AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN BIOAUTOGRAFI EKSTRAK
ETANOL KULIT BUAH KAKAO (Theobroma cacao L.)
TERHADAP Streptococcus mutans DAN Escherichia coli
NASKAH PUBLIKASI
Oleh:
MUHAMMAD RIO BURHANUDIN
K 100 090 106
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
SURAKARTA
1 AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN BIOAUTOGRAFI EKSTRAK ETANOL KULIT BUAH KAKAO (Theobroma cacao L.) TERHADAP Streptococcus mutans
DAN Escherichia coli
ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND BIOAUTOGRAPHY OF ETHANOL EXTRACT OF KAKAO HUSK BEAN (Theobroma cacao L.) AGAINTS
Streptococcus mutansAND Escherichia coli
Muhammad Rio Burhanudin, Peni Indrayudha dan Rima Munawaroh
Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta
Jl.Ahmad Yani Tromol Pos I, Pabelan Kartasura Surakarta 57102 Email : robert_denrio@yahoo.com
ABSTRAK
Salah satu tanaman tropis yang banyak mengandung polifenol adalah kakao (Theobroma cacao L.). Kulit buah kakao belum banyak dimanfaatkan. Polifenol diketahui memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol kulit buah kakao terhadap Streptococcus mutans dan Escherichia coli.
Ekstraksi menggunakan maserasi dengan pelarut etanol 96%. Metode disk difusi (Kirby Bauer) digunakan dalam uji aktivitas antibakteri. Seri konsentrasi yang digunakan dalam pengujian terhadap bakteri Streptococcus mutans adalah 0,5 mg/disk, 1 mg/disk, 1,5 mg/disk, 2 mg/disk, dan 2,5 mg/disk. Pada bakteri Escherichia coli
digunakan seri konsentrasi 1 mg/disk, 2 mg/disk, 3 mg/disk, 4 mg/disk dan 5 mg/disk. Bioautografi digunakan untuk mengetahui golongan senyawa yang aktif sebagai antibakteri dengan terlebih dahulu dilakukan KLT dengan fase diam silika gel GF 254 dan fase gerak n-heksan : etil asetat : metanol (12:7:1) v/v/v.
Ekstrak memiliki aktivitas terhadap bakteri Streptococcus mutans dengan diameter zona hambat 9±0,0 mm pada konsentrasi 2,5 mg/disk. Hasil KLT menunjukkan ekstrak mengandung fenolik, terpenoid, kumarin dan flavonol. Bioautografi kontak yang dilakukan menunjukkan bahwa senyawa yang beraktivitas sebagai antibakteri adalah fenolik.
Kata kunci : Theobroma cacao L, antibakteri, Streptococcus mutans, Escherichia coli, bioautografi
ABSTRACT
One of tropical plant that contain polifenol excessively is cacao (Theobroma cacao L.).The husk has not been widely used. The polifenol are known have antibacterial properties. This aims of the experiment is to know the antibacterial activity of etanol extract of kakao husk againts Streptococcus mutans and Escherichia coli.
2 Escherichia coli was 1 mg/disk, 2 mg/disk, 3 mg/disk, 4 mg/disk dan 5 mg/disk. Bioautography used to determine the class of the active compound as antibacterial that beforehanded by TLC with silica gel GF 254 nm as solid phase and n-hexane : etylacetate : metanol (12:7:1)v/v/v as mobile phase.
The extract have antibacterial activity againts Streptococcus mutans with diameter of inhibition zone was 9±0,0 mm at concentration 2,5 mg/disc. TLC show that the extract contain phenolic, terpenoid, coumarin and flavonol. The contact bioautography conducted showed that the extract have phenolic compound that act as antibactery.
Keyword : Theobroma cacaoL, antibactery, Streptococcus mutans,
Escherichia coli, bioautography
PENDAHULUAN
WHO menyatakan bahwa penyakit infeksi mulut merupakan masalah yang
penting dalam dunia kesehatan. Untuk itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut guna
meningkatkan kualitas kesehatan masyarakat di seluruh dunia terutama di bidang
kesehatan mulut (Petersen, 2005). Salah satu bakteri penyebab penyakit mulut adalah
Streptococcus mutans (Pieralisi et al, 2009; Srikanth et al., 2008). Streptococcus mutans
merupakan bakteri Gram positif yang umum ditemukan di mulut. Pada pasien dengan
penyakit periodontitis kronis, terjadi peningkatan yang signifikan terhadap jumlah
bakteri tersebut daripada keadaan normal tanpa penyakit periodontitis (Contardo, 2011).
Dunia juga memberi perhatian terhadap Escherichia coli, karena bakteri ini sering
menimbulkan beberapa penyakit serius. Beberapa penyakit yang sering ditimbulkannya
adalah urinary tract infections, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia, diare, dan
hemorrhagic colitis (ISDH, 2008; Panganiban, 2012; Radji, 2005). Penelitian dilakukan
untuk mengeksplorasi senyawa alternatif dari tanaman yang memiliki aktivitas
antibakteri. Salah satu tanaman yang digunakan sebagai objek penelitian adalah kakao.
Kakao merupakan tanaman tropis yang banyak dibudidayakan untuk
kepentingan komersial. Tanaman ini berasal dari Amerika Selatan dan Amerika Tengah.
Suku Maya, Aztec dan Indian telah terlebih dahulu mengenal, membudidayakan dan
menggunakan tanaman ini untuk digunakan sebagai alat barter, campuran dalam
makanan, minuman maupun dalam pengobatan (Wahyudi et al., 2008). Saat ini kakao
banyak digunakan dalam produk makanan, minuman, kosmetik dan farmasi (PPKKI,
2004). Bagian yang umum digunakan dalam pembuatan produk tersebut adalah biji
3 Kulit kakao memiliki kandungan polifenol yang tinggi (Arlorio et al., 2008;
Han et al., 2010). Kandungan polifenol tersebut antara lain adalah asam sinamat, tanin,
pirogalol, kuersetin, resorsinol dan epikatekin-3-galat (Fapohunda dan Afolayan, 2012).
Senyawa mayor yang terdapat dalam kulit kakao adalah (-)-epikatekin dan asam
p-hidroksibenzoat (Arlorio et al., 2008). Komponen fenolik diketahui memiliki aktivitas
sebagai antioksidan, antiradikal, antikarsinogenik (Wollgast & Anklam, 2000 cit Arlorio
et al., 2008) dan aktivitas sebagai antimikroba ditunjukkan oleh penelitian Osawa et al.
(1990). Sel yang menghasilkan polifenol dalam kakao banyak terdapat pada jaringan
kotiledon dan jaringan parenkim buah kakao (Elswer et al., 2010).
Ekstrak kulit kakao memiliki kemampuan untuk membersihkan plak yang
disebabkan oleh bakteri (Srikanth et al., 2008). Plak yang terakumulasi di mulut dapat
menyebabkan terjadinya karies gigi pada anak-anak, periodontitis atau penyakit mulut
yang lain (Hirao, 2010). Senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri pada tanaman
tersebut adalah prosianidin (Gazzani et al., 2011), katekin dan turunannya (Friedman et
al, 2006; Si et al., 2006), serta kuersetin (Cushnie dan Lamb, 2005).
Sartini et al. (2007), menunjukkan ekstraksi kulit buah kakao dengan aseton :
air (7:3) dan etanol 70%. Hasil menunjukkan bahwa kedua ekstrak tersebut mampu
menghambat pertumbuhan bakteri uji dengan menggunakan metode difusi agar. Bakteri
uji yang digunakan dalam penelitian tersebut adalah Escherichia coli, Salmonella
Thyposa, Staphylococcus aureus, dan Streptococcus mutan (Sartini et al., 2007).
Golongan polifenol yang bersifat polar dapat diekstraksi dengan pelarut alkohol seperti
etanol (Andersen dan Markham, 2006). Maka, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
tentang aktivitas antimikroba ekstrak etanol 96% kulit buah kakao terhadap bakteri
Streptococcusmutans dan Escherichia coli. Pelarut etanol 96% selain menyari senyawa
polar, juga menyari senyawa semi polar, bahkan dapat menyari senyawa yang nonpolar
(Andersen dan Markham, 2006; Tiwari et al., 2011).
METODE PENELITIAN
Alat : Bejana maserasi, pengaduk kayu, penangas air, cawan porselen, vacum rotary evaporator (Heidolph EH-B®), neraca analitik (Precisa®), object glass, deck glass,
penjepit, ose, mikroskop (Olympus®), pipet tetes, autoklaf, oven (MEMERT®),
4
tips, spreader glass, LAF (Astari Niagara International®), api bunsen, bejana
kromatografi, pipa kapiler, pinset.
Bahan : Bakteri Escherichia coli dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta, bakteri Streptococcus mutans dari Laboratorium
Biologi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, cat gram A, cat gram
B, cat gram C dan cat gram D, aquadest dan formalin 1%, kulit buah kakao (dari daerah
Kartasura, Kab. Sukoharjo) kering, etanol 96% teknis, blank paper disc (Oxoid®), disk
kloramfenikol (Oxoid®), pelarut Dimetyl Sulfoxide (Merck®), suspensi bakteri, Nutrien
agar (Oxoid®), media Mueller Hinton (MH) (Oxoid®), media Brain Heart Infusion
(BHI) (Oxoid®), NaCl (Merck®), alkohol 70%, akuades steril, silika gel GF254,
n-heksan : etil asetat : metanol (12 : 7 : 1) v/v/v dengan grade pro analysis, reagen
semprot sitroborat, FeCl3, Dragendorf dan Liebermann Burchard (LB).
Cara Penelitian
Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Biologi Fakultas Farmasi
Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Penyiapan Bahan
Kulit buah didiamkan dahulu selama 5 hari . Buah utuh diambil kulitnya dan
dicuci bersih dengan air mengalir, dikeringkan kemudian bahan ditumbuk kasar.
Pembuatan ekstrak
Seribu g serbuk kasar kulit buah kakao ditempatkan dalam bejana maserasi dan
ditambahkan etanol 96% sebanyak 7,5 liter sampai simplisia terendam semua. Maserasi
dilakukan selama 3 hari sambil sesekali diaduk. Setelah 3 hari, dilakukan penyaringan
maserat dengan dengan kain flannel bersih sehingga didapatkan filtrat etanol.
Remaserasi dilakukan dengan perlakuan yang sama pada ampas yang telah disaring.
Filtrat etanol yang didapat, dikumpulkan dan kemudian dipekatkan menggunakan
vacuum rotary evaporator dan penangas air dan akan diperoleh ekstrak kental kulit
buah kakao.
Penyiapan inokulum bakteri
Bakteri Streptococcus mutans dan Escherichia coli diambil dari stok bakteri
dengan menggunakan ose steril sebanyak satu massa ose dari stok suspensi bakteri. Ose
digoreskan pada media MH dengan metode streak plate, setelah itu diinkubasi pada
5 Pembuatan suspensi bakteri dilakukan dengan mengambil satu ujung ose
biakan (3-5 koloni bakteri), kemudian disuspensikan dalam media Brain Heart Infusion
steril sebanyak 5 mL dan diinkubasi selama 2-6 jam pada 35o C. Hasilnya diambil
dengan mikropipet sebanyak 200 µ L dan disamakan kekeruhannya dengan standard Mc
Farland 1,5 X 108 CFU/mL dengan penambahan normal salin atau NaCl 0,9%.
Konsentrasi bakteri ini yang akan digunakan dalam pengujian.
Pembuatan larutan uji Pembuatan larutan stok
Larutan stok dibuat dengan melarutkan 5000 mg ekstrak ke dalam 10 mL
DMSO 100%, sehingga diperoleh konsentrasi 50%.
Pembuatan seri konsentrasi
Konsentrasi 50% larutan stok ekstrak dibuat seri konsentrasi 5%; 10%; 15%;
20% dan 25% untuk uji bakteri Streptococcus mutans. Larutan stok tersebut diambil
100 µL, 200 µL, 300 µL, 400 µL , 500 µL dan diencerkan sampai 0,5 mL dengan
DMSO 30%. Untuk bakteri uji Escherichia coli digunakan seri konsentrasi 10%, 20%,
30%, 40% dan 50% yang diencerkan dengan DMSO 100%. Masing-masing seri
konsentrasi diambil sebanyak 10 µL kemudian diteteskan pada paper disc dan dibiarkan
mengering.
Uji aktivitas antibakteri
Sebanyak 20 mL media MH cair yang telah steril diukur dalam gelas ukur
steril dan dituang ke dalam cawan petri steril, kemudian dibiarkan memadat dan
diinokulasi bakteri dengan konsentrasi 1,5 X 108 CFU/mL sebanyak 200 µL. Paper disc
yang telah diberi seri konsentrasi ekstrak kulit kering kakao diletakkan di atas media
yang telah diinokulasi dengan bakteri. Kemudian diinkubasi pada 37o C selama 24 jam.
Dihitung diameter zona hambat tiap seri konsentrasi ekstrak dan dibandingkan terhadap
kontrol. Kontrol positif digunakan antibiotik kloramfenikol (30 µg/disk). Sedangkan
kontrol negatif adalah larutan DMSO 100% untuk bakteri Escherichia coli dan DMSO
30% untuk bakteri Streptococcus mutans.
Uji kandungan senyawa dengan kromatografi lapis tipis Penyiapan uji KLT
Larutan uji dibuat dalam konsentrasi 25% v/v dengan menimbang ekstrak kulit
6 Pemilihan dan optimasi fase gerak
Fase gerak yang digunakan untuk melakukan elusi adalah n-heksan : etil asetat
: metanol (12 : 7 : 1) v/v/v.
Elusi
Sebelum melakukan elusi, bejana kromatografi dijenuhkan terlebih dahulu
dengan fase gerak yang akan dipakai dalam elusi. Plat silika GF254 diaktifkan dengan di
oven pada suhu 110o C selama 1 jam. Kemudian sampel yang berupa ekstrak etanol
kulit kakao ditotolkan sebanyak 5 µL pada lempeng plat KLT dan dibiarkan mengering.
Setelah kering dimasukkan plat pada bejana kromatografi yang telah jenuh dengan fase
gerak. Mulut bejan diolesi dengan vaselin sebelum ditutup. Setelah elusi selesai, plat
diambil dan dikeringkan sampai fase gerak yang ada pada plat menguap dan mengering.
Bioautografi
Plat KLT yang telah selesai dilakukan elusi ditempelkan pada media MH yang
telah diinokulasi dengan bakteri Streptococcus mutans dan Escherichia coli,
masing-masing sebanyak 200 µL kemudian dibiarkan selama 20 menit. Plat diambil dan
kemudian media diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37o C.
Analisis Data Uji antibakteri
Uji antibakteri dengan metode difusi diamati aktivitas antibakterinya dengan
mengukur diameter zona hambat yang dihasilkan ekstrak etanol kulit buah kakao.
Analisis kandungan ekstrak etanol kulit buah Theobroma cacao L.
Analisis kandungan ekstrak etanol kulit buah kakao menggunakan KLT. Plat
yang sudah dielusi dideteksi dengan sinar tampak, UV 254 nm, UV 366 nm dan
disemprot dengan pereaksi semprot, antara lain sitroborat yang dilanjutkan pengamatan
pada UV 366 nm untuk deteksi golongan senyawa flavonoid, FeCl3 untuk deteksi fenol,
pereaksi Lieberman-Burchard untuk deteksi terpenoid dan Dragendorf untuk deteksi
alkaloid (Wagner dan Bladt, 1996). Warna bercak yang ditimbulkan dihitung hRf-nya
dan dibandingkan dengan pustaka.
Analisis bioautografi
Aktivitas antibakteri dapat diketahui dengan mengamati zona jernih yang
merupakan zona hambat. Zona jernih yang terjadi karena adanya difusi golongan
7 HASIL DAN PEMBAHASAN
Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakaukan dengan mencocokkan ciri-ciri morfologis
dengan pustaka yaitu “Flora of Java” karangan Backer dan van den Brink, 1965 dan “An Integrated System of Classification of Flowering Plant” karangan Cronquist, 1981. Tanaman yang digunakan sebagai bahan penelitian adalah spesies Theobroma cacao L.
Ekstraksi
Metode yang digunakan dalam ekstraksi kulit buah kakao adalah maserasi.
Metode ini dipilih karena kemudahan dan kesederhanaan dalam pengerjaannya, tetapi
metode ini memiliki kelemahan yaitu terlalu memakan waktu dan kurang efektif dalam
menyari zat aktif (Sarker, 2006) .
Cairan penyari yang digunakan dalam proses ekstraksi adalah etanol 96%.
Etanol 96% dipilih karena memiliki beberapa kelebihan antara lain relatif aman,
memiliki efek pengawetan, memliki kemampuan menyari zat-zat yang bersifat polar
hingga semipolar, seperti golongan polifenol dan triterpenoid (Andersen dan Markham,
2006; Tiwari et al, 2011). Selain itu, kadar etanol yang tinggi dapat mudah menguap
sehingga menguntungkan dalam proses pengeringan ekstrak (Tiwari et al, 2011).
Proses maserasi diulang dua kali (remaserasi) dengan tujuan untuk melarutkan
senyawa yang belum terekstraksi sempurna. Kulit buah kakao kering sebanyak 1000 g
menghasilkan ekstrak kental seberat 48,26 g sehingga diperoleh rendemen sebesar
4,83%.
Uji Aktivitas Antibakteri
Metode yang digunakan dalam pengujian antibakteri adalah difusi disk. Metode
ini cocok digunakan untuk mengetahui sensitivitas bakteri terhadap zat aktif yang ada
dalam ekstrak. Zat aktif ekstrak akan berdifusi secara pasif ke media yang diinokulasi
bakteri. Zona bening mengindikasikan adanya penghambatan terhadap pertumbuhan
bakteri. Zona ini memiliki dua macam jenis yaitu radikal dan irradikal.
Konsentrasi ekstrak yang digunakan dalam pengujian terhadap Streptococcus
mutans adalah 0,5 mg/disk, 1 mg/disk, 1,5 mg/disk, 2 mg/disk dan 2,5 mg/disk.
Sedangkan untuk bakteri Escherichia coli digunakan konsentrasi 1 mg/disk, 2 mg/disk,
3 mg/disk, 4 mg/disk, dan 5 mg/disk. Pelarut ekstrak digunakan DMSO (Dimetil
Sulfoksida) 100% untuk bakteri E.coli dan DMSO 30% untuk S.mutans. Pengujian
8 DMSO 100% memiliki zona hambat terhadap S.mutans. Pengujian menggunakan disk
antibiotik kloramfenikol 30 mg/disk sebagai kontrol positif dan disk yang berisi pelarut
ekstrak sebagai kontrol negatif.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa ekstrak etanol kulit buah kakao memiliki
aktivitas terhadap S.mutans dan tidak memiliki aktivitas terhadap E.coli. Hal ini
dibuktikan dengan adanya zona hambat radikal pada pengujian terhadap S.mutans dan
tidak ditemukan zona hambat pada E.coli. Konsentrasi terkecil penghambatan S.mutans
ditemukan pada konsentrasi 0,5 mg/disk dengan diameter zona hambat rata-rata 6,66
mm berupa zona radikal. Penghambatan terbesar pada konsentrasi 2,5 mg/disk dengan
diameter zona hambat rata-rata adalah 9 mm berupa zona radikal. Ekstrak etanol kulit
buah kakao tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap E.coli, sebab dinding sel
bakteri Gram negatif mampu menghasilkan membran biofilm, membran ini dapat
menghalangi fagositosis dan menghalangi penetrasi oleh ekstrak. Hal ini yang
menyebabkan bakteri Gram negatif seperti E.coli kurang sensitif terhadap senyawa
antibakteri. Ekstrak etanol kulit buah kakao memiliki aktivitas antibakteri yang jauh
lebih kecil terhadap kedua bakteri jika dibandingkan dengan antibiotik kontrol.
Tabel 1. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol kulit buah kakao terhadap Streptococcus mutans dan
Escherichia coli (n = 3).
Seri Streptococcus mutans Escherichia coli
Konsentrasi
Diameter zona hambat* ± SD Diameter zona hambat* ± SD (mg/disk)
* : Diameter zona hambat termasuk diameter disk. ** : Zona hambat radikal.
X : Tidak dilakukan pengujian.
Aktivitas antibakteri ekstrak aseton kulit buah segar kakao memiliki potensi
yang lebih kecil daripada ekstrak etanol kulit buah keringnya. Diameter zona hambat
yang dihasilkan dari ekstrak aseton tersebut adalah 8 ± 0,3 mm pada konsentrasi 2,5
mg/disk terhadap bakteri S.mutans dan tidak memiliki aktivitas pada bakteri E.coli
9 dimungkinkan karena senyawa yang terekstraksi lebih sedikit karena bahan yang
digunakan juga lebih sedikit.
Penelitian Sartini et al. (2007) menunjukkan kulit kakao yang dimaserasi
dengan etanol 70% menghasilkan zona hambat pada Escherichiacoli dan Streptococcus
mutans. Zona hambat paling besar yang dihasilkan terhadap E.coli dan S.mutans
berturut-turut 8,15 mm dan 8,95 mm dengan konsentrasi ekstrak tiap disk 1 mg/disk.
Perbedaan pada hasil uji dengan bakteri Escherichia coli dapat disebabkan karena
perbedaan tempat tumbuh tanaman, cairan penyari yang digunakan.
Kromatografi Lapis Tipis
Bercak yang telah dielusi dengan fase gerak n-heksan : etilasetat : metanol
(12:7:1) dideteksi dengan sinar UV (254 nm dan 366 nm) dan pereaksi semprot yang
spesifik. Deteksi alkaloid dengan pereaksi Dragendorf akan menghasilkan bercak
berwarna cokelat (Harbone, 1996). Senyawa fenolik dapat dideteksi dengan pereaksi
FeCl3 dimana akan dihasilkan bercak berwarna hitam, merah, hijau, ungu dan biru.
Sedangkan pereaksi LB digunakan untuk mendeteksi keberadaan senyawa terpenoid
dan akan memberikan warna merah (Wagner dan Bladt, 1995). Beberapa flavonoid
dapat dideteksi dengan pereaksi sitroborat. Hasil penyemprotan dengan pereaksi
tersebut kemudian dipanaskan selama 5 menit pada 110o C dan menghasilkan warna
kuning.
Hasil identifikasi ekstrak etanol kulit kakao dengan fase gerak n-heksan : etil
asetat : metanol (12:7:1) v/v/v mengandung senyawa fenolik, terpenoid, flavonol dan
kumarin. Senyawa tersebut ditemukan pada Rf 0,0 dan 0,96 yang ditandai dengan
bercak warna hitam dan warna abu-abu dengan intensitas warna yang rendah setelah
disemprot dengan FeCl3 untuk masing-masing bercak. Hasil dari penyemprotan dengan
pereaksi Dragendorff menghasilkan bercak berwarna cokelat pada Rf 0,0. Hasil ini
menunjukkan tidak adanya alkaloid dalam ekstrak. Senyawa flavonol terdapat pada Rf
0,06 dan 0,98. Senyawa terpenoid pada 0,74; 0,8 dan 0,85. Penyemprotan dengan
sitroborat tidak menunjukkan adanya flavonoid dalam ekstrak. Penyemprotan dengan
10 A B C D E F
Gambar 5. Kromatogram ekstrak etanol kulit buah kakao dengan fase gerak n-heksan : etilasetat : metanol (12:7:1) v/v/v.
Keterangan :
A : Deteksi pada UV 254 nm. B : Deteksi pada UV 366 nm.
C : Deteksi fenol denganpereaksi semprot FeCl3.
D : Deteksi alkaloid dengan pereaksi semprot Dragendorff. E : Deteksi flavonoid dengan pereaksi semprot sitroborat.
F : Deteksi terpenoid dengan pereaksi semprot Liebermann-Burchard.
Tabel 2. Hasil uji kromatografi lapis tipis terhadap ekstrak etanol kulit kakao dengan fase gerak n- heksan : etil asetat : metanol (12:7:1) dan fase diam Silica gel GF 254 (jarak elusi 6 cm).
No Rf UV 254 UV 366 Pereaksi Semprot Senyawa
Hasil identifikasi dengan pereaksi semprot menunjukkan ekstrak positif
mengandung senyawa fenolik dan kumarin. Beberapa penelitian sebelumnya
menyatakan bahwa dalam kulit kakao memiliki kandungan senyawa fenolik seperti
senyawa fenolik yaitu tannin, asam sinamat, kuersetin resorsinol, epikatekin-3-galat,
pirogalol (Fapohunda dan Afolayan, 2012) dan prosianidin (Gazzani et al., 2011).
11 Uji Bioautografi
Uji bioautografi digunakan untuk mengetahui jenis senyawa yang dapat
memberikan aktivitas antibakteri pada ekstrak. Metode yang digunakan dalam uji
bioautografi adalah bioautografi kontak. Kelebihan dari bioautografi ini adalah
mudahnya proses yang dilakukan. Sebelum dilakukan uji bioautografi dilakukan
optimasi pelarut ekstrak. Hasil optimasi diperoleh pelarut yang dapat melarutkan
ekstrak yaitu metanol : air (1:1) v/v. Konsentrasi ekstrak yang dibuat untuk uji
bioautografi adalah 25%.
Streptococcus mutans digunakan sebagai bakteri uji. Ekstrak yang telah dielusi
dengan pelarut n-heksan : etil asetat : metanol (12:7:1) v/v/v ditempelkan pada media
MH yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Dalam pengujian digunakan kontrol plat
KLT yang telah dielusi dengan fase gerak. Kontrol tersebut digunakan untuk
mengetahui fase gerak tersebut menghambat pertumbuhan bakteri atau tidak (Gambar
6). Hasil uji bioautografi didapat zona jernih pada bekas totolan. Hasil penyemprotan
dengan reaksi semprot menunjukkan bahwa senyawa yang terdeteksi adalah senyawa
fenolik.
Gambar 3. Hasil uji bioautografi ekstrak etanol kulit buah kakao terhadap Streptococcus mutans
dengan fase gerak n-heksan : etilasetat : metanol (12:7:1) v/v/v. Keterangan :
K : Kontrol plat KLT yang dielusi dengan fase gerak. S : Ekstrak yang telah dielusi dengan fase gerak.
Osawa et al. (1990) menyatakan komponen fenolik memiliki aktivitas
antibakteri. Senyawa fenolik yang paling banyak ditemukan pada kulit buah kakao
adalah (-)epikatekin (Arlorio et al., 2008). Senyawa yang tergolong dalam flavonoid ini
memiliki aktivitas yang lebih besar pada bakteri Gram positif daripada Gram negatif
12 (Chusnie dan Lamb, 2005). Epikatekin memiliki aktivitas sebagai antibakteri (Preedy et
al., 2011), semakin banyak kandungan epikatekin dalam ekstrak akan meningkatkan
aktivitas antibakterinya (Smullen et al., 2007).
Mekanisme penghambatan bakteri dapat terjadi karena katekin mampu
merusak membran sel dari bakteri. Dua teori dapat digunakan dalam menerangkan hal
ini. Pertama, senyawa dapat langsung melakukan penetrasi pada membran bakteri dan
mengganggu fungsi penghalangan yang ada pada membran. Kedua, senyawa dapat
mengakibatkan fusi pada membran yang membuat kebocoran pada material
intramembran. Penelitian sebelumnya menyatakan membran dengan lipid bermuatan
negatif seperti lipopolisakarida dapat mengahalangi kedua aksi tersebut. Bakteri Gram
negatif memiliki lipopolisakarida, sehingga dapat diketahui bahwa Escherrichia coli
lebih tahan terhadap pengaruh polifenol terutama golongan flavonoid yaitu katekin
(Chusnie dan Lamb, 2005).
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka dapat diperoleh kesimpulan
bahwa :
1.Ekstrak etanol kulit buah kakao (Theobroma cacao L.) memiliki aktivitas antibakteri
terhadap Streptococcus mutans pada konsentrasi 0,5 mg/disk dan tidak memiliki
aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli sampai konsentrasi 5 mg/disk.
2.
Ekstrak etanol kulit buah kakao memiliki kandungan senyawa fenolik, terpenoid,flavonol dan kumarin. Uji bioautografi menunjukkan bahwa senyawa fenolik dalam
ekstrak etanol kulit buah kakao (Theobroma cacao L.) memiliki aktivitas antibakteri
terhadap Streptococcus mutans.
Saran
Perlu dilakukan isolasi senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dalam
ekstrak etanol kulit buah kakao (Theobroma cacao L.) untuk dapat dikembangkan
menjadi produk yang lebih berguna.
DAFTAR ACUAN
13 Arlorio, M., Coïsson, J.D., Travaglia, F., Varsaldi, F., Miglio, G., Lombardi, G., Martelli, A., 2005, Antioxidant and Biological Activity of Phenolic Pigments from Theobroma Cacao Hulls Extracted with Supercritical CO2, Food
Research Int., 38 : 1009-1014.
Backer, C., A., and van den Brink, R., C., B., 1965, Flora of Java : Spermathopytes only Vol.I, 408, Noordhoff, Groningen, Netherland.
Contardo, M.S., Diaz, N., Lobos, O., Padilla, C., Giacaman, R.A., 2011,Oral Colonization by Streptococcus mutans and its Association with Severity of Periodontal Disease in Adults, Rev. Clin. Periodoncia Implantol. Rehabil. Oral. 4 : 9 – 12.
Cronquist, A., 1981, An Integrated System of Classification of Flowering Plants, 477, Columbia University Press : New York.
Cushnie, T.P.T., Lamb, A.J., 2005, Antimicrobial Activity of Flavonoid, Int. Journ. of Antimicrobial Agent. 26 : 343 – 346.
Doyle, M.E., Archer, J., Kaspar, C.W., Weiss, R., 2006, Human Illness Caused by E.
coli O157:H7 from Food and Non-Food Sources, FRI (Food Research
Institute), University of Wisconsin-Madison, Wisconsin-Madison : Amerika. Elwers, S., Zambrano, A., Rohsius, C., Lieberei, R., 2010, Histological Features of
Phenolic Compounds in Fine and Bulk Cocoa Seed (Theobroma cacao L.),
Jour of App. Bot. and Food Qual. 83 : 182 – 188.
Fapohunda, S. O. & Afolayan A., 2012, Fermentation of Cocoa Beans and Antimicrobial Potentials of the pod Husk Phytochemicals, J Phys Pharm Adv.
2(3): 158-164.
Friedman, M., Henika, P.R., Levin, C.E., Mandrell, R.E., Kozukue, N., 2006, Antimicrobial Properties of Tea Catechin and Theaflavin and Tea Extract againts Bacillus cereus, Jour of Food Protect. 69, 354 – 361.
Gazzani, G., Daglia, M., Papetti, A., 2011, Food Component with Anticaries Activity,
Biotechnologi, 23 (2010) : 1-7.
Han, X., Shen, T., & Lou, H., 2007, Dietary Polyphenols and Their Biological Significance. Int. J. Mol. Sci. 8 (2007), 950-988.
Harbone, J., B., 1987, Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, 49, IPB Press : Bandung.
Hidayati, C., 2013, Aktivitas Antibakteri dan Bioautografi Ekstrak Aseton Kulit Buah Kakao terhadap Escherichia coli dan Streptococcus mutans, Skripsi, Universitas Muhammadiyah Surakarta.
14 Indiana State Department of Health, 2009, Environmental Public Health, Diseases
Involving Sewage, Indiana State Department of Health : Indiana.
Matsumoto M, Tsuji M, Okuda J, Sasaki H, Nakano K, Osawa K., 2004, Inhibitory Effects of Cacao Bean Husk Extraction Plaque Formation in Vitro and in Vivo. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15154923 (diakses tanggal 11 April 2012).
Panganiban, C.A., Reyes, R.B., Agojo, I., Armedilla, R., Consul, J.Z., Dagli, H.F., Esteban, L., 2012, Antibacterial Activity of Cacao (Theobroma Cacao Linn.) Pulp Crude Extract Against Selected Bacterial Isolates, Int. Peer Rev. Jour.
Vol : 1.
Pasiga, B., 2007, Efikasi Klinik Obat Kumur yang Mengandung Limbah Kulit Buah Kakao,http://elib.pdii.lipi.go.id/katalog/index.php/searchkatalog/byGroup/auth or/72087 (diakses tanggal 10 Juni 2012).
Pieralisi, F.J.S., Rodrigues, M.R., Segura, V.G., Maciel, S.M., Ferreira, F.B.A., Garcia, J.E., and Poli-Frederico, R.C., 2010, Genotypic Diversity of Streptococcus mutans in Caries-Free and Caries-Active Preschool Children, Int. Jour. of Dent., 2010 : 824976.
PPKKI (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia), 2004, Panduan Lengkap
Budidaya Kakao, 3-13, PT AgroMedia Pustaka : Depok.
Pratiwi, T. Sylvia, 2008, Mikrobiologi Farmasi, 150-160, 188-191, Erlangga : Jakarta.
Preedy, V.R., Watson, R.R., Patel, V.B., 2011, Nuts and Seed in Health and Disease Prevention, 115, Elsevier, London.
Radji, M., 2005, Buku Ajar Mikrobiologi Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran, 127, EGC : Jakarta.
Sarker, S., D., Zahid, L., and Gray, A.,I., Natural Product Isolation, 32, Humana Press Inc. : Totowa.
Sartini, Djide, M. N. & Alam, G., 2007, Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Limbah Kulit Buah Kakao Dan Pengaruhnya Terhadap Aktivitas Antioksidan Dan
Antimikroba, Majalah Obat Tradisional, (online),
(http://mot.farmasi.ugm.ac.id//files//18kulit%20buah%20cacao_Pak%20Alam.pdf , diakses tanggal 13 Januari 2012).
15 Smullen, J., Katsou, G.A., Foster, H.A., Zumbe, A., Storey, D.M., 2007, The antibacterial activity of Plant Extract Containing Polyphenol againts Streptococcus mutans, Caries Res, 41 (5), 342-349.
Si, W., Gong, J., Sao, R., Kalab, M., Yang, R., Yin, Y., 2006, Bioassay-guided Purification and Identification of Antimicrobial Component in Chinese Green Tea Extract, Journal of Chromatography A. 1125, 204 – 210.
Srikanth, R.K., Shashikiran, N.D., Reddy V.V., Subba., 2008, Chocolate Mouth Rinse: Effect on Plaque Accumulation and Mutans Streptococci Counts when Used by Children. J. Indian Soc. Pedod. Prevent Dent. Department of Pediatric Dentistry, College of Dental Sciences and Hospital : Davangere, India.
Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H., 2011, Phytochemical Screening and Isolation : a Review, Internationale Pharmaceutica Sciencia, 1 : 98 – 106.
Wagner, H., & Bladt, S., 1996, Plant Drug Analysis : A Thin Layer Chromatography, Second Ed, Springer : New York.
Wahyudi, T., Panggabean, T.R., Pujiyanto, Yusianto, Zaenudin, Misnawi et al, 2008,
