BAB 4 METODE PENELITIAN. Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian eksperimental dan

(1)

26

METODE PENELITIAN

1.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian eksperimental dan

metode yang digunakan adalah post test only control group design yaitu

rancangan penelitian yang hasil penelitiannya diamati setelah perlakuan

selesai.

1.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang. Pembuatan perasan buah

apel dilakukan di Laboratorium Biomedik Universitas Muhammadiyah

Malang. Penelitian ini dilakukan selama 2 bulan, mulai bulan Oktober tahun

2018.

1.3 Populasi dan Sampel

1.3.1 Populasi

Populasi pada penelitian ini adalah semua tikus putih jantan

(Rattus norvegicus strain wistar).

1.3.2 Sampel

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus putih

jantan (Rattus Norvegicus strain wistar) dengan berat 150-200 gram

dan berumur 2-3 bulan dengan kondisi sehat yang ditandai dengan

(2)

1.3.3 Besar Sampel

Terdapat 5 kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol positif

(+), kontrol negatif (-), dan 3 kelompok perlakuan. Penentuan besar

replikasi sampel dalam penelitian ditentukan menggunakan rumus

pada Sample Size Calculation in Animal Studies tahun 2017, yakni

sebagai berikut:

Tabel 4.1 Rumus penentuan jumlah sampel

Annova Design Application Minimum n/grup Maximum n/grup One-way Annova Group Comparasion 10/k +1 20/k+1 Keterangan:

n : Jumlah subjek tiap kelompok

k : Jumlah kelompok

Sesuai dengan rumus tersebut maka untuk mendapat sampel atau

jumlah subjek tiap kelompoknya dapat dikalkulasikan sebagai

berikut :

Jumlah sampel minimum

n = 10/k +1

n = 10/5 +1

n = 3

Jumlah sampel maksimum

n = 20/k +1

n = 20/5 +1

(3)

Sehingga dalam penelitian ini jumlah sampel tiap kelompoknya

adalah 4, karena diantara rentang jumlah sampel minimum dan

maksimum. Sehingga, jika dijumlahkan pada peneliatian ini

digunakan kurang lebih 20 sampel.

1.3.4 Teknik Pengambilan Sampel

Teknik pengambilan sampel menggunakam simple random

sampling.

1.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian

1.3.5.1 Kriteria Inklusi

1. Tikus Rattus Novergicus Strain Wistar jenis kelamin

jantan

2. Umur 2–3 bulan

3. Berat Badan 150 – 200 gram

4. Tikus dalam keadaan sehat, ditandai dengan gerakannya

yang aktif, bulu yang tebal, mata yang jernih

1.3.5.2 Kriteria Eksklusi

1. Tikus yang sudah pernah digunakan dalam penelitian

lain

2. Tikus sakit selama proses perlakuan (gerakan tidak aktif,

tidak mau makan, rambut kusam atau rontok atau botak

dan keluarnya eksudat yang tidak normal)

(4)

masa adaptasi di laboratorium

4. Tikus yang mati selama penelitian

1.3.6 Variabel Penelitian

1.3.6.1 Variabel Bebas

Perasan buah apel

1.3.6.2 Variabel Tergantung

Penurunan kadar IgE dalam serum darah

1.4 Definisi operasional

a. Buah apel (Malus sylvestris) yang digunakan adalah buah apel Malang

yang segar dan cukup matang. Buah apel ini didapatkan dari perkebunan

apel di Kota Batu. Perasan buah apel yang digunakan adalah cairan yang

didapat dari buah apel yang diperas dan disaring sehingga tersisa airnya

saja. Perasan buah apel tersebut berupa cairan kecoklatan, dengan

berwarna hijau kekuningan. Volume perasan buah apel yang akan

diberikan sebanyak 3 ml, sebelumnya dilakukan titrasi di mana

masing-masing perasan buah apel konsentrasinya 15%, 20%, dan 25%. Perasan

buah apel menggunakan skala data rasio.

b. Ovalbumin (OVA) adalah protein dari putih telur. Ovalbumin digunakan

untuk menstimulasi reaksi alergi dalam tes atau uji alergi. Pembuatan

larutan ovalbumin sebagai alergen dapat dilakukan dengan

menggunakan putih telur ayam ras sebanyak 50 ml putih telur ayam ras

kemudian diaduk hingga tidak terdapat gumpalan. Sensitisasi dengan

(5)

salin secara i.p pada hari ke-1, ke-7 dan ke-14. Selanjutnya sensitisasi

ulangan dengan inhalasi ovalbumin 1% dalam 10 ml normal salin secara

inhalasi dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit pada hari ke-

19 dan hari ke-22. Ovalbumin menggunakan skala data rasio.

c. Tikus putih (Rattus novergicus strain wistar) adalah hewan percobaan

tikus jenis Rattus novergicus, strain wistar, jenis kelamin jantan, berusia

2-3 bulan dengan berat badan 150-200 gram, yang dalam keadaan sehat,

ditandai dengan gerakannya yang aktif, bulu yang tebal, mata yang

jernih.

d. Kadar imunoglobulin E (IgE) pada tikus alergi akan meningkat.

Pemeriksaan IgE yang dilakukan adalah pemeriksaan IgE total untuk

mengetahui ada atau tidaknya penurunan kadar IgE. Untuk melakukan

pemeriksaan IgE, diambil serum darah dari tikus. Serum disimpan dalam

aliquot 100 µl pada suhu -20 c dan diperiksa dengan ELISA. Skala data yang digunakan adalah skala data rasio.

4.5 Alat dan Bahan

4.5.1 Alat

4.5.1.1 Alat Pemeliharaan Tikus

a. Kandang tikus dan penutup

b. Tempat makan dan minum

c. Timbangan analitik

d. Sekam

4.5.1.2 Alat Pembuatan Perasan Buah Apel

(6)

b. Pisau c. Timbangan analitik d. Pengaduk e. Plastik f. Handscoon g. Tisu 4.5.1.3 Alat Perlakuan a. Nebulizer b. Handscoon c. Masker d. Tisu e. Sonde modifikasi f. Gelas beker g. Spuit 5ml

h. Neraca berat badan

i. Label

4.5.1.4 Alat Pengambilan Darah

a. Jarum

b. Pipet mikro 50μi

4.5.1.5 Alat lain

a. ELISA

b. Rak dan tabung reaksi

c. Aliquot

(7)

e. Mikropipet

f. Gelas ukur

g. Kamera digital

4.5.2 Bahan

a. Buah apel (Malus sylvestris)

b. Al(OH)3

c. Normal salin

d. Putih telur ayam

e. Aquades

f. Pakan standar BR-1

4.6 Prosedur Penelitian

4.6.1 Adaptasi

Proses adaptasi hewan coba dalam kandang dilakukan

selama 7 hari dengan tujuan agar tikus menyesuaikan diri terhadap

lingkungan yang baru. Selama adaptasi, tikus diberikan pakan

standar BR-1 yang diberikan 1 kali sehari. Jika ada sisa makanan,

maka sisanya dibuang lalu diganti dengan yang baru. Tikus juga

diberi minum aquades secukupnya. Pada masa aklimatisasi, tikus

ditimbang berat badannya.

4.6.2 Pengelompokan Hewan Coba

Tikus yang digunakan sebanyak 20 ekor yang terbagi

(8)

a. Kontrol negative (K-): Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40

g/hari/tikus serta minum ad libitum selama 30 hari. Nilai kontrol

negatif hanya untuk nilai normal dan tidak dimasukkan dalam

analisis data.

b. Kontrol positif (K+): Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40

g/hari/tikus serta minum ad libitum. Ditambah dengan

pemberian ovalbumin 70 µg dan 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4 ml

normal salin secara intraperitoneal pada hari pertama, hari

ke-tujuh dan hari ke-empat belas, dan diberi ovalbumin 7% dalam

10 ml normal salin secara inhalasi dengan menggunakan

nebulizer selama 30 menit pada hari ke- sembilan belas dan hari ke-dua puluh dua.

c. Kelompok I (P1): Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40

nebulizer selama 30 menit pada hari ke-sembilan belas dan hari ke-dua puluh dua. Serta diberikan perasan buah apel sebesar 3

ml konsentrasi 15% secara peroral.

d. Kelompok II (P2): Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40

(9)

e. Kelompok III (P3): Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40

Mulai hari pertama perlakuan, tikus kelompok I, II, dan

III diberikan perasan apel secara per oral dengan dosis yang

berbeda-beda sesuai dengan kelompoknya. Pada hari pertama,

hari ke-tujuh dan hari ke-empat belas dilakukan sensitisasi

dengan pemberian ovalbumin (OVA) 70µg secara

intraperitoneal. Selanjutnya sensitisasi ulangan pemberian

ovalbumin 7% dalam 10 ml normal salin dengan menggunakan

nebulizer selama 30 menit pada hari ke- sembilan belas dan hari ke-dua puluh dua. Kemudian, pada hari ke-dua puluh tiga

(10)

dihentikan semua perlakuan yang diberikan. Selanjutnya

dilakukan pengambilan serum darah untuk mengukur kadar IgE.

4.6.3 Dasar Penentuan Dosis

Rekomendasi perasan buah Apel Malang (Malus Sylvestris)

untuk manusia dikonsumsi sebanyak 200 ml perhari (Cempaka,

Santoso, & Tanuwijaya, 2014). Sehingga dilakukan konversi dosis

dari manusia ke tikus menjadi 2 ml/200gBB perhari sesuai tabel

berikut ini.

Tabel 4.2 Konversi dosis menurut Laurence dan Bacharach (1964)

(Anggara, 2009)

Dilakukan konversi untuk dosis pada tikus dengan perhitungan:

Faktor konversi = 0,018 Dosis Tikus = 200 ml/70kg BB x 0,018 = 3,6 ml/200g BB = 4 ml/200gBB 4 𝑥

=

200 150 = x = 3 ml 200 g Tikus 400 g Marmot 1,5 kg Kelinci 4,0 kg Kera 12,0 kg Anjing 70 kg Manu sia 200 g Tikus 1,0 1,74 3,9 17,8 17,8 56,0 400 g Marmot 0,57 1,0 2,25 10,2 10,2 31,5 1,5 kg Kelinci 0,25 0,44 1,0 4,5 4,5 14,2 4,0 kg Kera 0,11 0,19 0,42 1,9 1,9 6,1 12,0 kg Anjing 0,06 0,10 0,22 1,0 1,0 3,1 70 kg Manusia 0,018 0,031 0,07 0,16 0,32 1,0

(11)

Pada penelitian sebelumnya dengan menggunakan mencit,

didapatkan dosis pemberian ovalbumin adalah 10µg dan 2 mg

Al(OH)3 dalam 0,2 ml normal salin secara i.p, serta pemberian

inhalasi dengan dosis 1% dalam 10 ml normal salin. Sehingga jika

dikonversikan dengan menggunkan tabel konversi dengan faktor

pengali adalah 7 maka didapatkan dosis pemberian ovalbumin

secara i.p pada penelitian ini sebesar 70µg dan 14 mg Al(OH)3

dalam 1,4 ml normal salin, dan dosis pemberian ovalbumin secara

inhalasi sebesar 7% dalam 10 ml normal salin.

4.6.4 Pemberian Perasan Buah Apel

Dosis perasan buah apel (Malus sylvestris) yang diberikan,

yaitu sebesar:

Dosis I : 3 ml konsentrasi 15%;

Dosis II: 3 ml konsentrasi 20%;

Dosis III: 3 ml konsentrasi 25%.

Penelitian Widyaningtyas, Widodo & Sunnah tahun 2014,

membuktikan perasan buah apel (Malus domestica) varietas Red

Delicious kadar 20% memiliki efek anti alergi terhadap respon anafilaksis pada tikus jantan galur Wistar.

4.6.5 Pembuatan Perasan Buah Apel

Buah Apel (Malus sylvestris) sebanyak 100 gram buah apel

diperas dengan menggunakan juicer dan disaring airnya. Kemudian

hasil perasan tersebut dibuat dalam kadar 3 ml dengan konsentrasi

(12)

a. Kadar 15% : Perasan buah apel (Malus sylvestris) murni yang

telah dibuat dalam proses juicing dilarutkan dalam aquades

dengan takaran 15 ml untuk perasan buah apel dan 100 ml untuk

aquades, kemudian dibagi dalam dosis 3 ml untuk pemberian

satu tikus coba.

b. Kadar 20% : Perasan buah apel (Malus sylvestris) murni yang

satu tikus coba.

c. Kadar 25% : Perasan buah apel (Malus sylvestris) murni yang

satu tikus coba.

4.6.6 Identifikasi Flavonoid

a. Sebanyak 1 ml perasan buah apel ditambah 3 tetes NaOH 0,1 N

lalu diamati warnanya. Flavonol akan memberikan warna

kuning (Harborne, 1987).

b. Sebanyak 1 ml perasan buah apel ditambah 3 tetes H2SO4 pekat

lalu diamati warnanya. Flavonol memberikan warna jingga

(13)

4.6.7 Pembuatan Larutan Ovalbumin

Pembuatan larutan ovalbumin sebagai alergen dapat

dilakukan dengan menggunakan putih telur ayam ras sebanyak 50

ml putih telur ayam ras kemudian diaduk hingga tidak terdapat

gumpalan.

4.6.8 Pengambilan Sampel Darah dan Pengukuran Kadar IgE dengan

ELISA

Dilakukan sampling serum darah yang diperoleh dengan

lethal cardiac puncture pada tikus yang telah dianastesi 24 jam setelah paparan OVA atau normal salin terakhir. Serum tersebut

disimpan dalam 100 μl aliquot pada suhu -20ºC untuk pemeriksaan

total IgE dengan ELISA.

4.6.9 Penguburan Hewan Coba

Tikus yang telah diberi perlakuan akan diteliti dipastikan

mati, bangkai tikus diletakkan dalam wadah baskom. Bangkai tikus

percobaan dikubur di tanah dengan kedalaman 50 cm dan luas

lubang 0, 25 m². Setiap lubang hanya digunakan untuk mengubur 10

tikus secara bersama. Lubang ditutup kembali dengan tanah lalu

lubang dipadatkan agar tidak tercium bau dari bangkai tikus

(14)

4.7 Alur Penelitian

-Diberi pakan standar BR-1 (15 gram) dan air minum

-Pada hari ke-1, ke-7 dan ke-14 diinduksi

ovalbumin 70 µg dan 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4

ml normal salin secara i.p Diberi pakan standar BR-1 (15 gram) dan air minum pada hari ke-1 sampai ke-22. P 1 P 2 P 3

-Diberi pakan standar BR-1 (15 gram) dan air minum.

-Pada hari ke-19 sampai ke-22 diberi ovalbumin 7% dalam 10 ml normal salin dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit per hari.

Diberi perasan apel 3 mL 15% secara peroral Diberi perasan apel 3mL 20% secara peroral Diberi perasan apel 3 mL 25% secara peroral

Pengambilan serum untuk pemeriksaan IgE dalam ELISA

Pengumpulan data

Analisis data

Adaptasi hewan coba

Pengelompokan hewan coba

Kontrol - (K-) Kontrol + (K+) P 1 P 2 P 3

-Diberi pakan standar BR-1 (15 gram) dan air minum

-Pada hari ke-1, ke-7 dan ke-14 diinduksi ovalbumin 70 µg dan 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4 normal salin secara

i.p

-Diberi pakan standar BR-1 (15 gram) dan air minum.

-Pada hari ke-19 sampai ke-22 diberi ovalbumin 7% dalam 10 ml normal salin dengan

menggunakan nebulizer selama 30 menit per hari. Ha ri 1 – 14 H ar i 15 - 22

(15)

4.8 Analisis Data

Data-data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisa menggunakan uji

normalitas, uji homogenitas, uji ANOVA, uji post hoc test, uji korelasi dan uji

regresi yang pengolahannya menggunakan SPSS 20.

a. Uji Normalitas

Data-data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis menggunakan uji

normalitas dengan metode Shapiro-Wilk, karena besar sampel yang digunakan ≤ 50. Uji normalitas digunakan untuk mengetahui apakah

distribusi data normal. Sebaran data dinilai normal jika p>0,05. Jika sebaran

data normal, maka dilanjutkan dengan uji ANOVA, sedangkan jika sebaran

data tidak normal, dilanjutkan dengan uji Kruskal-Wallis dan post hoc

Mann-Whitney. b. Uji Homogenitas

Uji homogenitas dilakukan untuk mengetahui persebaran data,

kehomogenan varian dari data-data yang diperoleh. Uji homogenitas menggunakan uji varian Levene’ test untuk mengetahui kehomogenan

varian dari data-data yang diperoleh. Varian dinilai homogen jika p>0,05.

Jika varian data homogen, maka dilanjutkan dengan uji post hoc Bonferroni,

sedangkan jika varian data berbeda atau tidak homogen, maka dilanjutkan

dengan uji post hoc Tamhane.

c. Uji ANOVA

Uji ANOVA digunakan untuk mengetahui adanya perlakuan terhadap

pengamatan. Sebelum uji ANOVA telah dilakukan uji normalitas untuk

(16)

homogenitas untuk mengetahui kehomogenan varian dari data yang

diperoleh (data bersifat homogen jika sig >0,05). Selanjutnya untuk

membandingkan rata-rata dari 2 kelompok percobaan atau lebih, dengan

tingkat kepercayaan ∝=0,05, apabila diperoleh ∝>0,05 artinya tidak ada

perbedaan yang bermakna sebaliknya apabila ∝<0,05 menunjukkan adanya

perbedaan yang bermakna.

d. Uji Post Hoc

Uji Post Hoc merupakan uji kelanjutan dari uji ANOVA, digunakan untuk

mengetahui perbedaan yang bermakna antara 2 kelompok perlakuan dalam

penelitian. Uji post hoc Bonferroni kelanjutan dari uji ANOVA jika varian

data homogen. Jika varian data tidak homogen menggunakan uji post hoc

Tamhane.

e. Uji Korelasi Pearson

Uji Korelasi Pearson digunakan untuk mengetahui hubungan yang

signifikan antara dosis perasan buah apel (Malus sylvestris) dengan

perlakuan (penurunan kadar IgE).

f. Uji Regresi Linier

Uji regresi linier sederhana digunakan untuk mengetahui seberapa besar

pengaruh antara dosis perasan buah apel dengan perlakuan (penurunan

(17)

4.9 Jadwal Penelitian

Tabel 4.3 Jadwal Penelitian

No Jenis Kegiatan Bulan 1 2 3 4 1 Pengurusan Izin x 2 Persiapan perasan buah apel dan hewan coba x _x 3 Adaptasi hewan, memberi makan hewan coba x 5 Perlakuan injeksi ovalbumin i.p pada hewan coba x 6 Pemberian perasan buah apel ke tikus coba x x x x 7 Pengamatan hewan coba pasca perlakuan x 8 Pengumpulan data x x x 9 Dilakukan analisis kadar IgE x x 10 Analisis Data x x 11 Konsultasi dan revisi akhir x x