Semoga keselamatan dan rahmad Alloh serta keberkahan Nya terlimpah kepada kalian. Dengan menyebut nama Alloh yang Maha pengasih lagi Maha Penyayang

(1)

Semoga keselamatan dan rahmad Alloh serta keberkahan Nya terlimpah kepada kalian

Dengan menyebut nama Alloh yang Maha pengasih lagi Maha Penyayang

(2)

info@uhamka.ac.i

www.uhamka.ac.id (021)73944451 uhamkaid Uhamk @UhamkaI

METODE UJI PARAMETER NON SPESIFIK

TIM DOSEN STANDARISASI DAN PENENTUAN MARKER OBA 2021

TATAP MUKA 4 - 5

(3)

Tujuan Pembelajaran

Mahasiswa mampu menjelaskan metode uji parameter non spesifik yang meliputi

1. Kadar air, bobot jenis, susut pengeringan, sisa pelarut dan kadar abu

2. Cemaran mikroba, cemaran logam berat, cemaran residu pestisida

(4)

info@uhamka.ac.i

Parameter Non Spesifik

 Adalah semua aspek yang tidak terkait dengan aktifitas

farmakologi secara langsung namun mempengaruhi aspek keamanan dan stabilitas ekstrak serta sediaan yang

dihasilkan

 Standarisasi dan analisis aspek nonspesifik diarahkan pada batas maskimal yang diperkenankan terhadap material

berbahaya yang ada di dalam ekstrak

(5)

Parameter Non Spesifik

Meliputi :

1. Penetapan Kadar Air

2. Penetapan Susut Pengeringan 3. Penentuan Bobot jenis

4. Penetapan Sisa Pelarut 5. Penetapan Kadar Abu

6. Penetapan Cemaran Mikroba

7. Penetapan Cemaran Logam Berat 8. Penetapan Residu Pestisida

(6)

info@uhamka.ac.i

1. Penetapan Kadar air

 Tujuan : menetapkan residu air setelah proses pengentalan atau pengeringan

 Pengukuran kadar air ditentukan dengan metode:

1. Titrasi (langsung dan tidak langsung), pereaksi yg digunakan adalah Karl-Fischer

2. Destilasi, pereaksi yang digunakan adalah toluen

3. Gravimetri (tidak sesuai untuk ekstrak dgn kandungan minyak atsiri tinggi)

(7)

Penetapan Kadar air (lanjutan)

Titrasi langsung Titrasi tidak langsung

±20 ml methanol (dalam labu titrasi)

 dititrasi dengan Karl Fischer s/d TAT

 masukan (dgn cepat) zat

(mengandung ±10-50 mg air)  aduk 1 ment  titrasi dgn Karl Fischer yg telah diketahui kesetaraan airnya

±20 ml methanol (dalam labu titrasi)  dititrasi dengan Karl Fischer s/d TAT  masukan (dgn cepat) zat (mengandung

±10-50 mg air)  aduk 1 ment  tambahkan Karl Fischer berlebih yg diukur seksama  titrasi dgn baku air- metanol

(8)

info@uhamka.ac.i

• Destilasi

Penetapan Kadar air (lanjutan)

Sumber gambar: Depkes RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan, Jakarta

(9)

2. Penetapan Susut Pengeringan

Cara: timbang botol dangkal bertutup dalam kondisi kosong dipanaskan 105 °C

selama 30 menit, dinginkan, tara  masukan 1-2 g ekstrak, ratakan  masukan ke dalam oven, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105 °C selama 30 menit  dlm keadaan tertutup dinginkan dlm eksikator hingga suhu kamar, timbang.

Catatan:

 Sebelum tiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator

 Jika sulit kering dan mencair pada pemanasan, tambahkan 1 g silika yg telah

ditimbang seksama (sblmnyaa silika dikeringkan dan disimpan duku dalam eksikator sampai suhu kamar)  campuran ekstrak+silika dipanaskan lagi pada suhu tersebut damapi bobot tetap

 Lakukan hingga bobot tetap: perbedaan 2x penimbagan berturut-turut setelah

(10)

info@uhamka.ac.i

3. Penentuan Bobot jenis

Prosedur:

Piknometer (dlm kondisi bersih, kering dan telah dikalibrasi), ditimbang  Ekstrak cair (suhu ±20 °C) dimasukan ke dalam piknometer  atur suhu

piknometer + ekstrak hingga suhu ±25 °C, tutup  buang kelebihan ekstrak cair  piknometer + ekstrak ditimbang.

Lakukan hal yg sama terhadap air.

Cara hitung:

BJ = pikno + ekstrak/pikno+air x BJ air

Sumber gambar: google image

(11)

4. Penetapan Sisa Pelarut

 Tujuan : menetapkan kandungan sisa pelarut tertentu setelah pengeringan

 Metode: destilasi (penetapan kadar etanol), atau metode lain seperti: Kromatografi gas-cair (kolom kaca berisi S3; gas

pembawa = Nitrogen/Helium; detektor = FID)

 Nilai: maksimal yg diperbolehkan, namun jika pelarut tsb berbahaya (co: kloroform) maka nilainya harus negatif

(12)

info@uhamka.ac.i

5. Penetapan Kadar Abu

 Tujuan : memberikan gambaran kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya

ekstrak

 Kadar abu dinyatakan dalam % (b/b)

 Prosedur :

Penetapan kadar abu total,

penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam

Penetapan kadar abu larut asam

Sumber gambar: google image

(13)

5. Penetapan Kadar Abu (lanjutan)

 Penetapan kadar abu total

Pijar dan tara krus silikat  2-3 g ekstrak (telah digerus) dimasukan ke dlm krus silikat, ratakan  pijar perlahan suhu 500-600°C hingga arang habis (jadi abu putih), dinginkan dlm desikator, timbang.

Catatan:

Jika arang tidak hilang: tambahkan air panas 2 ml  saring dgn

kertas saring bebas abu  filtrat masukan Kembali dlm krus, uapkan dgn waterbath, pijarkan kembali bersama kertas tersebut dalam krus yg sama hingga bobot tetap, timbang.

(14)

info@uhamka.ac.i

5. Penetapan Kadar Abu (lanjutan)

 Kadar abu larut dalam air

 Abu yang diperoleh dari kadar abu total, didihkan dengan 25 ml aquades (tutup dgn kaca arloji) selama 5 menit

 Kumpulkan bagian yang tidak larut dalam air, saring dengan kertas saring bebas abu

 Bilas dengan dgn air panas, pijarkan bahan yg larut air dalam krus di dalam oven pada suhu >450 °C selama 15 menit hingga bobot tetap, dinginka dlm desikator 30 menit dan ditimbang

 Hitung kadar abu yang tidak larut asam terhadap bahan yang telah dikeringkan

(15)

Kadar abu tidak larut dalam asam

Tujuan: ukur keberadaan cemaran silika dari pasir/tanah

 Abu yang diperoleh dari kadar abu total, didihkan dengan 25 ml H₂SO₄ / HCl encer P (tutup dgn kaca arloji) selama 5 menit

 Kumpulkan bagian yang tidak larut dalam asam, saring dengan kertas saring bebas abu

 Cuci dgn air panas, pijarkan kertas saring yang mengandung bahan yg tidak larut asam dalam krus di atas hotplate hingga bobot tetap, dinginka dlm

desikator 30 menit dan ditimbang

 Hitung kadar abu yang tidak larut asam terhadap bahan yang telah dikeringkan

5. Penetapan Kadar Abu (lanjutan)

(16)

info@uhamka.ac.i

TUGAS

1. a. Apa perbedaan penetapan kadar air dan susut pengeringan b. Sebutkan dan jelaskan cara-cara penetapan kadar air

2. a. Sebutkan alat untuk mengukur bobot jenis

b. Jelaskan tahapan kerja menetapakan bobot jenis 3. a. Apa tujuan ditetapkan kadar abu?

b. Penetapan kadar abu ada 2 yaitu kadar abu larut air dan kadar abu larut asam, jelaskan perbedaannya

(17)

6. Penetapan Cemaran Mikroba

 Definisi: menentukan adanya mikroba patogen secara analisis mikrobiologi

 Tujuan: memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak boleh

mengandung mikroba patogen dan non patogen melebihi batas yang ditetapkan  akan berpengaruh pd stabilitas ekstrak dan berbahaya bagi kesehatan

(18)

info@uhamka.ac.i

 Mikroba patogen : Salmonella thypi, E. Coli, Bacillus subtilis, Aspergillus flavus, S.aureus

 Batasan cemaran mikroba:

a) ALT : < 10⁴kol/g

b) Angka kapang /kamir : < 10³ kol/g c) MPN coliform : < 3 kol/g

d) Mikroba patogen : negatif

 Prosedurnya :

1. Uji Angka Lempeng Total

2. Uji Nilai Duga Terdekat (MPN) Coiliform

(19)

Sterilisasi Ekstrak

1. Merendam semua ekstrak ke dalam etanol 70% semalam kemudian diuapkan dengan tangas air stainless

2. Semua ekstrak disterilkan dengan sinar UV - 18 jam

(20)

info@uhamka.ac.i

Penetapan Angka Lempeng Total (ALT)

 Prinsip: pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasikan pada media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai.

 Media : Plate Count Agar (PCA)

 Pereaksi : Pepton dilution Fluid (PDF), Fluid Casein Digest Soy

Lecithin Polysorbat (FCDSLP), minyak mineral (parafin cair), tween 80 dan 20

(21)

 Prosedur : Monografi ekstrak tumbuhan obat Indonesia, 2006 hal 219

 Penghitungan : dipilih cawan petri yang menunjukkan jumlah koloni 30 - 300. Jumlah koloni dihitung kemudian dirata-rata dan dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil

dinyatakan dengan ALT dalam tiap gram.

(22)

info@uhamka.ac.i

Prosedur ALT

Sumber gambar : google image

(23)

Uji Nilai Dugaan Terdekat (MPN) Coliform

Prinsip: melihat adanya pertumbuhan bakteri coliform setelah cuplikan diinokulasi pada media yang sesuai.

 Adanya reaksi fermentasi dan pembentukan gas di dalam tabung durham menandakan adanya bakteri coliform

 Media dan Pereaksi : PDF, MCB/LB, BGLB, EMBA, VRBA, MR-VP, Trypton Broth, Simmon’s Citrate Agar, Nutrient agar

(24)

info@uhamka.ac.i

 Ada 3 tahap :

1. Uji Prakiraan / Presumtive Test  memakai media Mac Conkey Broth (MCB) atau Lactosa Broth (LB) dalam tabung reaksi yg didalam nya ada tb durham  inokulasi sample dan inkubasi 24 - 48 jam pd suhu 37^oC  yg positif lanjut ke uji konfirmasi

2. Uji Konfirmasi  memakai media BGLB dalam tabung reaksi yg

didalam nya ada tb durham  inokulasi sample dan inkubasi 24 - 48 jam pd suhu 37^oC  jumlah tabung yg positif dirujuk dalam tabel MPN (Tabel MPN menyatakan jumlah bakteri coliform dalam tiap gram

contoh yg diuji

3. Uji lengkap dengan media selektif

Uji Nilai Dugaan Terdekat (MPN) Coliform

(25)

3 tahap uji MPN (Most Probable Number)

Presumptive Test pada media LB

Confirmed Test pada media BGLB

Complete Test pada media selektif

(26)

info@uhamka.ac.i

• Dari sample dipipetkan ke tabung reaksi yg

berisi media & tb durham

• Inkubasi pada suhu 37C selama 24 – 48 jam

(27)

• Tabel MPN

Jika semua tabung

positif (3 3 3) maka nilai MPN > 2400

(28)

info@uhamka.ac.i

Penetapan Angka Kapang dan Khamir

 Prinsip: menentukan adanya jamur secara mikrobiologis

 Tujuan: memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak mengandung cemaran jamur melebihi batas yang ditetapkan

 Media : Potato Dextrosa agar (PDA), Czapek Dox Agar (CDA) atau malt agar, air suling agar 0,05% (ASA)

(29)

• Prosedur : Monografi ekstrak tumbuhan obat Indonesia, 2006 hal 222

• Penghitungan : jika pada pengenceran 10^-4terdapat sebanyak 40 koloni, maka nilai AKK adalah 40 x 10^-4= 40.10^-4koloni per gram

(30)

info@uhamka.ac.i

Penetapan Keberadaan Aspergillus flavus

• Aspergillus flavus adalah jamur penghasil metabolit aflatoksin (bersifat hepatotoksik)

• Media: Potato Dekstrosa Agar (PDA), Czapex Dox Agar (CDA), dan Air suling agar (ASA)

• Inkubasi: 5-7 hari pada suhu ruang.

• Keberadaannya ditandai dengan koloni berwarna hijau kekuningan sangat cerah

(31)

Penetapan Cemaran Aflatoksin

 Prinsip : pemisahan isolat aflatoksin secara KLT

 Metode: KLT (kualitatif)

 fase diam = silika gel

 Fase gerak = kloroform : aseton : heksana (85:15:20)

 pembanding: aflatoksin B1, B2, dan G1, G2

 deteksi: sinar UV 366 bercak berwarna biru/hijau kebiruan

 jika positif (secara kualitatif), maka dapat ditetapkan kadarnya dengan metode KLT-densitometer atau HPLC

(32)

info@uhamka.ac.i

Hasil Reaksi IMVIC Bakteri E.coli

I INDOL

M METIL- MERAH

V VOGES PROSKAUER

C

CITRAT BAKTERI

+ + - - E. Coli tipikal

- + - - E. Coli atipikal

+ + - + Intermediat tipikal

- + - + Intermediat atipikal

- - + + E. aerogenes tipikal

+ - + + E. aerogenes

atipikal

(33)

Uji Salmonella sp

 Pada TSIA (triple Sugar Iron Agar) : warna merah pada permukaan agar, warna kuning pada dasar tabung dengan atau tanpa pembentukan hidrogen sulfida

 Pada LIA (lysine Iron Agar) : terlihat warna ungu, bila permukaan berwarna ungu sedangkan bagian dasar warna kuning, dianggap negatif

 Uji serologi : terjadi aglutinasi

Media TSIA

(34)

info@uhamka.ac.i

7. Penetapan Kadar Cemaran Logam Berat

 Prinsip: menentukan kandungan logam berat dg SSA (Spektrofotometri Serapan Atom)

 Kadar logam berat dalam sisa abu total meliputi Pb, Cd, Hg, As, dsb.

 Penetapan kadar dengan menggunakan digesti basah sistem terbuka

(35)

Penetapan kadar dengan menggunakan digesti basah sistem terbuka

1. Timbang 200-250 mg simplisia yang dikering anginkan, masukkan ke dalam krus silika. Tambahkan 1,0 ml campuran digesti ( 2 bagian asam nitrat

(1000g/L) dan 1 bagian asam perkolat (1170 g/L) )

2. Tutup krus silika tanpa menggunakan tekanandan masukkan kedalam tanur yang mempunyai pengatur suhu dan waktu

3. Panaskan perlahan lahan hingga 102^o C selama 2 jam

4. Naikkan suhu pelan-pelan hingga 240^o C, pertahankan selam 4 jam 5. Larutkan residu inorganik dalam 2,5 ml asam nitrat (1000 g/L) LP dan

gunakan untuk uji penetapan kadar logam berat.

6. Bandingkan dengan larutan blanko

7. Penetapan kadar dengan spektrofotometri serapan atom (AAS)

(36)

info@uhamka.ac.i

8. Penetapan Cemaran Residu Pestisida

 Prinsip: menentukan kandungan sisa pestisida yang mungkin pernah ditambahkan atau mengkontaminasi pada bahan simplisia yang dibuat menjadi ekstrak

 Tujuan: memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak mengandung pestisida melebihi batas yang ditetapkan

 METODE I : metode analisis multiresidu pestisida organoklor (DDT) dan organofosfat (diazinon)  kadar < 5g/kg sampel

 Metode: GC-MS atau GC-FID

(37)

 METODE II : dengan KLT menggunakan fase diam alumina dan deteksi fotokimiawi

 Fase diam : Aluminium oksida (AL₂O₃) netral atau lempeng KLT alumina dengan ketebalan 0,25 cm

 Fase gerak :

 Pestisida organoklor = campuran aseton : n –heptana (2:98 v/v)

 Pestisida organofosfat = metilsikloheksana

(38)

info@uhamka.ac.i

 Pereaksi semprot :

 Pestisida organoklor : pereaksi kromogenik ( 0,1 gram AgNO3 dalam 1 ml air, ditambah 20 ml 2-fenoksietanol dan encerkan dengan aseton ad 200 ml, campur tambahkan 1 tetes H2O2 30%. Simpan ditmepat gelap semalam kemudian dienaptuangkan kedalam botol penyemprot

 Pestisida organofosfat : pereaksi kromogenik a. 1 g tetrabromo-

fenolftalein etil ester dalam 100 ml aseton. Encerkan 10 ml larutan ini dengan aseton ad 50 ml

 Larutan perak nitrat : Larutkan 0,5 gram AgNO3 dalam 25 ml air dan encerkan dengan aseton ad 100 ml

 Larutan asam sitrat : 5 gram sitrat granil dalam 50 ml air dan encerkan dengan aseton ad 100 ml

(39)

 Pemaparan

 Pestisida organoklor : dengan UV dan baku pembanding terlihat jelas setelah 15-20 menit

 Pestisida organofosfat : bercak biru muda atau ungu diatas dasar kuning

(40)

info@uhamka.ac.i

TUGAS

1. Sebutkan prinsip dan metode dari penetapan cemaran mikroba berikut ini :

a. ALT b. AKK c. MPN d. ImVIC

2. Mengapa cemaran residu pestisida perlu ditetapkan dan sebutkan metode penetapannya

(41)

Segala puji bagi Alloh Tuhan semesta alam