Semoga keselamatan dan rahmad Alloh serta keberkahan Nya terlimpah kepada kalian. Dengan menyebut nama Alloh yang Maha pengasih lagi Maha Penyayang

Semoga keselamatan dan rahmad Alloh serta keberkahan Nya terlimpah kepada kalian

Dengan menyebut nama Alloh yang Maha pengasih lagi Maha Penyayang

METODE PENENTUAN SENYAWA MARKER

PRODUK BAHAN ALAM

TIM DOSEN FARMASI UHAMKA 2021

Tujuan Pembelajaran

Mahasiswa mampu menjelaskan :

1. Prinsip penggunaan instrumen dalam analisis marker Obat Bahan Alam

2. Prinsip penggunaan instrumen analisis marker Obat Bahan Alam

3. Aplikasi metabolomik dan metabonomik

Ayat Al Quran

Pendahuluan

 Identifikasi dan uji kualitas bahan baku tanaman merupakan syarat penting yang harus dilakukan oleh industri herbal

 Tanaman yang akan digunakan sebagai bahan baku sering memiliki komposisi yang tidak konsisten

 Kontrol kualitas obat herbal, dapat dilakukan dengan

mengidentifikasi senyawa spesifik yang biasa disebut senyawa marker yang dapat digunakan untuk membantu pembuatan

produk yang konsisten

 Berbagai instrumen analisis bisa dimanfaatkan untuk mendeteksi senyawa tersebut

KENAPA PENTING?

• senyawa marker harus dapat terdeteksi  kadarnya dapat ditentukan

BASIS DETEKTOR

ELEKTRIK VISIBLE

DAN UV

- DENSITOMETER

- SPEKTROFOTOMETER - HPLC

- GC

Kriteria Instrumen untuk penetapan kadar marker:

 terjangkau oleh stakeholder (produsen, eksportir, importir, agen, supplier)

 mudah digunakan

 tervalidasi aspek spesivitas dan sensitivitas

 minimal HPTLC atau KLT-densitometer

APLIKASI KLT/TLC DALAM MENENTUKAN KADAR

MARKER PADA EKSTRAK

1. KLT

• Senyawa yg cocok dideteksi dgn UV (254 dan 366 nm)  fenolik,

fenilpropanoid, sebagian alkaloid

(punya ikatan rangkap terkonjugasi)

• Senyawa dgn gugus kromofor akan redam/padam/berwarna gelap pd UV 254 (kecuali kumarin dari pasak bumi justru berpendar).

• Pd UV 366 senyawa akan

berpendar dgn berbagai warna.

bercak meredam/gelap

bercak berpendar UV 254 nm

UV 366 nm

KLT (lanjutan)

• jika senyawa marker tdk muncul dikedua jenis sinar  bkn berarti tdk ada (reaksi negatif palsu)  lakukan derivatisasi

• biasanya yg tdk tampak pd kedua jenis sinar adalah senyawa turunan terpen atau senyawa2 dgn ikatan rangkap yg sedikit.

• deteksi senyawa turunan terpen (MA, saponin, steroid) biasanya dgn vanilin atau anisaldehida dgn asam sulfat dan pemanasan 106C  senyawa membentuk kompleks warna pada sinar

tampak (visible)

YG DIPERHATIKAN DLM MENENTUKAN KADAR MARKER

 Pastikan senyawa target (markernya) berhasil terpisah dari

campurannya  puncak tunggal dgn btk simetris  murni  dpt ditentukan kadarnya

 Jika puncak masih bertumpuk tambahkan basa (utk alkaloid)

/asam (utk turunan fenolik) lemah atau ganti sistem fase gerak  pd KLT/HPLC

 Kurva baku yg dibuat hrs tepat dan dpt terulang. Koef korelasi sebaiknya minimal 0,997.

 Range seri kadar yg sempit (0,5; 1; 1,5; 2 dan 2,5 mg/ml)  kurva jelek, sdgkn seri kadar yg cukup jauh (0,5; 1; 2; 4; 8 mg/ml) 

kurva baik karena sensitivitas tdk terganggu

2. TLC SCANNER/ DENSITOMETRI

 Prinsip: berdasarkan interaksi elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT

 Tujuan: digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.

 Analisis kualitatif dgn KLT-Densitometri pada

prinsipnya mengacu kepada nilai Rf (Retardation factor) atau Faktor retardasi yaitu : membanding- kan Rf analit dengan Rf baku pembanding atau membandingkan bercak kromatogram sample dengan kromatogram "Reference Standart" yang dikenal dengan : Factro Retensi Relatif (Rx)

 Untuk penentuan kualitatif dgn Rs harus dilakukan bersamaan dgn sample pada pelat yang sama.

Contoh aplikasi KLT dalam penentuan marker

Sistem KLT fingerprints Sampel: Cassia fistula

Fase diam : precoated aluminium plate silica gel 60F254 (10 × 20 cm) Fase gerak : ethyl acetate: methanol: water (100: 17: 13)

Reagen : semprot dgn larutan 10% alcoholic potassium hydroxide Deteksi : Anthraquinones ditunjukan dgn bercak pink.

Standar : Rhein (glikosida antrakuinon)

Sakulpanich & Gritsanapan, 2009. Determination of Anthraquinone Glycoside Content in Cassia

fistula Leaf Extracts for Alternative Source of Laxative Drug

Contoh aplikasi KLT-Densitometri dalam penentuan marker

Hikmawanti et al.,, 2016

Sistem Pengujian

Sampel: Ekstrak lada Standar: Piperin

Volume penotolan: 5 µl

Fase diam: plat KLT silika gel 60 F₂₅₄. Fase gerak: n-heksana-etil asetat (1:1), Densitometer: UV 254 nm.

3. APLIKASI HPTLC DALAM MENENTUKAN

KADAR MARKER PADA EKSTRAK

TLC atau

HPTLC?

Contoh aplikasi HPTLC dalam penentuan marker

Mukherjee 2019. Quality Control and Evaluation of Herbal Drugs

 Utk penentuan kdr marker yg tdk bsa/sulit ditetapkan dgn KLT-

densitometer krna alasan reproduksibilitas yg tdk baik dan puncak serapan yg bertumpuk jika pakai KLT-densitometer

 Teknik ini lebih rumit jika sampel berupa ekstrak dan jika kadar senyawa marker dlm ekstrak terlalu rendah/kecil

 Umumnya sistem fase terbalik: Fase diam (non polar: kolom C-18), fase geraknya (polar: campuran air, metanol, asetonitril dgn buffer asam formiat; TFA, asam fosfat, dll)

 Utk analisis ekstrak umumnya yg digunakan dlm sistem fase gerak adalah sistem gradien bukan isokratik (kecuali ada pustaka

pendukung).

4. APLIKASI HPLC DALAM MENENTUKAN

KADAR MARKER PADA EKSTRAK

 Jika puncak tidak simetris  belum terpisah sempurna/optimal

 Puncak terlalu lebar kemungkinan ada cemaran bbrpa senyawa

 optimasi fase gerak  caranya dgn teknik gradien

 Puncak yg simetris memudahkan dalam mengkuantifikasi kadar senyawa marker

Contoh kromatogram HPLC

Prajogo, 2015

WAKTU RETENSI

Pemisahan berdasarkan waktu retensi Kuantitas berdasarkan luas area

Prajogo et al, 2015

Sampel: Ekstrak kunyit (dalam asetonitril)

Standar: Curcumin, desmethoxycurcumin, and bisdesmethoxycurcumin (dalam asetonitril)

Sistem HPLC

Fase diam: Alltect Alltima C18 column (150 × 4.6 mm i.d.; 5 μm

Fase gerak: isocratic system with a flow rate of 2.0 mL/min, a column temperature of 33°C, a mobile phase of acetonitrile and 2% acetic acid (40:60, v/v) Volume injeksi: 20 µL

Detektor: UV-VIS (425 nm) Waktu pemisahan: 16 menit

Wichitnithad et al., 2009. A Simple Isocratic HPLC Method for the Simultaneous

Determination of Curcuminoids in Commercial Turmeric Extracts, Phytochemical analysis.

Contoh aplikasi HPLC dalam

penentuan marker

 Utk penetapan senyawa marker yg bersifat volatil

 kelebihan: resolusi tinggi (hasil

pemisahan baik), reproduksibilitas (keterulangan) baik, dan

sensitivitas baik

 detektor elektrik: flame ionization detector (FID), mass spectrometer (MS)

5. APLIKASI GC-MS DALAM MENENTUKAN

KADAR MARKER PADA EKSTRAK

KROMATOGRAM GC-MS KOMPONEN MINYAK ATSIRI DAUN KEMANGI (Hikmawanti et al, 2017)

WAKTU RETENSI

KELIMPAHAN

spektra sampel

spektra pustaka spektra MS senyawa pd sampel dgn waktu retensi = 47,128 menit BM

Contoh pola Fragmentation dari metil eugenol

6. LC-MS

 Kromatografi cair-spektrometri massa (Liquid chromatography- mass spectrometry atau LC-MS) adalah instrumen yang

menggabungkan pemisahan fisik menggunakan kromatografi cair dan deteksi massa molekul denganspektrometri massa.

 Keunggulan: spesifisitas dan sensitivitas pengukuran yang

dihasilkan sangat tinggi dibandingkan teknik kimia analis lainnya.

Selain itu, bila dibandingkan GC dan HPLC, teknik ini memiliki

kapasitas yang lebih besar untuk menganalisa sampel yang lebih banyak dalam sekali waktu

Contoh aplikasi LC-MS dalam penentuan kadar marker

 Fase diam: Waters XBridge TM C18 column (150 mm× 2.1 mm i.d., 3.5 m) and a thermostat column compartment (column oven temperature was set at 30 ◦C)

 Fase gerak: acetonitrile (A) dan 0.1% acetic acid solution (B),

 Laju alir: 0.25 mL min−1 (0–2 min, 30:70; 2–10 min, 95:5; 10–15 min, 30:70).

 Detektor: Turbo Ion Spray interface of a triple quadrupole mass spectrometer, laju alir 5 L min^-1  positive ion mode pada 500 °C

Shen et al., 2013. Simultaneous determination of three Curcuminoids in Curcuma wenyujin Y.H.chen et C.Ling. by liquid

7. Spektrometer UV-Vis

 Spektrofotometer UV-Vis adalah

pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel.

 Prinsip: Larutan sampel dikenai radiasi elektromagnetik, sehingga menyerap energi / radiasi terjadi interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan materi atom/molekul) Jumlah intensitas radiasi yang diserap oleh larutan sampel

dikonversi dengan konsentrasi analit data kuantitatif

Spektrometer UV-Vis

 Senyawa tertentu akan memberikan serapan yang khas pada panjang gelombang yang tertentu pula sehingga instrumen ini bisa digunakan untuk membantu dalam analisa senyawa pada suatu bahan

 pita serapan tunggal antara 250-260 nm, kemungkinan adalah

senyawa: fenol sederhana, purin atau pirimidina, suatu asam amino aromatik.

 Senyawa dengan tiga puncak yang jelas di daerah 400-500 nm

dengan sedikit serapan di daerah lain kemungkinan adalah senyawa : karotenoid.

 Inti piridin pada senyawa alkaloid memberikan serapan yang khas pada daerah 230-300 nm

Pita serapan senyawa

flavonoid

Markham KR. 1988. Techniques of Flavonoid Identification.

London: Academic Pr.

Serapan UV beberapa senyawa alkaloid

No ALKALOID Di bawah UV Penampak bercak

yang dianjurkan

Spektrum Max dalam H2SO4 0,1 M

1 Sitisina Biru Dragendorf 303

2 Nikotina Menyerap 260

3 Tomatina Tak tampak Iodoplatinat -

4 Morfina Menyerap 284

5 Solanina Tak tampak marquis -

6 Kodeina Menyerap 284

7 Berberina Fluoresensi kuning 228

8 Strikina 254

9 Tebaina Menyerap iodoplatinat 284

10 Atropina 258

11 Kuinina Biru terang 250

12 Koniina Tak tampak 268

8. Spektrometer IR

• Pada instrumen ini akan dideteksi banyaknya

frekuensi yang dilewatkan oleh sampel yang dihitung sebagai persen

transmitan.

Spektrum IR sangat berguna untuk mengidentifikasi suatu senyawa dgn memban- dingkannya dengan spektrum senyawa standar terutama pada daerah sidik jari Spektrum inframerah suatu senyawa memberikan gambaran mengenai gugus fungsional dalam sebuah molekul organik.

Daftar bilangan gelombang beberapa

jenis ikatan

9. RMI/ NMR

 Spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) memberikan

gambaran mengenai jenis atom, jumlah, maupun lingkungan atom hidrogen (1H NMR) maupun karbon (13C NMR).

 Spektroskopi ini didasarkan pada kenyataan bahwa setiap

kelompok atom dalam molekul organik akan beresonansi pada frekuensi yang tidak identik atau beresonansi pada frekuensi

spesifik. Hal ini disebabkan kelompok atom suatu molekul organik dikelilingi elektron yang berbeda (lingkungan

elektroniknya berbeda).

 Makin besar kerapatan elektron yang mengelilingi inti maka makin besar pula medan magnet yang digunakan.

DATA-DATA PADA NMR

• Data Proton (1H NMR)

• Data Karbon (13C NMR)

• Data COSY

• Data HSQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation)  interaksi antara hidrogen dengan atom karbon miliknya

• Data HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)  interaksi antara hidrogen dengan atom karbon

Dengan semua data-data analisis dengan instrumen ini akan

mengarahkan dalam menyimpulkan jenis senyawa bahkan strukturnya

METABOLOMIK DAN

METABONOMIK

METABOLOMIK DAN METABONOMIK

 Ekstrak kasar  multi compound  multi target (efek sinergisme)

 penentuan kadar senyawa marker/kadar gol metabolit tertentu mengabaikan paradigma tsb

 cth: saponin ginsenosida dlm ginseng jika digunakan dlm bentuk tunggal justru berbahaya (dpt menghemolisis darah) tp jika

ginseng diekstrak dan digunakan dlm pengobatan justru berkhasiat dan aman

 bioassay guided fractionation  penyederhanaan utk dpt senyawa murni  proses rumit, biaya mahal, seringkali khasiatnya lebih

lemah/tdk berkhasiat dibanding ekstrak/perasannya.

 metabolomik (atau metabolite profiling) = analisis total metabolit sekunder (dgn BM 50-5000) secara kualitatif dlm suatu sampel obat herbal dgn karakter tertentu terkait aktivitas.

 metabonomik = metabolomik yg dikembangkan ke arah analisis kuantitatif metabolit sekunder total yg berperan dlm aktivitas

biologis-farmakologis tertentu dlm sampel obat herbal

 keuntungan: preparasi tdk rumit, sampel sangat sedikit (< 0,1 g bahkan cukup dgn 1 mg saja, hasil objektif, dan proses analisis cepat.

INSTRUMEN YANG DIGUNAKAN

- GC-MS - LC-MS

- HPLC-MS

- 1-2 Dimention NMR

Tantangan

 ketersediaan instrumen terbatas

 dgn instrumen sederhana saja sdh dpt dilakukan standarisasi

 produk herbal tanpa standarisasi masih dpt laku

Segala puji bagi Alloh Tuhan semesta alam