3 METODE PENELITIAN. Komposisi (g/l) 1.5 0,

(1)

3 METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Tanah

Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan Fakultas Pertanian IPB dan

Indonesian Center for Biotechnology and Biodiversity (ICBB) Cilubang Nagrak

Situgede Kabupaten Bogor. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Desember

2008 sampai dengan Juli 2009.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan adalah sampel ganggang mikro air tawar dan

tanah yang berasal dari berbagai lokasi dan ekosistem di Jawa Barat dan Jawa

Tengah serta beberapa jenis bahan kimia. Media yang digunakan sebagai media

tumbuh ganggang mikro adalah media M4 (media NORO) dan media MJ (media

Jorgensen) sebagai media standar (Takagi et al., 2005). Media ini akan

digunakan pada tahapan isolasi dan kultivasi ganggang mikro. Komposisi media

standar disajikan pada Tabel 4.

Tabel 4 Komposisi media standar

Media

M4

Komposisi

(g/L)

Media MJ

Komposisi

(g/L)

NaNO3 K2HPO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O Ctric Acid Fe-ammonium citrate EDTA Na2CO3 Trace Metal.

Komposisi Trace Metal H3BO3 MnCl2.4H2O Zn.SO4.7H2O Na2Mo.O4.2H2O CuSO4.5H2O CO(NO3)2.6H2O 1.5 0,04 0.075 0.036 0.06 0.06 0.001 0.02 0.01 2.86 1.81 0.222 0.39 0.079 0.049 NaNO3 K2HPO4 Vit B 12 Na2SiO3.5H2O EDTA Trace Metal I Trace Metal II

Komposisi Trace Metal I NaCl

KNO3

NaH2PO4.2H2O

NaHCO3

Komposisi Trace Metal II Na2EDTA.2H2O FeCl3.6H2O CuSO4.7H2O ZnSO4.7H2O CoCl2.6H2O MnCl2.4H2O Na2MoO4 1.5 0.04 0.001 0.454 0.05 0.001 0.01 0.58 1 0.166 0.5 4.1 0.932 10.5 20.2 3.4 0.73 0.20 Keterangan : Media M4 modifikasi media NORO

(2)

Alat yang digunakan adalah erlenmeyer, autoklaf, shaker, laminar flow,

sentrifuse, spektrofotometer (spektronik 20) dan mikroskop flouresence.

3.3 Pelaksanaan Penelitian

Pelaksanaan penelitian ini disajikan pada bagan alir Gambar 2.

Keterangan: - - - adalah objek kajian

Gambar 2 Bagan alir penelitian

Produksi total lipid

Isolasi dan seleksi

ganggang mikro

28 Isolat

Pengambilan sampel

ganggang mikro di

Jawa Barat dan Jawa Tengah

Potensi ganggang mikro

Identifikasi

ganggang mikro

Bahan Bakar Nabati (BBN)

Optimasi pertumbuhan

ganggang mikro

Analisis pengaruh

salinitas dan pH

Analisis kadar

gula total

Kultivasi

Ganggang Mikro

4 Isolat

Optimasi nitrogen

dan fosfor

(3)

3.3.1 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan pada berbagai lokasi dan ekosistem di

Jawa Barat dan Jawa Tengah. Lokasi mewakili ekosistem dengan keragaman

yang tinggi yaitu ekosistem Kawah Vulkan (Bledug Kuwu), bendungan besar

yaitu waduk Sempor, Kebumen Jawa Tengah, kolam dan sawah yang

diperkirakan merupakan habitat hidup ganggang mikro. Deskripsi lokasi

pengambilan sampel ganggang mikro disajikan pada Lampiran 1.

3.3.2 Tahapan Isolasi dan Seleksi Ganggang Mikro

Tahapan isolasi dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan sampel

ganggang mikro yang akan digunakan pada tahapan kultivasi. Tahapan isolasi

dilakukan dengan pemurnian biakan pada pengenceran bertingkat. Dari tahapan

isolasi kemudian ganggang mikro diseleksi untuk selanjutnya akan dikultivasi

pada berbagai volume media biakan.

Tahapan isolasi diawali dengan pemurnian sampel ganggang mikro pada

pengenceran bertingkat kemudian seluruh sampel ganggang mikro diisolasi

sebanyak 0,25 ml ke dalam erlenmeyer berisi 5 ml volume media M4 dan Mj.

Isolat diinkubasi pada 27 ± 2

0

C dibawah cahaya dengan intensitas 1.2 ± 0.5 klux

dengan 12:12 jam fotoperiode. Setelah tahapan isolasi dilakukan tahapan seleksi

ganggang mikro berdasarkan kecepatan tumbuh, kondisi pertumbuhan, dan

keanekaragaman pigmennya. Isolat ganggang mikro yang terseleksi disimpan

pada agar miring sebagai stok serta pada gliserol 20%, dan diletakkan didalam

freezer.

3.3.3 Tahapan Kultivasi

Tahapan kultivasi dilakukan agar ganggang mikro yang telah terseleksi

diperoleh dalam jumlah atau masa sel yang cukup untuk digunakan pada

tahapan optimasi. Tahapan kultivasi dilakukan dengan menumbuhkan

masing-masing isolat ganggang mikro terseleksi pada erlenmeyer kedalam media

dengan volume yaitu 25 ml, 50 ml 150 ml, dan 250 ml. Kultur tunggal dipastikan

dengan peremajaan berulang dan pengamatan di bawah mikroskop.

Pertumbuhan awal diamati selama selang waktu 7-10 hari setelah ditumbuhkan.

Setelah stok kultur pada volume media 250 ml mencapai optical density (OD)

0.2 atau lebih maka biakan ganggang mikro siap untuk digunakan pada tahapan

optimasi.

(4)

3.3.4 Tahapan Optimasi Pertumbuhan ganggang mikro

Tahapan optimasi pertumbuhan dilakukan dengan menguji pertumbuhan

ganggang mikro berdasarkan optimasi nitrogen dan fosfor terhadap produksi total

lipid, salinitas dan pH terhadap media biakan dan kadar gula total ganggang

mikro dalam larutan media biakan

3.3.4.1 Optimasi Nitrogen dan Fosfor

Optimasi nitrogen dan fosfor dilakukan untuk mengetahui produksi

biomasa, dan produksi total lipid ganggang mikro setelah 30 hari masa inkubasi.

Sedangkan laju pertumbuhan ganggang mikro diukur selama masa inkubasi.

Proses optimasi diawali dengan menumbuhkan kultur biakan ganggang

sebanyak 10 ml kedalam media dengan volume 500 ml dengan dua sumber

nitrogen dan fosfor pada berbagai konsentrasi. Biakan diinkubasi pada 27 ± 2

0

C

dibawah cahaya dengan intensitas 1.2 ± 0.5 klux dengan 12:12 jam fotoperiode.

Pada beberapa spesies ganggang mikro, laju pertumbuhan diatur dengan

memodifikasikan nitrogen dan fosfor (Lambardi dan Wangersky, 1991). KNO

3

dan Urea (CO (NH

2

)

2

) merupakan hara yang digunakan sebagai sumber

nitrogen. Sebagaimana yang dideskripsikan oleh Change dan Page (1995), laju

pertumbuhan ganggang tertinggi dengan NO

3

-, sedang dengan NH

4 +

dan yang

paling rendah dengan Urea. Sumber fosfor ditambahkan dengan menggunakan

KH

2

PO

4

dan TSP (Ca(H

2

PO

4

)

2

). Komposisi sumber nitrogen dan fosfor pada

berbagai konsentrasi disajikan pada Lampiran 2. Sumber dan konsentrasi

nitrogen dan fosfor disajikan pada Tabel 5.

Tabel 5 Sumber dan konsentrasi nitrogen dan fosfor

Konsentrasi

Sumber

Nitrogen Fosfor

KNO3 dan Urea (CO (NH2)2) KH2PO4 dan TSP (Ca(H2PO4)2)

Standar 20 mM 0.2 mM N1 10 mM 0.2 mM N2 30 mM 0.2 mM N3 40 mM 0.2 mM P1 0.1 mM 20 mM P2 0.5 mM 20 mM P3 1.0 mM 20 mM

(5)

3.3.4.2 Produksi Total Lipid

Setelah 30 hari masa inkubasi, biakan ganggang mikro kemudian diukur

produksi biomasa dan produksi total lipidnya dengan ketetapan biakan ganggang

mikro telah mencapai kerapatan sel (OD) 0.2 atau lebih pada akhir masa

inkubasi. OD diukur pada panjang gelombang (

λ

) 680 nm dengan

spektofotometer (Lee et al., 1998).

Pengukuran produksi total lipid dilakukan dengan proses ekstraksi.

Proses ekstraksi lipid ganggang mikro dilakukan dengan metode chemical

solvent oil extraction (Bligh dan Dyer, 1959),

yaitu dengan menggunakan

bahan kimia sebagai pelarut. Pelarut kimia yang digunakan adalah metanol dan

chloroform dengan tahapan : tabung ditimbang dan dicatat berat tabung reaksi

kosong; dimasukkan perlakuan ganggang, disentrifuse 3500 rpm selama 10

menit; dibuang supernatan lalu disimpan dalam oven selama 1 malam hingga

kering (80

0

C); biomasa ganggang mikro yang telah kering ditambahkan dengan 4

ml aquadest bebas ion; ditambahkan metanol 10 ml dan chloroform sebanyak 5

ml; dishaker kembali selama 1 malam; kemudian ditambahkan kembali aquadest

bebas ion 5ml + 5 ml chloroform; sentrifuse 3500 rpm selama 10 menit; diambil

endapan lipid yang mengendap selanjutnya diletakkan di dalam tabung reaksi

dan dipanaskan untuk menghilangkan campuran larutan kimia yang ditambahkan

sebelumnya.

Perhitungan % total lipid ganggang mikro adalah:

Keterangan: Lw

= Berat Lipid (g)

Bw

= Berat biomasa (g)

3.3.4.3 Analisis Pengaruh Salinitas dan pH

Analisis pengaruh salinitas dan pH dilakukan untuk mengetahui kondisi

media biakan yang sesuai terhadap salinitas dan pH bagi pertumbuhan sel

ganggang mikro melalui pengukuran rapat optis (OD) yang diukur setelah 30

hari masa inkubasi. Masing-masing perlakuan di ulang 3x. Kombinasi perlakuan

faktorial 3 x 3 dari 3 taraf salinitas dan 3 taraf pH disajikan pada Tabel 6.

Lw

% Total lipid =

X 100

Bw

(6)

Tabel 6 Kombinasi perlakuan faktorial 3 x 3 dari tiga taraf salinitas dan tiga taraf

pH

Salinitas (mol/L) Nacl pH 5.0 (B1) 7.0 (B2) 9.0 (B3)

0.2 (A1) A1B1 A1B2 A1B3

0.4 (A2) A2B1 A2B2 A2B3

0.6 (A3) A3B1 A3B2 A3B3

Steel dan Torrie (1981), memberikan model matematis untuk rancangan

acak lengkap faktorial sebagai berikut:

Y

ij

= μ + α

i

+ β

j

+ (αβ)

ij

+ ε

ij

dimana:

Y

ij

= Respon

μ

= Nilai Tengah Populasi

α

i

= Pengaruh dari faktor 1 (salinitas)

β

j

= Pengaruh dari faktor 2 (pH)

(αβ)

ij

= Pengaruh interaksi faktor Salinitas dan pH

ε

ij

= Pengaruh galat percobaan

Instrumen statistik yang digunakan adalah SAS 9.1.

3.3.4.4 Analisis Kadar Gula Total

Ganggang adalah organisme yang dapat berfotosintesis. Gula merupakan

senyawa organik kompleks pertama yang dibentuk tumbuhan sebagai hasil

fotosintesis (Suradikusumah, 1989). Pengukuran kadar gula total dalam larutan

media biakan pada ganggang mikro dilakukan dengan menggunakan Spektronik

20. Metode yang digunakan untuk menetapkan kadar gula total ganggang mikro

dalam larutan media biakan adalah metode fenol sulfat (Halme et al., 1993).

Prinsip metode ini adalah sampel yang mengandung gula (gula sederhana dan

turunannya) bereaksi dengan fenol dan H

2

SO

4

akan menghasilkan warna orange

- kekuningan yang stabil.

Tahapan Pembuatan kurva standar

Larutan standar glukosa dibuat dalam satuan Bagian Per Juta (bpj) yaitu:

10 bpj, 20 bpj, 40 bpj, 60 bpj, 80 bpj, 100 bpj. Masing-masing larutan standar

glukosa dicampur dengan 0.5 ml fenol 5% dan 2.5 ml H

2

SO

4

5N dalam tabung

reaksi, dikocok homogen, didiamkan selama 10 menit. Serapan masing-masing

konsentrasi larutan baku glukosa diukur dengan spektrofotometer pada panjang

(7)

gelombang (

λ

) 490nm. Larutan blanko adalah 0.5 ml aquadest dicampur dengan

0.5 ml fenol 5% dan 2.5 ml H

2

SO

4

5N.

Penetapan kadar gula ganggang mikro

Untuk penetapan kadar gula total dalam larutan media biakan, larutan

isolat ganggang mikro harus berupa cairan yang jernih, jika ada endapan maka

perlu dilakukan penyaringan untuk menghilangkan endapan. Larutan isolat

ganggang mikro tanpa endapan diambil 1 ml, dicampur dengan 0.5 ml fenol 5%

dan 2.5 ml H

2

SO

4

5N dalam tabung reaksi, dikocok homogen, dan didamkan 10

menit. Serapan masing-masing kandungan gula pada ganggang mikro diukur

dengan spektrofotometer pada

λ

490nm. Berdasarkan pembacaan kurva standar

glukosa pada

λ

490 nm, diperoleh formula persamaan garis regresi linier yang

merupakan hubungan antara konsentrasi larutan standar dengan absorbans

dimana y = absorban dan x = konsentrasi.

3.3.5 Identifikasi Ganggang Mikro

Identifikasi dilakukan untuk mengetahui galur ganggang mikro spesifik

yang digunakan selama proses penelitian. Identifikasi ganggang mikro yang

utama didasarkan pada karakteristik morfologi umum serta sifat-sifat selular

seperti: sifat pigmen fotosintetik; struktur sel dan flagela yang dibentuk oleh

sel-sel yang bergerak, serta lipid sebagai bahan cadangan organik yang dihasilkan