Efektivitas Ekstrak Ascidian Didemnum molle untuk Pengobatan Udang Windu (Penaeus monodon) yang Terinfeksi Bakteri Vibrio harveyi.

Lampiran 1. Pembuatan Media Natrium Agar

Pembuatan Media Agar Natrium Agar (150 mL)

1. Siapkan gelas Erlenmeyer volume 250 ml dan air laut steril 150 mL. 2. Timbang natrium agar sebanyak 4,2 gram

3. Masukkan natrium agar ke dalam erlenmeyer lalu tuang air laut steril. 4. Panaskan media di atas hot plate hingga mendidih dan homogen. 5. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang telah dibungkus dengan kassa.

6. Sterilisasi media menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121oC 7. Setelah di autoclave, media didinginkan hingga suhu 45 – 50oC

8. Tuangkan media tersebut ke dalam cawan petri yang sudah steril sebanyak 8 – 10 ml dan biarkan membeku dalam keadaan tertutup.

Lampiran 2. Pembuatan Kultur Bakteri Vibrio harveyi dengan Kepadatan Sel 107 CFU/ml

1. Larutan McFarland skala 0,5 dibuat dengan 0,05 mL BaCl2 1% dan 9,95 mL H2SO4 1% ke dalam tabung reaksi kemudian diukur absorbansinya dengan menggunkan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm.

2. Isolat bakteri uji yang berada dalam cawan petri diambil dengan menggunakan kawat ose sebanyak 2-3 ose kemudian dilarutkan ke dalam 10 mL air laut steril.

3. Bandingkan larutan bakteri yang telah dilakukan dengan larutan McFarland. 4. Sebanyak 0,01 mL larutan bakteri dituang ke dalam media agar.

Larutan Vibrio harveyi dan Standar McFarland

Lampiran 3. Koordinat dan Data Parameter Fisik dan Kimia Perairan Lokasi Pengambilan Sampel

Koordinat Lokasi Pengambilan Sampel:

Area Perlindungan Laut (APL) : S 544’ 0,48” E 10636’ 39,8” Perairan Semak Daun (PSD) : S 544’ 04,9” E 10636’ 39,6” Perairan Panggang (PP) : S 544’ 00,5” E 10634’ 05,7”

1. Suhu (°C)

Koordinat Ulangan Rata-rata

(°C)

I II III

APL 29 29 29 29

PSD 28 29 29 28

PP 30 29 29 29

2. Salinitas (‰)

Habitat Ulangan Rata-rata

(‰)

I II III

APL 28 29 29 28,6

PSD 28 30 30 29,3

PP 26 27 27 26,6

3. Kecerahan (%)

Habitat Ulangan Rata-rata (%)

I II III

APL 100 100 100 100

PSD 100 100 100 100

PP 100 100 100 100

4. Kecepatan arus (m/s)

Habitat Ulangan Rata-rata

(m/s)

I II III

APL 0,14 0,17 0,17 0,16

PSD 0,13 0,06 0,07 0,08

Lampiran 4. Ekstraksi Ascidian Didemnum molle

Dikeringkan

Dihaluskan menggunakan blender

Dimaserasi 1x24 jam dengan pelarut Metanol

Diuapkan dengan Rotary Evaporator

Diagram Alir Ekstraksi Ascidian Didemnum molle Sampel Ascidian

Didemnum molle

Ascidian Didemnum molle kering

Serbuk Ascidian Didemnum molle

Disaring

Ampas Filtrat

Lampiran 5. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle pada Saat In Vitro

1 ppm = 1 mg/L = 0,001 g/L

Larutan Stok 100.000 ppm dalam 10 mL 100.000 ppm = 0,001 g/L

=0,001 g x 100.000

1000 mL

= 1 g/10 mL

Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Jembatan Stok V1 = Volum larutan stok yang dibutuhkan

V2 = Volum pengenceran yang akan dibuat M1 = Konsentrasi larutan stok

M2 = Konsentrasi pengenceran yang akan dibuat

Konsentrasi 10.000 ppm V1 x M1 = V2 x M2

V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 10.000 ppm

V1 = 50000/100000

= 0,5 mL

0,5 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,5 mL akuades

Konsentrasi 1.000 ppm V1 x M1 = V2 x M2

V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 1.000 ppm

V1 = 5000/100000

= 0,05 mL

Lanjutan Lampiran 5.

Konsentrasi 100 ppm

V1 x M1 =V2 x M2

V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 100 ppm

V1 = 500/100000

V1 = 0,005 mL

0,005 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,995 mL akuades

Konsentrasi 10 ppm

V1 x M1 = V2 x M2

V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 10 ppm

V1 = 500/100000

= 0,0005 mL

0,0005 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,9995 mL akuades

Lampiran 7. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle pada Uji LC50

Konsentrasi larutan stok yang digunakan adalah 10.000 ppm dalam volum 500 mL

10.000 ppm = 10 g/L = 10 g

1 L × 1 L

1000×500 mL

= 5

Untuk mendapatkan konsentrasi 10.000 ppm dilarutkan 5 gram ekstrak dalam 500 mL akuades.

Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Jembatan Stok V1 = Volum larutan stok yang dibutuhkan

V2 = Volum pengenceran yang akan dibuat M1 = Konsentrasi larutan stok

M2 = Konsentrasi pengenceran yang akan dibuat

Konsentrasi 1000 ppm V1 x M1 = V2 x M2

V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 1.000 ppm

V1 = 500.000/10.000

= 50 mL

50 mL dari larutan stok ditambah dengan 450 mL akuades

Konsentrasi 100 ppm

V1 x M1 = V2 x M2

V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 100 ppm

V1 = 50.000/10.000

= 5 mL

Lanjutan Lampiran 7

Konsentrasi 10 ppm

V1 x M1 = V2 x M2

V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 10 ppm

V1 = 5.000/10.000

= 0,5 mL

0,5 mL dari larutan stok ditambah dengan 499,5 mL akuades

Lampiran 8. Data Pengamatan Mortalitas Udang Windu pada Uji LC50 Selama 48 jam

Lama Perendaman

Jumlah Udang yang Mati pada Konsentrasi (ppm)

0 10 100 1000 10000

I II I II I II I II I II

15 menit - - - -

30 menit - - - 2 2

1 jam - - - 1 1 - -

2 jam - - - 1 1 - 1

4 jam - - - 1 1 1

6 jam - - - 3 1 2

8 jam - - - 2 -

16 jam - - - 2 - - -

24 jam - - - 1 - - - -

48 jam - - - -

Lampiran 9. Hasil Perhitungan LC50 dengan Menggunakan EPA Probit

EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES

Version 1.5

LC50 Didemnum molle Conc. Number

Exposed Number Responding Observation Proportion Responding Proportion Responding Adjused for Controls

Predicted Proportion Responding

10 12 0 0,0000 0,0000 0,0001

100 12 1 0,0833 0,0833 0,0822

1000 12 10 0,8333 0,8333 0,8352

10000 12 12 1,0000 1,0000 0,9996

Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.007

Chi - Square for Heterogeneity

(tabular value at 0.05 level) = 5.991

Mu = 2.587787 Sigma = 0.422818

Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --- Intercept -1.120327 1.729846 ( -4.510825, 2.270170) Slope 2.365082 0.652672 ( 1.085844, 3.644320)

Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000

Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure

Conc.

95% Confidence Limits

Lower Uper

LC/EC 1.00 40.196 2.304 104.992 LC/EC 5.00 78.036 9.253 170.563 LC/EC 10.00 111.148 19.080 224.825 LC/EC 15.00 141.116 30.726 274.165

LC/EC 50.00 387.067 180.124 810.578

Lampiran 10. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle pada Uji Tantang

1 ppm = 0,001 g/L

Ekstrak dibuat dalam 1 liter air laut.

Perlakuan B (96,75 ppm) 96,75 ppm = 0,001 g/L

= 0,001 x 96,75 = 0,09675 g/L

Perlakuan C (193,5 ppm) 193,5 ppm = 0,001 g/L

= 0,001 x 193,5 = 0,1935 g/L

Perlakuan D (96,75 ppm) 290,25 ppm = 0,001 g/L

= 0,001 x 290,25 = 0,29025 g/L

Perlakuan E (387 ppm) 387 ppm = 0,001 g/L

= 0,001 x 387 = 0,387 g/L

Lampiran 11. Dokumentasi Penelitian

Salah Satu Lokasi Pengambilan Sampel

Pengukuran Diameter Zona Hambat Menggunakan Jangka Sorong

Lanjutan Lampiran 11

Media Pemeliharaan Selama Penelitian