IV. M E T O D E PENELITIAN
4.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai 2009 hingga 2010 yang dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi, Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Analitik Jurusan Kimia, FMIPA Universitas Riau serta Laboratorium Pengujian dan Analisa Kimia Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknik Universitas Riau. Lokasi Pengambilan sampel tanah gambut berada di Cagar Biosfer GSK-BB yang terletak di Kabupaten Bengkalis-Siak dan Kota Dumai, Propinsi Riau.
4.2 Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari: alat-alat gelas, oven (655F), alat pemanas (Maspion; electric stove), vorteks (Fisons; W h i r l i Mixer), spektrofotometer (HeX,ios 8), timbangan analitik ( A N D HF-300), autoklaf ( U L Model 25X-2), soil tester (Model DM-5), sentrifuse (Hitachi CTlSRe), inkubator shaker (Idaihan Labtech), inkubator suhu (Memmert), dryglaski, jarum suntik, soil thermometer (Brannan), kertas saring Whatman no. 42 dan pipet mikro (Gilson).
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: sampel tanah gambut, p-nitrophenyl (Merck), /7-p-nitrophenyl P-D-glucopiranoside (Sigma Aldrich), sigmacell selulosa type 20 p m (Sigma Aldrich), congo red (Merck), agar bacto (Bacteriological Agar), NaOH, NaCl, Na2C03, kalium natrium tartrat, NaHCOj, Na2S04, CUSO45H2O, H2SO4, amonium molibdat, natrium arsenat, K2HPO4, MgS04.
4.4 Metode Pengambilan Sampel Tanah * . j
Pengambilan sampel tanah gambut dilakukan dalam tiga tahap. Tahap pengambilan sampel tanah pertama (penelitian tahun I) dilakukan pada pada lokasi perkebunan akasia umur 4 tahun dan lahan bekas terbakar. Pengambilan sampel tanah gambut tahap kedua (penelitian tahun I) dilakukan pada lokasi hutan gambut alami, perkebunan kelapa sawit, perkebunan karet dan lokasi yang ditanami ubi kayu. Pengambilan sampel tanah dan pengukuran karakter fisika-kimia yang dilakukan dilapangan berlangsung pada saat musim penghujan. Pengambilan sampel tanah tahap ke tiga (penelitian tahun ke 11) dilakukan pada pada lokasi perkebunan akasia umur 1, 3, dan 5 tahun.
Sampel tanah diambil pada lapisan permukaan antara 0-15 cm dengan membersihkan serasah-serasah yang terdapat di permukaan tanah terlebih dahulu. Pengambilan sampel tanah dilakukan secara purposive random sampling dengan 4 kali ulangan untuk setiap lokasi pengambilan sampel tanah gambut, sehingga total diperoleh 36 sampel tanah (9 lokasi x 4 ulangan). Sekitar 250 gr sampel tanah diambil dan dimasukkan ke dalam plastik, serta disimpan pada suhu 4°C setelah proses pengambilan dan selama transportasi sampel ke laboratorium.
4.5 P rosed ur K e r j a
4.5.1 Pembuatan Media i r ,
4.5.1.1 Medium A^«/r/e«f/4^ar
Tepung N A dimasukkan sebanyak 28 gram ke dalam 1000 m l akuades dan dimasak hingga mendidih. Setelah itu, medium disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu I21°C selama 15 menit.
A.S.\.2M<iA\um Potato Dextrosa Kg^r
Sebanyak 200 g kentang dikupas dan dicuci bersih, dipotong kotak dengan ukuran 2x2 cm, direbus dalam 500 ml akuades selama 1 , 5 - 2 jam. Rebusan kentang disaring dengan kain tipis berlapis untuk memperoleh ekstrak kentang yang bening. Dekstrosa 10 g dan agar 15 g ditambahkan ke dalam ekstrak tersebut, dipanaskan sambil diaduk hingga homogen. Akuades ditambahkan hingga volume akhir 1000 m l . pH medium disesuaikan dengan pH lokasi pengambilan sampel tanah, kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada suhu I21°C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.
4 . 5 . 0 M e d i u m 5^arcA Case/n A g a r
Medium Starch Casein Agar terdiri dari: 10 g soluble starch; 0,3 g casein; 2 g KNO3; 2 g NaCl; 2 g K2HPO4; 0,05 g MgS04.7H20; 0,02 g CaCOa; 0,01 g FeS04.7H20; agar 15 gr. Senyawa tersebut dilarutkan dalam 1000 m L akuades lalu dipanaskan hingga homogen. p H medium disesuaikan dengan p H lokasi pengambilan sampel tanah dengan menambahkan larutan asam sitrat 2%. Selanjutnya disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 1 2 r c dan tekanan 15 psi selama 15 menit.
4.5.1.4 Medium Cellulose Congo Red Agar ; . . . . : Medium Cellulose Congo Red Agar merupakan medium yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri selulolitik. Komposisi dan cara pembuatan medium ini terdiri dari (g/L) yaitu 0,05 K2HPO4; 0,25 MgS04; 0,2 congo red; 1,88 selulosa dengan ukuran kristal 20 pm, 20 agar bacto. Semua bahan dilarutkan dengan penambahan air kran/sumur (sebagai elemen minor untuk bakteri tanah) hingga mencapai 1000 ml di atas alat pemanas sampai homogen. Selanjutnya disterilkan menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121 C dan tekanan 15 psi(Hendricke/a/. 1995).
4.5.1.5 M e d i u m Pikovskaya
Medium Pikovskaya agar dibuat dengan mencampurkan 5 gr Ca3(P04)2; 10 gr glukosa; 0,2 gr NaCl;
0,2
gr K C l ; 0,5 gr (NH4)2S04; 0,5 gr yeast ekstrak; 0,1 gr MgS04.7H20;0,002
gr MnS04.H20;0,002
gr FeS04.7H20 dan20
gr agar, lalu dilarutkan dalam 1 liter akuades. pH diatur menjadi 5 (sesuai dengan p H tanah) dengan penambahan beberapa tetes asam sitrat. Medium disterilkan dengan autoklaf pada suhuI 2 r c
tekanan 15 psi selama 15 menit (Goenadiet al. 2000).
4.5.1 Pengukuran K a r a k t e r Fisika-Kimia Tanah Karakter fisika-kimia tanah yang diukur adalah:
4.5.2.1 p H Tanah
pH tanah diukur dengan menggunakan soil tester sebelum pengambilan sampel tanah dilakukan. Soil tester dimasukkan ke dalam tanah pada tiap-tiap lokasi sehingga diperoleh data pH sampel tanah. pH sampel tanah digunakan sebagai dasar untuk menentukan pH medium.
4.5.2.2 Temperatur Tanah
Temperatur tanah pada saat pengambilan sampel diukur menggunakan termometer tanah. Pipa paralon dengan panjang 20 cm dimasukkan ke dalam tanah sampai kedalaman 15 cm. Pipa dicabut hingga terbentuk lubang dan termometer ditancapkan ke dalam lubang tersebut, diamkan beberapa saat dan selanjutnya dicatat temperatur tanahnya.
4.5.2.3 Kelembaban Tanah
Kelembaban tanah diukur menggunakan soil tester sebelum pengambilan sampel tanah dilakukan. Soil tester dimeisukkan ke dalam tanah pada tiap-tiap lokasi sehingga diperoleh data kelembaban sampel tanah.
4.5.2.4 Berat Kering Tanah dan Kandungan A i r
Sampel tanah gambut seberat 5 g ( W l ) dikeringkan menggunakan oven pada suhu I05°C sampai beratnya konstan. Setelah pengeringan, sampel tanah ditimbang (W2). Berat kering sampel tanah/gram (Bk) dihitung dengan rumus:
B k ( % ) = W1-W2 X 100%
.^/''v^vrj^T''
„.,
.,.^.~~5^,^_, " . 'Berdasarkan Bk (%) maka, kandungan air tanah gambut dapat ditentukan dengan menggunakan rumus (Anderson dan Ingram 1992):
^ Kandungan air (%) - ( 1 - B k ) x 100% ^^^^ • 1
4.5.2.5 Berat Volume Tanah
Sampel tanah dimasukkan ke dalam jarum suntik (dipotong bagian dasar yang melekat dengan jarum) hingga mencapai volume 5 ml (V). Tanah dikeluarkan dan diletakkan di aluminium foil yang telah diketahui beratnya lalu ditimbang ( W i ) . Tanah dikeringkan pada suhu I05°C dan ditimbang sampai berat tanah konstan (W2). Berat volume tanah dihitung dengan menggunakan rumus (Anderson dan Ingram 1992):
Berat volume tanah (g/cm^) = ( W i - W2) - Berat aluminum foil V
4.5.2.6 Penentuan Tingkat Dekomposisi Tanah Gambut
Penentuan klasifikasi tanah gambut ditentukan berdasarkan tingkat dekomposisi/ kematangannya. Tingkat dekomposisi/kematangan tanah gambut (fibrik, hemik dan saprik) ditentukan menggunakan data yang didapat dari hasil pengukuran berat volume tanah (Soil Survey Staff 1999 dalam Dengiz et al. 2009) seperti yang tertera pada Lampiran 2.
4.5.3 Penghitungan Total Populasi Mikroba
4.5.3.1 Total Populasi Bakteri
Total populasi bakteri dihitung dengan metode plate count menggunakan agar nutrisi ( N A ) . Sebanyak 1 gr sampel tanah ditimbang kemudian dilarutkan dalam 9 m l larutan NaCl 0,85% steril dan dihomogenkan selama 10 menit. Aliquot larutan tanah sebanyak 100 | i l dengan faktor pengenceran antara 10"^-10'^ diinokulasi ke medium yang telah padat dan diratakan menggunakan dryglaski. Diinkubasi pada suhu kamar selama 5 hari dan dihitung jumlah koloni yang tampak. Dengan menggunakan sampel tanah yang sama, sampel diinokulasi dari pengenceran 10-^-10-^ ke medium N A yang sebelumnya telah diencerkan sepuluh kali (untuk menumbuhkan bakteri oligotrofik). Koloni yang tumbuh dihitung dan diamati setiap hari. Total populasi bakteri diekspresikan sebagai colony forming unit (CFU)/g yang dihitung menggunakan formula sebagai berikut (Enriquez et al. 1995):
Jumlah koloni/cawan petri
Populasi bakteri (CFU/g) = x Faktor pengenceran 1 gram tanah
4.5.3.2 Total Populasi Jamur
Isolasi jamur menggunakan medium PDA (Potato Dextrose Agar). Sebanyak 1 gr sampel tanah ditimbang kemudian dilarutkan dalam 9 m l larutan NaCl 0,85% steril dan dihomogenkan selama 10 menit. Aliquot laratan tanah sebanyak 100 | i l dengan faktor pengenceran antara 10'^-10"^ dituang ke dalam cawan petri yang telah berisi medium PDA dan disebarkan dengan driglaski. Diinkubasi pada suhu kamar selama 3-5 hari dan dihitung koloni tampak (Suciatmih 2005). Total populasi jamur dihitung dengan formula (Enriquez et al. 1995):
jumlah koloni/cawan petri
Populasi jamur (CFU/g) = ; Faktor pengenceran 1 gram tanah
4.5.3.3 Total Populasi Aktinomisetes =»s,rtuat . r. t
Total populasi Aktinomisetes dihitung secara plate count menggunakan medium SCA {Starch Casein Agar) dengan cara 1 gr sampel tanah dimasukkan kedalam tabung yang berisi 9 ml garam fisiologis (0,85%), kemudian dihomogenkan menggunakan vortex. Seratus \i\ aliquot larutan tanah dari faktor pengenceran lO'^-IO"^ diinokulasikan ke medium SCA padat dan diratakan dengan dryglaski. Diinkubasi pada suhu kamar selama 7-14 hari dan dihitung jumlah koloni tampak. Total populasi aktinomisetes dihitung dengan formula (Enriquez et al. 1995):
Populasi aktinomisetes = jumlah koloni/cawan petri ^ Faktor pengenceran (CFU/g) 1 gram tanah
4.5.3.4 Total Populasi Bakteri Selulolitik
Total populasi bakteri selulolitik dihitung pada medium Cellulose Congo Red Agar (Hendricks et al. 1995) dengan p H medium 5. Untuk setiap sampel tanah, 1 gr tanah ditambahkan 9 m l 0,85% larutan NaCl steril dan divortex dengan kecepatan maksimum selama 5 menit. Seratus pi aliquot larutan tanah dengan faktor pengenceran lO'^-lO"^ diinokulasikan ke medium dan diratakan dengan dryglaski. Kultur selanjutnya diinkubasi pada suhu mangan selama 2-28 hari. Koloni tampak yang tumbuh pada medium membentuk zona bening diamati dan dihitung setiap hari (Croft et al. 2001). Total populasi bakteri selulolitik yang terbentuk dihitung dengan menggunakan rumus (Enriquez et al. 1995):
Jumlah koloni/cawan petri
Total populasi bakteri (CFU/g) = x Faktor pengenceran 1 g tanah
4.5.3.5 Total Populasi Bakteri Pclarut Fosfat
Sebanyak 5 gr tanah dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 ml berisi 45 ml larutan fisiologis steril dan dishaker selama 1 j a m dengan kecepatan 120 rpm (sampai sampel homogen). Dibuat seri pengenceran hingga lO"' - 10"^ dari ekstrak tanah dan masing-masing pengenceran diambil 100 pi dengan menggunakan pipet tip steril dan dituang ke cawan petri yang telah berisi medium Pikovskaya. Biakan bakteri diratakan dengan driglaski dan diinkubasi secara terbalik pada suhu ruang selama tiga sampai tujuh hari. Koloni bakteri yang mempunyai zona bening (halozone) disekelilingnya dianggap sebagai bakteri yang mampu melarutkan fosfat. Perhitungan
total bakteri dilakukan pada hari pertama (hari ke-1) sampai hari ke ketujuh (hari ke-7) inkubasi untuk mengetahui total bakteri pelarut fosfat.
4.5.4 Pengukuran Biomasa Mikroba , ,
4.5.4.1 Biomasa Karbon ( C ) Mikroba
Pengukuran biomasa mikroba dengan metode chloroform fumigation extraction ( C F E ) .
Sampel tanah dikeringanginkan terlebih dahulu kemudian sampel disaring menggunakan saringan dengan ukuran pori <2 mm. Subsampel sebanyak 10 gr tersebut difumigasi selama 72 jam dengan menambahkan 30 ml CHCI3 bebas alkohol. Kemudian diekstraksi dengan 50 ml 0,5
M K 2 S O 4 (ECF). Untuk subsampel tanah yang sama, 10 gr tanah diekstraksi dengan 50 m l 0,5 M K 2 S 0 4 ( E C N F ) tetapi tanpa perlakuan fumigasi. Ekstrak tanah disaring dengan kertas Whatman no. 42. Total biomasa C mikroba dalam ekstrak subsampel tanah dihitung dengan metode titrasi (Anderson dan Ingram 1992). Ekstrak subsampel tanah ditambahkan 3-4 tetes larutan indikator (phenanthroline monohydrate) sambil diaduk, dilanjutkan titrasi dengan penambahan larutan ferrous ammonium sulphate hexahydrate dan dihentikan ketika wama larutan berubah dari hijau/ungu menjadi merah. Total biomasa C mikroba ( B C M ) dihitung dengan formula (Voroney etal.2006):
B C M = (ECF-ECNF)/0,35
dimana.
EC(Fj^F) = C org(F.NF) X (VTES/BST)
Keterangan: VTES BsT 0,35 C Org(F,NF) B C M E C F E C N F
Biomasa C mikroba (pg C/g tanah) Ekstrak C dalam sampel fumigasi
Ekstrak C dalam sampel nonfumigasi (kontrol)
Konsentrasi C organik pada sampel fumigasi, non fumigasi Volume total ekstrak sampel (ml)
Berat sampel tanah (gram)
4.5.4.2 Biomasa Fosfat (P) Mikroba Hm:mc^l)i<muii^^,:: m< - K.^
Biomasa mikroba diukur menggunakan metode chloroform fumigation extraction (CFE). Sampel tanah dikeringanginkan hingga mencapai 40% kapasitas lapang dan seterusnya disaring menggunakan saringan dengan ukuran pori < 2 mm. Tiga gram subsampel tanah yang telah dikeringanginkan difumigasi selama 24 j a m dengan 30 ml CHCI3 bebas alkohol, diekstraksi dengan 60 ml 0,5M NaHCOs (ECs) dan dishaker selama 30 menit. Hal yang sama dilakukan untuk subsampel tanah yang sama, tetapi tanpa perlakuan fumigasi (EC^). Ekstrak tanah disaring dengan kertas Whatman no. 42 (Hargreaves et al. 2003). Satu ml larutan hasil ekstraksi dicampur dengan 4,0 ml larutan asam askorbat 1% dan 3,0 ml reagen molibdat. Larutan dihomogenkan dan ditunggu selama 1 jam supaya warna terlihat jelas, kemudian dibaca absorbansi sampel menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 880 nm (Anderson dan Ingram 1992). Total biomasa P mikroba (BPM) dihitung dengan formula (Voroney et al. 2006);
BMP (pg P/g tanah) = (Pp - Pup/^fp) x 100/R dimana:
PF, PUF (pg/tanah) = P, (pg/ml) x [VS (ml)/MS (g)] - ^ '^^ ^ "
' VS (ml) = [(BB tanah (g) - B K tanah ( g ) / l g ml"')] + volume ekstraktan (ml)
Keterangan: - , - v VS = Total volume larutan ekstrak tanah
^ MS = Berat kering tanah PF ^ Sampel tanah fumigasi PUF = Sampel tanah unfumigasi
^EP = Efisiensi ekstraksi dari biomasa P mikroba (0,40) R = 1 0 0
Pembuatan standar larutan dilakukan dengan cara sebagai berikut: 7 gram KH2PO4 dikeringkan dalam oven pada suhu lOS^C selama 2 j a m . KH2PO4 yang telah kering sebanyak 4,394 g dilarutkan dalam akuades hingga volumenya mencapai 1000 m l . Larutan KH2PO4 tersebut merupakan stok larutan P dalam 1000 pg/ml. Diambil sebanyak 10 m l stok larutan P
1000 pg/ml dan masukan akuades hingga mencapai 500 m l (merupakan stok larutan P 20 pg/ml), kemudian dari stok larutan P 20 pg/ml ambil sebanyak 0, 5, 10, 1, 20, dan 25 ml dan tambahkan volumenya hingga mencapai 100 m l . Stok larutan standar P tersedia adalah dengan konsentrasi 0, 1, 2, 3, 4, dan 5 pg/ml. Sebanyak 1 ml stok larutan standar dari kisaran konsentrasi linear
dicampur dengan 4 ml larutan asam askorbat dan 3,0 ml reagen molibdat. Larutan dihomogenkan dan ditunggu selama 1 j a m supaya wama terlihat jelas, kemudian baca absorbansi sampel menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 880 nm (Anderson dan Ingram
1992). -:r^- r.r::-. ih..r.,:
4.5.5 Respirasi Tanah
Respirasi tanah diukur berdasarkan produksi CO2 oleh biota tanah. Kecepatan respirasi tanah diukur in situ dengan cara sebagai berikut: wadah silinder ( W l ) berkapasitas 50 ml volume diisi dengan 20 m l larutan 1 M K O H dan diletakkan di atas tanah pada lokasi yang telah ditentukan. Wadah W l selanjutnya dilingkupi dengan wadah silinder dengan kapasitas volume 500 ml (W2) yang diletakkan terbalik hingga menancap ke dalam tanah. Gas CO2 yang dilepaskan oleh biota tanah akan terperangkap dalam wadah W2 dan berikatan dengan lamtan K O H dalam wadah W l . Pada lokasi yang sama, wadah W l diisi dengan 20 ml larutan 1 M K O H yang ditutup rapat dan diletakkan di atas tanah (kontrol). Wadah W l dilingkupi dengan wadah W2 yang diletakkan terbalik. Setelah inkubasi selama 24 jam, wadah W l ditutup rapat dan dibawa ke laboratorium untuk analisis titrasi. Sebelum titrasi dilakukan, wadah W I terlebih dahulu ditambahkan beberapa tetes phenolphthalein. Titrasi dimulai dengan penambahan larutan
1 M H C l ke dalam wadah W l dan dihentikan ketika larutan K O H berubah wama dari merah muda menjadi bening. Kecepatan respirasi tanah (mg C02/m^/jam) dihitung berdasarkan konsentrasi CO2 yang terukur dengan memperhitungkan luas area pengukuran (diameter wadah W2) dan waktu inkubasi. Laju respirasi tanah dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
Laju respirasi tanah (mg C02/mVjam) = (22(ml HClK-ml HCls)}/m^/jam Keterangan:
ml H C 1 K = m l I I C l yang terpakai pada kontrol ml H C I s = ml HCI yang terpakai pada sampel 4.5.6 Pengukuran Aktivitas Eksoenzim Tanah
4.5.6.1 Dehidrogenase
Aktivitas enzim dehidrogenase diukur secara kolorimetri. Sampel tanah sebanyak 1 gr dicampur dengan 10 ml substrat analog {triphenyltetrazolium chloride) dan reaksi enzimatik
gelap. Dua paralel sampel sebagai kontrol diinkubasi bersamaan yaitu: (1) sebanyak 1 gr sampel lanah ditambah 10 ml bufer tris sebagai pengganti substrat analog, dan (2) sebanyak 1 ml substrat analog ditambah dengan 10 m l bufer tris. Setelah masa inkubasi, reaksi enzimatik dihentikan dengan penambahan 10 m l metanol ke dalam setiap sampel. Larutan sampel disentrifiise pada
lO.OOOxg selama 10 menit dan ± 1,5 m l supernatan larutan dimasukkan ke tabung reaksi untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 485 nm. Sebanyak lima larutan kalibrasi {triphenylformazan) dengan konsentrasi berbeda yaitu 0 pg/ml, 4,25 pg/ml, 8,5 pg/ml, 17 pg/ml dan 34 pg/ml diukur absorbansinya pada panjang gelombang 485 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh digunakan untuk pembuatan kurva standar (Lampiran 3). Aktivitas dehidrogenase yang diekspresikan sebagai pg formazan/g berat kering tanah/jam ditentukan dengan rumus {Department of Environmental Chemistiy 2009):
(pcs-pbs)xVx 100 m X bk x t Keterangan:
a = aktivitas dehidrogenase ( p g formazan/g berat kering tanah/jam) Pcs= rata-rata konsentrasi TPF pada sampel (pg/ml)
Pbs= rata-rata konsentrasi TPF pada kontrol (pg/ml) < .> V = volume larutan (volume larutan substrat+volume ekstraktan)
' m = berat awal tanah (g) ' ' , , bk = berat kering tanah (%) . ^ r< r. ;
t = waktu inkubasi {^am) 4.5.6.2 Selulase
Satu gram sampel tanah ditambahkan 10 m l substrat analog (Sigmacell selulosa 20 pm 2%). Larutan diinkubasi dalam shaker inkubator dengan kecepatan 180 rpm selama 24 jam pada suhu 28°C dalam keadaan gelap. Setelah masa inkubasi ditambahkan 25 m l akuades, kemudian suspensi disaring menggunakan kertas Whatman No 42. Dua paralel sampel sebagai kontrol diinkubasi bersamaan yaitu: (1) 1 gr sampel tanah yang ditambahkan 10 ml bufer asetat 0,05M pH 5 sebagai pengganti substrat analog, dan (2) 6 m l bufer asetat 0,05M p H 5 ditambahkan 5 ml substrat analog. Aktivitas enzim diukur berdasarkan jumlah gula reduksi yang terbentuk dengan metode Nelson-Somogyi (Alexander dan Griffiths 1993), dimana 5 m l subsampel reaksi hasil penyaringan ditambahkan 1 ml reagen Nelson (4 Nelson A : 1 Nelson B ) dan dipanaskan di atas penangas air selama 10 menit. Setelah larutan dingin, ditambahkan 1 m l reagen arsenomolibdat, divorteks dan didiamkan selama 5 menit. Larutan diencerkan dengan akuades sehingga volume
larutan mencapai 10 m l , divorteks, dan dibaca dengan menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang 540 nm. N i l a i absorbansi yang diperoleh diplotkan pada kurva standar (Lampiran 3) untuk mengetahui konsentrasi glukosa (gula reduksi) pada sampel. Aktivitas enzim didefinisikan sebagai pg/jam/g tanah dan dihitung menggunakan rumus:
G R
Aktivitas enzim (pg/jam/g tanah) = ~ — ~ — — x FP B k X T X V
Keterangan: GR = Jumlah glukosa yang dibebaskan (pg/ml) FP = Faktor pengenceran
Bk = Berat kering tanah (g) • ' ;-rw T = Waktu inkubasi O^m)
V = Volume (ml) 4.5.6.3 Selobiohidrolase
Aktivitas selobiohidrolase ditentukan dengan mengadopsi metode Sinsabaugh (2002). Sebanyak 0,5 gr sampel tanah dilarutkan dalam bufer asetat 0,05 M (pH larutan disesuaikan dengan pH sampel tanah) hingga volume 2 ml ( V i ) dan diaduk dengan menggunakan bar magnetik selama 1 menit. Reaksi enzimatik diawali dengan penambahan 2 m l (V2) substrat analog 2 m M (p-nitrophenol-cellobioside). Larutan diinkubasi dalam shaker inkubator pada kecepatan 150 rpm selama 4 j a m pada suhu 30°C. Larutan kontrol juga diinkubasi secara bersamaan yaitu (1) 0,5 gr tanah ditambahkan 4 ml bufer asetat sebagai kontrol sampel, dan (2) 2,5 m l bufer asetat ditambahkan 2 ml substrat analog 2 m M (p-nitrophenol-cellobioside) sebagai kontrol substrat. Setelah inkubasi larutan disentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit dan 1 ml supernatan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 1 ml I N NaOH untuk menghentikan reaksi enzimatik dan yang menyebabkan terjadinya perubahan wama lamtan. Dicukupkan volume larutan hingga mencapai 3 ml dengan menambahkan akuadest dan di vorteks. Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm. Aktivitas enzim diekspresikan sebagai pmol PNP yg dibebaskan/jam/g berat kering sampel tanah dan dihitung menggunakan mmus:
P
Aktivitas Enzim (pmol PNP/g tanah/jam) = - — - x (V) (T) (BR) (FP) [ E C ]
Keterangan: P = Jumlah PNP j'ang dibebaskan (pmol/ml) EC = Koefesien PNP [3,4 pmol/ml]
V = V , + V 2 ( m l ) FP = Faktor pengenceran T = Waktu inkubasi (jam) Bk = Berat kering tanah (g)
Kurva standar dibuat dengan pengenceran larutan p-Nitrophenol. P-Nitrophenol diencerkan dengan konsentrasi bertingkat 5 pmol, 10 pmol, 15 pmol, 20 pmol, 25 pmol,berturu-turut sebagai standar I , standar I I , standar I I I , standar I V dan standar V . Larutan standar (p-Nitrophenol) 1 ml ditambahkan 1 m l NaOH 1.0 N dan kemudian 3 m l akuadest, kemudian dibaca nilai absorbansinya.
4.5.6.4 P-glukosidase
Satu gram sampel tanah dilarutkan dalam bufer asetat 0,05M p H 5 hingga volume 5 ml dan divorteks. Reaksi enzimatik diawali dengan penambahan 5 ml substrat analog 10 m M (p-nitrophenol-P-D-glucopiranoside). Larutan diinkubasi menggunakan shaker inkubator dalam keadaan gelap dengan kecepatan 180 rpm selama 4 jam pada suhu 28°C. Larutan kontrol juga diinkubasi secara bersamaan yaitu: (1) I gr tanah ditambahkan 10 ml bufer asetat sebagai kontrol sampel, dan (2) 6 ml bufer asetat ditambahkan 5 ml substrat analog 10 m M (p-nitrophenol-P-D-glucopiranoside) sebagai kontrol substrat. Selanjutnya larutan disentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit dan 1 m l supernatan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 1 ml NaOH
I N untuk menghentikan reaksi enzimatik dan yang menyebabkan terjadinya perubahan wama lamtan. Dicukupkan volume larutan hingga mencapai 3 ml dengan menambahkan akuades dan divorteks. Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm. Konsentrasi p-nitrophenol yang dibebaskan dihitung dengan cara menentukan nilai absorbansi yang diporoleh (Sinsabaugh 1994). Nilai absorbansi yang diperoleh diplotkan pada kurva standar (Lampiran 4) untuk mengetahui konsentrasi /7-nitrophenol (PNP) pada sampel. Aktivitas enzim diekspresikan sebagai pmol PNP/g tanah/jam dan dihitung menggunakan rumus:
P
Keterangan: P = Jumlah PNP yang dibebaskan (|imol/ml) EC = Koefesien PNP [3,4 nmol/ml]
V = Tanah + bufer asetat + substrat analog (ml) FP = Faktor pengenceran
T = Waktu inkubasi (jam) j Bk = Berat kering tanah (g)
4.5.6.5 Fosfatase Asam
Satu gram sampel tanah dicampurkan dengan 5 ml bufer asetat 0,05M pH 5 (disesuaikan dengan pH sampel tanah) ( V i ) . Reaksi enzimatik diawali dengan penambahan 5 ml 77-nitrophenol phosphate ke dalam vial (V2) dan divorteks selama 1 menit. Larutan dishaker selama 1,5 jam pada suhu 28°C dengan kecepatan 150 rpm. Larutan kontrol juga diinkubasi secara bersamaan yaitu (1) larutan tanah sebanyak 1 ml ditambahkan 10 ml bufer asetat sebagai kontrol sampel, dan (2) bufer asetat sebanyak 6 ml ditambahkan 5 ml /j-nitrophenol phosphate sebagai kontrol substrat. Setelah inkubasi, larutan disentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit dan 1 ml supernatan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 1 m l I N NaOH untuk masing-masing tabung agar reaksi enzimatik terhenti dan yang menyebabkan terjadinya perubahan wama larutan menjadi kuning. Dicukupkan volume larutan hingga 3 ml dengan menambahkan akuades dan divorteks. Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm (Sinsabaugh et al. 2003). Aktivitas enzimatik diekspresikan sebagai pmol p-nitrophenol yang dibebaskan/gram berat/jan kering sampel tanah. Aktivitas enzim dihitung menggunakan mmus:
P
Aktivitas Enzim (pmol PNP/g tanah/jam) = - — - x ( V ) (T) ( B K ) (FP)
L E C ]
Keterangan: P = Jumlah PNP yang dibebaskan (pmol/ml) EC = Koefesien PNP [3,4 pmol/ml]
V = V i + V2 (ml) FP = Faktor pengenceran T = Waktu inkubasi Qam) Bk = Berat kering tanah (g)
Kurva standar dibuat dengan pengenceran larutan p-nitrophenol. P-nitrophenol diencerkan dengan konsentrasi bertingkat 5 pmol, 10 pmol, 15 pmol, 20 pmol, 25 pmol,berturut-turut sebagai standar 1, standar 11, standar I I I , standar I V dan standar V . Larutan standar (p-nitrophenol) 1 ml ditambahkan 1 ml NaOH 1.0 N dan kemudian 3 ml akuades, kemudian dibaca nilai absorbansinya.
4.5.7 Analisis Keanekaragaman Bakteri
4.5.7.1 Purifikasi dan Karakterisasi Parsial Isolat
Isolat yang diperoleh dari perhitungan total populasi bakteri (lihat seksi 3.5.3.1) dipurifikasi dan dikarakterisasi. Isolat dianggap murni secara morfologi apabila karakter koloni, bentuk sel dan pergerakan sel sudah seragam. Isolat yang sudah mumi dikarakterisasi secara parsial meliputi: pengamatan morfologi koloni dan sel, reaksi pewamaan gram, dan uji biokimia.
4.5.7.2 Indeks Keanekaragaman Bakteri
Keanekaragaman bakteri dihitung berdasarkan data karakter morfologi, pewamaan gram, dan uji biokimia menggunakan indeks keanekaragaman Shannon-Weaver (Shannon and Weaver 1963) dengan formula H' = -Zp^lnp., dimana/?, adalah proposional jumlah isolat terhadap total isolat. Evenness dihitung menggunakan formula E =
/////max-4.5.8 Analisis Data
Data yang diperoleh diuji menggunakan One-Way A N O V A dan dilanjutkan dengan uji LSD {Least Significant Difference) pada taraf nyata 5% menggunakan SPSS versi 12 j i k a terdapat perbedaan yang signifikan. Selain itu juga dilakukan analisis secara deskriptif dalam bentuk tabel dan grafik.
