Steensma HY, van Dijken JP, Pronk JT: Effects of pyruvate decarboxylase overproduction on flux distribution at the pyruvate branch point in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol 1998, 64:2133–2140.
13. Remize F, Andrieu E, Dequin S: Engineering of the pyruvate
14. Saint-Prix F, Bönquist L, Dequin S: Functional analysis of the ALD gene family of Saccharomyces cerevisiae during anaerobic growth on glucose: the NADP+−dependent Ald6p and Ald5p isoforms play a major role in acetate formation. Microbiology 2004, 150:2209–2220.
15. De Jong-Gubbels P, Bauer J, Niederberger P, Stückrath I, Kötter P, van Dijken JP, Pronk JT: Physiological characterisation of a pyruvate-carboxylase-negative Saccharomyces cerevisiae mutant in batch and chemostat cultures. Antonie Van Leeuwenhoek 1992, 74:253– 263.
17. Van Maris AJ, Bakker BM, Brandt M, Boorsma A, Teixeira de Mattos MJ, Grivell LA, Pronk JT, Blom J: Modulating the distribution of fluxes among respiration and fermentation by overexpression of HAP4 in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res 2001, 1:139–149.
18. Vemuri GN, Eiteman MA, McEwen JE, Olsson L, Nielsen J: Increasing NADH oxidation reduces overflow metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104:2402–2407.
19. Feria-Gervasio D, Mouret J-R, Gorret N, Goma G, Guillouet SE: Oleic acid delays and modulates the transition from respiratory to fermentative metabolism in Saccharomyces cerevisiae after exposure to glucose excess. Appl Microbiol Biotechnol 2008, 78:319–331.
20. Van Roermund CWT, Elgersma Y, Singh N, Wanders RJA, Tabak HF: The membrane of peroxisomes in Saccharomyces cerevisiae is impermeable to NAD(H) and acetyl-CoA under in vivo conditions.
EMBO J 1995, 14:3480–3486.
21. Kal AJ, Van Zonneveld AJ, Benes V, Van Den Berg M, Koerkamp MG, Albermann K, Strack N, Ruijter JM, Richter A, Dujon B, Ansorge W, Tabak HF: Dynamics of gene expression revealed by comparison of serial analysis of gene expression different carbon sources. Mol Biol Cell 1999, 10(June):1859–1872.
22. Casalone E, Barberio C, Cavalieri D, Polsinelli M: Identification by functional analysis of the gene encoding a-isopropylmalate synthase II ( LEU9) in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 2000, 16:539–545.
23. Van Roermund CWT, Waterham HR, Ijlst L, Wanders RJA: Fatty acid metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Cell Mol Life Sci 2003, 60:1838–1851.
24. Chen Y, Siewers V, Nielsen J: Profiling of cytosolic and peroxisomal acetyl-CoA metabolism in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One
2012, 7:e42475.
increasing NADPH production capacity aerobically in different cellular compartments. Metab Eng 2004, 6:352–363.
26. Camarasa C, Grivet J-P, Dequin S: Investigation by 13C-NMR and tricarboxylic acid (TCA) deletion mutant analysis of pathways for succinate formation in Saccharomyces cerevisiae during anaerobic fermentation. Microbiology 2003, 149:2669–2678.
27. Jones RP, Greenfield PF: Effect of carbon dioxide on yeast growth and fermentation. Enzyme Microb Technol 1982, 4:210–223.
28. Ansell R, Granath K, Hohmann S, Thevelein JM, Adler L: The two isoenzymes for yeast NAD+ −dependent glycerol 3-phosphate dehydrogenase encoded by GPD1 and GPD2 have distinct roles in osmoadaptation and redox regulation. EMBO J 1997, 16:2179– 2187.
29. Alfenore S, Cameleyre X, Benbadis L, Bideaux C, Uribelarrea J-L, Goma G, Molina- Jouve C, Guillouet SE: Aeration strategy: a need for very high ethanol performance in Saccharomyces cerevisiae fed-batch process. Appl Microbiol Biotechnol 2004, 63:537–542.
30. Bideaux C, Alfenore S, Cameleyre X, Molina-jouve C, Uribelarrea J, Guillouet E: Minimization of glycerol production during the high-performance fed-batch ethanolic fermentation process in Saccharomyces cerevisiae, using a metabolic model as a prediction tool. Appl Environ Microbiol 2006, 72:2134–2140.
31. Pagliardini J, Hubmann G, Bideaux C, Alfenore S, Nevoigt E, Guillouet SE: Quantitative evaluation of yeast’s requirement for glycerol formation in very high ethanol performance fed-batch process.
Microb Cell Fact 2010, 9:36.
32. Van Hoek PIM, van Dijken JP, Pronk JT: Effect of specific growth rate on fermentative capacity of baker’s yeast. Appl Environ Microbiol
1998, 64:4226–4233.
34. Verduyn C, Zomerdijk TPL, Dijken JP, Scheffers WA: Continuous measurement of ethanol production by aerobic yeast suspensions with an enzyme electrode. Appl Microbiol Biotechnol 1984, 19:181– 185.
35. Van Urk H, Mark PR, Scheffers WA, van Dijken JP: Metabolic responses of Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 and Candida utilis CBS 621 upon transition from glucose limitation to glucose excess.
Yeast 1988, 4:283–291.
36. Chen SL, Chiger M: Production of Baker’s Yeast, Comprehensive Biotechnology, Vol. 3. Oxford: Pergamon P; 1985:429–455.
37. Kristiansen B: Integrated Design of a Fermentation Plant: The Production of Baker’s Yeast. New-York: Weinheim; 1994.
38. Reed G, Nagodawithana W: Yeast Technology. 2nd edition. Michigan University: Van Nostrand Reinhold; 1991. 261–313 and 315–368.
39. Bylund F, Collet E, Enfors S-O, Larsson G: Substrate gradient formation in the largescale bioreactor lowers cell yield and increases by-product formation. Bioprocess Eng 1998, 18:171–180.
40. Bylund F, Guillard F, Enfors S-O, Trägårdh C, Larsson G: Scale down of recombinant protein production: a comparative study of scaling performance. Bioprocess Eng 1999, 20:377.
41. Vrabel P, van der Lans R, Cui Y, Luyben K: Compartment model approach: Mixing in large scale aerated reactors with multiple impellers. Chem Eng Res Des 1999, 77:291– 302.
42. Enfors SO, Jahic M, Rozkov A, Xu B, Hecker M, Jürgen B, Krüger E, Schweder T, Hamer G, O’Beirne D, Noisommit-Rizzi N, Reuss M, Boone L, Hewitt C, McFarlane C, Nienow A, Kovacs T, Trägårdh C, Fuchs L, Revstedt J, Friberg PC, Hjertager B, Blomsten G, Skogman H, Hjort S, Hoeks F, Lin HY, Neubauer P, van der Lans R, Luyben K,
et al: Physiological responses to mixing in large scale bioreactors.
43. Lara AR, Taymaz-Nikerel H, Mashego MR, Van Gulik WM, Heijnen JJ, Ramírez OT, Van Winden WA: Fast dynamic response of the fermentative metabolism of Escherichia coli to aerobic and anaerobic glucose pulses. Biotechnol Bioeng 2009, 104:153–161.
44. Van Dijken J, Bauer J, Brambilla L, Duboc P, Francois J, Gancedo C, Giuseppin M, Heijnen J, Hoare M, Lange H, Madden E, Niederberger P, Nielsen J, Parrou J, Petit T, Porro D, Reuss M, van Riel N, Rizzi M, Steensma H, Verrips C, Vindeløv J, Pronk J: An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains. Enzyme Microb Technol 2000, 26:706–714.
45. Duport C, Spagnoli R, Degryse E, Pompon D: Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast. Nat Biotechnol 1998, 16:186–189.
46. Alfenore S, Molina-Jouve C, Guillouet SE, Uribelarrea J-L, Goma G, Benbadis L: Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process. Appl Microbiol Biotechnol 2002, 60:67–72.
47. Paalme T, Kahru A, Elken R, Vanatalu K, Tiisma K, Raivo V: The computer-controlled continuous culture of Escherichia coli with smooth change of dilution rate ( A-stat ). J Microbiol Methods
1995, 24:145–153.
48. Mouret JR, Jacobsen JN, Guillouet SE: Kinetic analysis of a trehalase-overexpressing strain grown on trehalose: a new tool for respiro-fermentative transition studies in Saccharomyces cerevisiae. Lett Appl Microbiol 2006, 42:363–368.
49. Poilpre E, Tronquit D, Goma G, Guillou V: On-line estimation of biomass concentration during transient growth on yeast chemostat culture using light reflectance. Biotechnol Lett 2002, 24:2075–2081.
50. Postgate J: Viable counts and viability. In Methods in Microbiology.
