PARAMETER DAN METODE UJI EKSTRAK (Metode Uji Parameter Non Spesifik)

PARAMETER DAN METODE UJI EKSTRAK

(Metode Uji Parameter Non Spesifik)

TIM DOSEN STANDARISASI DAN PENENTUAN MARKER OBA

TM KE 6

Parameter Non Spesifik

❖ Adalah semua aspek yang tidak terkait dengan aktifitas farmakologi secara langsung namun

mempengaruhi aspek keamanan dan stabilitas ekstrak serta sediaan yang dihasilkan

❖ Standarisasi dan analisis aspek nonspesifik

diarahkan pada batas maskimal yang diperkenan- kan terhadap material berbahaya yang ada di

dalam ekstrak

Parameter Non Spesifik

Meliputi :

1. Penetapan Kadar Air

2. Penetapan Susut Pengeringan 3. Penentuan Bobot Jenis

4. Penetapan Sisa Pelarut 5. Penetapan Kadar Abu

6. Penetapan Cemaran Mikroba

7. Penetapan Cemaran Logam Berat

8. Penetapan Residu Pestisida

1. Penetapan Kadar air

❖ Tujuan : menetapkan residu air setelah proses pengentalan atau pengeringan

❖ Pengukuran kadar air ditentukan dengan metode:

1. Titrasi (langsung dan tidak langsung), pereaksi yg digunakan adalah Karl-Fischer

2. Destilasi, pereaksi yang digunakan adalah toluen 3. Gravimetri (tidak sesuai untuk ekstrak dgn

kandungan minyak atsiri tinggi)

Penetapan Kadar air (lanjutan)

Titrasi langsung Titrasi tidak langsung

±20 ml methanol (dalam labu titrasi) → dititrasi dengan Karl Fischer s/d TAT → masukan

(dgn cepat) zat (mengandung

±10-50 mg air) → aduk 1

menit → titrasi dgn Karl Fischer yg telah diketahui kesetaraan airnya

±20 ml methanol (dalam labu titrasi) → dititrasi dengan Karl Fischer s/d TAT → masukan (dgn cepat) zat (mengandung ±10-50 mg air) → aduk 1 menit →

tambahkan Karl Fischer berlebih yg diukur seksama → titrasi dgn baku air-metanol

Sumber gambar: google image

b. Destilasi

Penetapan Kadar air

(lanjutan)

Sumber gambar: Depkes RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan, Jakarta

c . Metode Gravimetri (= susut pengeringan)

▪ Cawan kosong dipanaskan dalam oven pada suhu 105 ⁰C

selama 30 menit, didinginkan dalam eksikator selama 15 menit, lalu ditimbang (W₀).

▪ Masukkan + 10 gr ekstrak dalam wadah yg telah tara (W₁).

▪ Keringkan dalam oven pada suhu 105 ^oC selama 3 jam → didinginkan dalam eksikator selama 15-30 menit → timbang

▪ Lanjutkan pengeringan dan timbang dg jarak 1 jam sampai perbedaan antara 2 penimbangan berturut2 tdk lebih dari 0,25% (W₂).

Kadar air (%) = (W₁ – W₂) x 100 (W₁ – W₀)

❖ Prinsip : Pengukuran sisa zat setelah pengeringan pada temperatur 105

^o

C selama 30 menit atau sampai berat konstan yang dinyatakan sebagai nilai prosen (%)

❖ Dalam hal khusus, jika bahan tdk mengandung minyak menguap/m. atsiri & sisa pelarut organik menguap maka identik dg kadar air yaitu kandungan air karena berada di atmosfer/lingkungan udara terbuka

❖ Tujuan : memberi batasan maksimal (rentang) tentang besarnya senyawa yg hilang pd proses pengeringan

2. Penetapan Susut Pengeringan

2. Penetapan Susut Pengeringan

Cara:

✓ botol timbang dangkal bertutup dalam kondisi kosong

dipanaskan 105 °C selama 30 menit, dinginkan & tara →

✓ masukan 1-2 g ekstrak, ratakan

→ masukan ke dalam oven, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105 °C selama 30 menit →

✓ dlm keadaan tertutup dinginkan dlm eksikator hingga suhu

kamar, timbang

.

Catatan:

❖ Sebelum tiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator

❖ Jika sulit kering dan mencair pada pemanasan, tambahkan 1 g silika yg telah ditimbang seksama (sebelumnya silika dikeringkan dan disimpan dulu dalam eksikator sampai suhu kamar) → campuran ekstrak+silika dipanaskan lagi pada suhu tersebut damapi bobot tetap

❖ Lakukan hingga bobot tetap: perbedaan 2x penim- bangan berturut-turut setelah dikeringkan/dipijar

selama 1 jam < 0,25% atau perbedaan penimbangan

tsb <0,5 mg

❖ Prinsip : masa persatuan volume pada suhu kamar tertentu (25 °C) yang ditentukan dg alat khusus

piknometer atau alat yg lainnya

❖Tujuan :

▪ memberikan batasan tentang besarnya masa per satuan volume yg merupakan parameter khusus

ekstrak cair sampai ekstrak pekat (kental) yg masih dapat dituang

▪ Memberikan gambaran kandungan kimia terlarut

3. Penentuan Bobot Jenis

3. Penentuan Bobot jenis

Prosedur:

piknometer (dlm kondisi bersih, kering dan telah dikalibrasi), ditimbang → Ekstrak cair (suhu ±20 °C) dimasukan ke dalam

piknometer → atur suhu piknometer+ekstrak hingga suhu ±25 °C), tutup → buang

kelebihan ekstrak cair → piknometer+ekstrak ditimbang. Lakukan hal yg sama thdp air.

Cara hitung:

BJ = pikno+ekstrak/pikno+air x BJ air

Sumber gambar: google image

4. Penetapan Sisa Pelarut

❖ Tujuan : menetapkan kandungan sisa pelarut tertentu setelah pengeringan

❖ Metode: destilasi (penetapan kadar etanol), atau

metode lain seperti: Kromatografi gas-cair (kolom kaca berisi S3; gas pembawa = Nitrogen/Helium; detektor = FID)

❖ Nilai: maksimal yg diperbolehkan, namun jika pelarut tsb

berbahaya (co: kloroform) maka nilainya harus negatif

5. Penetapan Kadar

❖ Tujuan : memberikan gambaran

Abu

kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya ekstrak

❖ Kadar abu dinyatakan dalam % (b/b)

❖ Prosedur :

➢ Penetapan kadar abu total,

➢ penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam

➢ Penetapan kadar abu larut asam

Sumber gambar: google image

5. Penetapan Kadar Abu (lanjutan)

a. Penetapan kadar abu total

Pijar dan tara krus silikat → 2-3 g ekstrak (telah digerus)

dimasukan ke dlm krus silikat, ratakan → pijar perlahan suhu 500-600°C hingga arang habis (jadi abu putih), dinginkan

dlm desikator, timbang.

Catatan:

- Jika arang tidak hilang: tambahkan air panas 2 ml → saring dgn kertas saring bebas abu → filtrat masukan Kembali

dlm krus, uapkan dgn waterbath, pijarkan kembali bersama

kertas tersebut dalam krus yg sama hingga bobot tetap,

timbang.

5. Penetapan Kadar Abu (lanjutan)

b. Kadar abu larut dalam air

❖ Abu yang diperoleh dari kadar abu total, didihkan dengan 25 ml aquades (tutup dgn kaca arloji) selama 5 menit

❖ Kumpulkan bagian yang tidak larut dalam air, saring dengan kertas saring bebas abu

❖ Bilas dengan dgn air panas, pijarkan bahan yg larut air dalam krus di dalam oven pada suhu >450 °C selama 15 menit hingga bobot tetap, dinginka dlm desikator 30 menit dan ditimbang

❖ Hitung kadar abu yang tidak larut asam terhadap bahan

yang telah dikeringkan

c. Kadar abu tidak larut dalam asam

Tujuan: ukur keberadaan cemaran silika dari pasir/tanah

❖ Abu yang diperoleh dari kadar abu total, didihkan dengan 25 ml H

₂

SO

₄

/ HCl encer P (tutup dgn kaca arloji) selama 5

menit

❖ Kumpulkan bagian yang tidak larut dalam asam, saring dengan kertas saring bebas abu

❖ Cuci dgn air panas, pijarkan kertas saring yang mengandung bahan yg tidak larut asam dalam krus di atas hotplate hingga bobot tetap, dinginka dlm desikator 30 menit dan ditimbang

❖ Hitung kadar abu yang tidak larut asam terhadap bahan yang telah dikeringkan

5. Penetapan Kadar Abu

(lanjutan)

6. Penetapan Cemaran Mikroba

❖ Definisi: menentukan adanya mikroba patogen secara analisis mikrobiologi

❖ Tujuan: memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak boleh mengandung mikroba patogen dan non

patogen melebihi batas yang ditetapkan ➔ akan

berpengaruh pd stabilitas ekstrak dan berbahaya

bagi kesehatan

❖ Mikroba patogen : Salmonella thypi, E. Coli, Bacillus subtilis, Aspergillus flavus, S.aureus

❖ Batasan cemaran mikroba:

a) ALT : < 10

⁴

kol/g

b) Angka kapang /kamir : < 10

³

kol/g c) MPN coliform : < 3 kol/g

d) Mikroba patogen : negatif

❖ Prosedurnya :

1. Uji Angka Lempeng Total

2. Uji Nilai Duga Terdekat (MPN) Coiliform

Sterilisasi Ekstrak

1. Merendam semua ekstrak ke dalam etanol 70%

semalam kemudian diuapkan dengan tangas air stainless

2. Semua ekstrak disterilkan dengan sinar UV - 18

jam

Penetapan Angka Lempeng Total (ALT)

❖ Prinsip: pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasikan pada media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai.

❖ Media : Plate Count Agar (PCA)

❖ Pereaksi : Pepton dilution Fluid (PDF), Fluid Casein

Digest Soy Lecithin Polysorbat (FCDSLP), minyak

mineral (parafin cair), tween 80 dan 20

❖ Prosedur : Monografi ekstrak tumbuhan obat Indonesia, 2006 hal 219

❖ Penghitungan : dipilih cawan petri yang

menunjukkan jumlah koloni 30 - 300. Jumlah koloni dihitung kemudian dirata-rata dan

dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil

dinyatakan dengan ALT dalam tiap gram.

Prosedur ALT

Sumber gambar : google image

Uji Nilai Dugaan Terdekat (MPN) Coliform

❖ Prinsip: melihat adanya pertumbuhan bakteri

coliform setelah cuplikan diinokulasi pada media yang sesuai.

❖ Adanya reaksi fermentasi dan pembentukan gas di dalam tabung durham menandakan adanya bakteri coliform

❖ Media dan Pereaksi : PDF, MCB/LB, BGLB, EMBA,

VRBA, MR-VP, Trypton Broth, Simmon’s Citrate Agar,

Nutrient agar

❖ Ada 3 tahap :

1. Uji Prakiraan / Presumtive Test → memakai media Mac Conkey Broth (MCB) atau Lactosa Broth (LB) dalam

tabung reaksi yg didalam nya ada tb durham → inokulasi sample dan inkubasi 24 - 48 jam pd suhu 37

^o

C → yg

positif lanjut ke uji konfirmasi

2. Uji Konfirmasi → memakai media BGLB dalam tabung reaksi yg didalam nya ada tb durham → inokulasi sample dan inkubasi 24 - 48 jam pd suhu 37

^o

C → jumlah tabung yg positif dirujuk dalam tabel MPN (Tabel MPN

menyatakan jumlah bakteri coliform dalam tiap gram

contoh yg diuji

3. Uji Lengkap : dg media selektif

Presumptive Test pada media LB

Confirmed Test pada media BGLB

Complete Test pada media selektif

Sumber gambar : google image

• Dari sample dipipetkan ke

tabung reaksi yg berisi media & tb durham

• Inkubasi pada

suhu 37C selama 24 – 48 jam

Sumber gambar : google image

• Tabel MPN

Jika semua tabung positif (3 3 3) maka nilai MPN > 2400

Sumber gambar : google image

Penetapan Angka Kapang dan Khamir

❖ Prinsip: menentukan adanya jamur secara mikrobiologis

❖ Tujuan: memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak mengandung cemaran jamur melebihi batas yang ditetapkan

❖ Media : Potato Dextrosa agar (PDA), Czapek Dox Agar (CDA) atau malt agar, air suling agar 0,05%

(ASA)

• Prosedur : Monografi ekstrak tumbuhan obat Indonesia, 2006 hal 222

• Penghitungan : jika pada pengenceran 10

^-4

terdapat sebanyak 40 koloni, maka nilai AKK

adalah 40 x 10

^-4

= 40.10

^-4

koloni per gram

Penetapan Keberadaan Aspergillus flavus

• Aspergillus flavus adalah jamur penghasil metabolit aflatoksin (bersifat hepatotoksik)

• Media: Potato Dekstrosa Agar (PDA), Czapex Dox Agar (CDA), dan Air

suling agar (ASA)

• Inkubasi: 5-7 hari pada suhu ruang.

• Keberadaannya ditandai dengan koloni berwarna hijau kekuningan

sangat cerah

Sumber gambar : google image

Penetapan Cemaran Aflatoksin

❖ Prinsip : pemisahan isolat aflatoksin secara KLT

❖ Metode: KLT (kualitatif)

✓ fase diam = silika gel

✓ Fase gerak = kloroform:aseton:heksana (85:15:20)

❖ pembanding: aflatoksin B1, B2, dan G1, G2

❖ deteksi: sinar UV 366 bercak berwarna biru/hijau kebiruan

❖ jika positif (secara kualitatif), maka dapat ditetapkan

kadarnya dengan metode KLT-densitometer atau HPLC

Hasil Reaksi IMVIC Bakteri E.coli

I INDO

L

M METIL- MERAH

V VOGES PROSKAU

ER

C

CITRAT BAKTERI

+ + - - E. Coli tipikal

- + - - E. Coli atipikal

+ + - + Intermediat

tipikal

- + - + Intermediat

atipikal

- - + + E. aerogenes

tipikal

+ - + + E. aerogenes

atipikal Sumber gambar : google image

Uji Salmonella sp

➢ Pada TSIA (triple Sugar Iron Agar) : warna merah pada permukaan agar,

warna kuning pada dasar tabung dengan atau tanpa pembentukan hidrogen

sulfida

➢ Pada LIA (lysine Iron Agar) : terlihat

warna ungu, bila permukaan berwarna ungu sedangkan bagian dasar warna kuning, dianggap negatif

➢ Uji serologi : terjadi aglutinasi

Sumber gambar : google image

7. Penetapan Kadar Cemaran Logam Berat

▪ Prinsip: menentukan kandungan logam berat dg SSA (Spektrofotometri Serapan Atom)

▪ Kadar logam berat dalam sisa abu total meliputi Pb, Cd, Hg, As, dsb.

▪ Penetapan kadar dengan menggunakan digesti basah sistem terbuka:

1.Timbang 200-250 mg simplisia yang dikering anginkan,

masukkan ke dalam krus silika. Tambahkan 1,0 ml campuran

digesti ( 2 bagian asam nitrat (1000g/L) dan 1 bagian asam

perkolat (1170 g/L) )

2. Tutup krus silika tanpa menggunakan tekanandan masukkan kedalam tanur yang mempunyai pengatur suhu dan waktu

3. Panaskan perlahan lahan hingga 102

^o

C selama 2 jam 4. Naikkan suhu pelan-pelan hingga 240

^o

C, pertahankan

selam 4 jam

5. Larutkan residu inorganik dalam 2,5 ml asam nitrat (1000 g/L) LP dan gunakan untuk uji penetapan kadar logam berat.

6. Bandingkan dengan larutan blanko

7. Penetapa n kadar dengan spektrofotometri serapan atom

(AAS)

8. Penetapan Cemaran Residu Pestisida

➢ prinsip: menentukan kandungan sisa pestisida yang

mungkin pernah ditambahkan atau mengkontaminasi pada bahan simplisia yang dibuat menjadi ekstrak

➢ tujuan: memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak

mengandung pestisida melebihi batas yang ditetapkan

➢ METODE I : metode analisis multiresidu pestisida organoklor (DDT) dan organofosfat (diazinon) → kadar < 5g/kg sampel

➢ Metode: GC-MS atau GC-FID

➢ METODE II : dengan KLT menggunakan fase diam alumina dan deteksi fotokimiawi

➢ Fase diam : Aluminium oksida (AL

₂

O

₃

) netral atau lempeng KLT alumina dengan ketebalan 0,25 cm

➢ Fase gerak :

▪ Pestisida organoklor = campuran aseton : n – heptana (2:98 v/v)

▪ Pestisida organofosfat = metilsikloheksana

➢ Pereaksi semprot :

▪ Pestisida organoklor : pereaksi kromogenik ( 0,1 gram AgNO3 dalam 1 ml air, ditambah 20 ml 2-fenoksietanol dan encerkan dengan aseton ad 200 ml, campur tambahkan 1 tetes H2O2 30%. Simpan ditmepat gelap semalam kemudian

dienaptuangkan kedalam botol penyemprot

▪ Pestisida organofosfat : pereaksi kromogenik a. 1 g tetrabromo-fenolftalein etil ester dalam 100 ml aseton.

Encerkan 10 ml larutan ini dengan aseton ad 50 ml

▪ Larutan perak nitrat : Larutkan 0,5 gram AgNO3 dalam 25 ml air dan encerkan dengan aseton ad 100 ml

▪ Larutan asam sitrat : 5 gram sitrat granil dalam 50 ml air dan

encerkan dengan aseton ad 100 ml

➢ Pemaparan

▪ Pestisida organoklor : dengan UV dan baku pembanding terlihat jelas setelah 15-20 menit

▪ Pestisida organofosfat : bercak biru muda atau

ungu diatas dasar kuning

TERIMAKASIH