LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PEWARNAAN TAHAN ASAM
Kamis, 12 Maret 2015 Kelompok I
Kamis, Pukul 10.00–13.00 WIB
Nama NPM
Oryza Sativa Sinuhaji 260110130006
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015
PEWARNAAN TAHAN ASAM
I. TUJUAN
Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam pewarnaan (Ziehl-Neelsen). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.
II. PRINSIP
2.1 Penetrasi Zat Warna
Jika sitoplasma terwarnai, maka sel- sel bakteri akan menahan zat warna tersebut dan tidak terpucatkan sekalipun oleh zat bersifat keras, seperti asam alkohol. Asam alkohol merupakan pcmucat yang sangat intensif. Pada pewarnaan ini, mikroorganisme yang dapat menahan zat warna utama dikatakan tahan asam dan berwarna merah. Sedang pada bakteri biasa senyawa karbol fuksin mudah dipucatkan oleh alkohol asam dan menyerap biru metilen sehingga sel berwarna biru.
2.2 Pewarnaan Tahan Asam
Prosedur ini menggunakan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan biru metilen sebagai pewarna tandingan. Pada modifikasi lain teknik ini perlakuan panas diganti dengan penggunaan pembasah (suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak) untuk menjamin penetrasi pewarna.
2.3 Pemanasan
2.4 Impermeabilitas Bakteri Tahan Asam
Konsentrasi lemak yang tinggi menyebabkan bakteri tahan asam mempunyai sifat- sifat khusus, yaitu hidrofobik, tahan asam, impermeabel bila diwarnai. Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus zat pewarna.
III. TEORI DASAR
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untukmengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifatfisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Anjani, 2014).
Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri- ciri yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan (Jawetz, 1986).
Kromotor bermuatan positif, zat warna asam yang berperan memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena memiliki muatan positif antara lain Eosin, Congo Red dll. Contoh warna asam yaitu Crystal violet, methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite green, dll (Hermawan, 2015).
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Brookks, 2005).
Pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-Neelsen dapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :
1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl- Neelsen disebut bakteri tahan asam (acid fast).
2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl- Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non acid fast).
IV. ALAT DAN BAHAN 4.1 Alat
4.1.1 Bak pewarna 4.1.2 Botol semprot 4.1.3 Kaca objek 4.1.4 Kapas 4.1.5 Kertas saring 4.1.6 Korek api 4.1.7 Mikroskop 4.1.8 Ose
4.1.9 Pembakar spirtus 4.1.10 Penangas air 4.1.11 Tabung reaksi
4.2 Bahan
4.2.1 Alkohol 70% 4.2.2 Aquades
4.2.3 Asam alkohol (3% HCl dalam alkohol 95%) 4.2.4 Suspensi bakterisaprofit
4.2.5 Zat warna biru metilen 4.2.6 Zat warna karbol fuchsin
4.3 Gambar alat
Kertas saring Korek Mikroskop Ose
Pembakar Spirtus Penangas air Tabung Reaksi
V. PROSEDUR KERJA
genangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 2 menit, kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringkan menggunakan kertas saring. Kemudian ditetesi minyak imersi dan dilihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10.
VI. DATA PENGAMATAN
Perlakuan Pengamatan
Kaca objek dibersihkan dengan menggunakan alkohol sampai berdecit
Kaca objek bebas lemak
Ose difiksasi menggunakan pembakar spirtus dan didinginkan dekat api
Fiksasi mulut tabung reaksi dan sumbat kapasnya kemudian ditutup
Tabung reaksi tetap steril
Suspensi dioleskan pada kaca objek dan digenangi dengan zat pewarna karbol fuchsin diatas penangas air
Suspensi bakteri yang digenangi zat pewarna menempel pada kaca objek
Kaca objek diberi lingkaran pada salah satu sisi lain menggunakan spidol
Terdapat daerah pengamatan berbentuk lingkaran
Kaca objek dibilas dengan aquades kemudian dibilas dengan alkohol asam
Belakang olesan berwarna merah muda pucat
Genangi olesan dengan zat pewarna biru metilen selama 2 menit, dibilas dengan aquades
Kaca objek dikeringkan dan diberi minyak imersi, diamati dibawah mikroskop perbesaran 10 x 10
Bakteri terlihat menumpuk berwarna ungu
VII. PEMBAHASAN
Praktikum Mikrobiologi Farmasi kali ini berjudul Pewarnaan Tahan Asam dengan tujuan untuk mengamati bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam (pewarnaan Ziehl-Neelsen) serta memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang
pada praktikum tidak menginfeksi. Selain itu juga digunakan aquades untuk membilas zat pewarna, dan minyak imersi untuk memperbesar penampakan bakteri saat diamati menggunakan mikroskop. Alat- alat yang digunakan antara lain, bak pewarna untuk menampung air bilasan zat pewarna, botol semprot yang akan mengalirkan aquades, kaca objek untuk meletakkan sampel diatas daerah pengamatan, kapas bebas lemak untuk membersihkan kaca objek, kertas saring untuk mengeringkan kaca objek setelah pembilasan, korek api untuk menyalakan pembakar spirtus, mikroskop untuk mengamati sampel pada kaca objek, ose yang difiksasi untuk mengambil sampel, tabung reaksi yang disumbat dengan kapas dan kasa berisi suspensi bakteri,waterbathuntuk memanaskan sampel, dan pembakar spirtus sebagai media pensterilisasi alat.
terdapat beberapa perlakuan dan zat kimia yang diberikan. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri tetapi tidak mengubah struktur sel bakteri. Kemudian, olesan digenangi dengan zat pewarna karbol fuchsin, tujuan pemberian karbol fuchsin adalah untuk mewarnai seluruh sel bakteri. Kemudian salah satu bagian kaca objek diberi tanda lingkaran menggunakan spidol yang merupakan daerah pengamatan, sehingga akan memudahkan saat menggunakan mikroskop. Kaca objek dibilas dengan aquades kemudian dibilas dengan alkohol asam. Perlakuan pencucian dengan menggunakan aquades mengalir bertujuan untuk menutup kembali lemaknya. Tujuan pemberian alkohol asam adalah meluruhkan warna dari carbol fuchsin, tetapi pada golongan BTA tidak terpengaruh pemberian alkohol asam karena memiliki lapisan lipid yang sangat tebal sehingga alkohol sukar menembus dinding sel bakteri tersebut dan warna merah akibat pemberian carbol fuchsin tidak hilang. Kemudian, genangi olesan dengan zat pewarna biru metilen selama 2 menit, dan dibilas dengan aquades sehingga olesan berwarna biru pucat. Tujuan pemberian biru metilen adalah memberi warna background. Kemudian, dilap dengan menggunakan kertas saring yaitu dengan cara menepuk- nepuk kaca objek, kaca objek dilap bukan dengan digesek agar sampel yang sudah menempel tidak ikut terangkat. Selanjutnya, ditetesi minyak imersi agar diperoleh perbesaran yang lebih baik saat melakukan pengamatan menggunakan mikroskop cahaya.
warna terlalu ditekan; dan saat melewatkan kaca objek diatas api terlalu lama menyebabkan bakteri mati.
VIII. KESIMPULAN DAN SARAN 8.1 Kesimpulan
Dari percobaan yang telah dilakukan diperoleh kesimpulan, yaitu metode pewarnaan tahan asam (pewarnaan Ziehl- Neelsen) terhadap suspensi bakteri Saprofit dengan pewarna karbol fuchsin dan biru metilen dengan perbesaran mikroskop 10 x 10 terlihat sel bakteri berwarna ungu karena tertumpuk dengan zat pewarna yang digunakan. Seharusnya diperoleh pengamatan berupa bakteri yang tahan asam berwarna merah dan bakteri yang tidak tahan asam berwarna biru.
8.2 Saran
Untuk praktikum selanjutnya disarankan agar selama pengerjaan lebih tenang dan tertib agar tidak mengganggu praktikan lain yang sedang bekerja. Penggunaan ose setelah difiksasi harus didinginkan tersebih dahulu sebelum mengambil sampel. Penggunaan suspensi bakteri dalam tabung reaksi kiranya bergantian dan tidak egois. Dan setelah menggunakan alat dan bahan dikembalikan ketempat semula agar tidak berantakan dan meja kerja tetap bersih.
IX. DAFTAR PUSTAKA
Anjani, Ni Kadek D. 2014. Pewarnaan BTA available online at http://www.academia.edu/7704555/PEWARNAAN_BTA (diakses pada 17 Maret 2015).
Hermawan, M. 2014. Pewarnaan Gram available online at http://www.academia.edu/6554037/5_Pewarnaan_Gram (diakses pada 13 Maret 2015).
Jawetz, E, Melnick dan E.A Adelberg. 1986.Mikrobiologi untuk Profesi Kesehatan.Jakarta: EGC.
