III. METODE PENELITIAN
A. Bagan Alir Penelitian
Persiapan alat dan bahan yang akan digunakan
Pengambilan sampel tanah dekat perakaran tanaman Cabai merah (C. annum)
Isolasi jamur Fusarium dari sampel tanah yang telah diambil
Identifikasi jamurFusariumsp.
Uji sifat patogenikFusariumspp.ke tanaman cabai merah (C. annum)
Pembuatan inokulum jamur Fusariumspp.
Pembuatan media PDA (Potato Dextrose Agar)
Penanaman tanaman Cabai merah (C. annum) dengan menggunakan tanah dan
pupuk kandang
InokulasiFusarium spp. ke media tanam Cabai merah (C. annum)
Pengamatan respon tanaman
B. Lokasi dan Waktu Penelitian
Pengambilan sampel dilakukan di wilayah pertanian Cabai merah Desa Kebanggan, Kecamatan Sumbang, Kabupaten Banyumas yang terdiri dari tiga lokasi pengambilan sampel. Pelaksanaan penelitian melalui dua tahap, yakni identifikasi Fusarium dan uji karakter patogenisitas Fusarium yang dilakukan di Laboratorium Mikologi dan Fitopatologi serta Green House Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni-Desember 2014.
C. Teknik Pengambilan Sampel
Penelitian ini akan menggunakan metode survey. Teknik pengambilan sampel dilakukan secara simple random sampling (sampel acak sederhana). Dimana sampel yang diambil berasal dari tiga lahan terpisah di desa Kebanggan.
D. Parameter Penelitian
Parameter yang akan diukur dalam penelitian ini meliputi tipe pertumbuhan koloni, diameter koloni, warna koloni, mikrokonidia, makrokonidia, konidiofor, dan sifat patogenik serta non-patogenik dari Fusariumspp.terhadap tanaman cabai merah (C. annum).
E. Cara Kerja
1. Isolasi dan Identifikasi JamurFusarium
1.1 Pembuatan media PDA (Potato Dextrose Agar) (Fardiaz, 1993)
- Sebanyak 200 gr kentang dikupas, dicuci bersih kemudian dipotong dadu kecil-kecil.
- Potongan kentang direbus dalam 500 ml aquades sampai lunak.
- Agar-agar 15 gr dicampur dengan 250 ml akuades, didihkan kemudian dicampur dengan air rebusan kentang ditambah 20 gr dextrose.
- Campuran media ditambah dengan akuades hingga mencapai 1000 ml. - Media dimasukkan kedalam Erlenmeyer 250 ml dan tutup dengan kapas. - Disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121o C dengan tekanan 2
atm selama 15 menit.
1.2 Pengambilan sampel tanah dari rhizosfer tanaman Cabai merah (C.
annum) di Desa Kebanggan, Kecamatan Sumbang, Kabupaten
Banyumas.
Pengambilan sampel dilakukan secara simple random sampling. Sampel tanah diambil dari 3 lokasi. Setiap lokasi, sampel tanah diambil 5 titik secara diagonal. Setiap titik pengambilan sampel tanah dipilih dari tanaman cabai merah yang menunjukkan gejala sakit dan tanaman cabai merah sehat, sehingga didapat 10 sampel tanah yang diambil dalam satu lokasi.
1.3 Isolasi jamur Fusarium dari sampel rizosfer yang telah diambil
(Kristiana, 2012)
Isolasi jamur Fusarium dilakukan dengan metode pengenceran bertingkat didalam LAF, dengan tahapan sebagai berikut:
- Tanah sebanyak 10 gr dari masing-masing titik dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 90 ml aquades steril.
- Suspensi tersebut dihomogenkan selama 15 menit.
- Suspensi yang telah homogen diambil sebanyak 1 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml aquades steril dan dibuat pengenceran bertingkat hingga 10-5.
- Hasil pengenceran diinokulasi kedalam media PDA dengan wadah cawan petri berdiameter 10 cm dan volume 15 ml yang telah diberi antibiotik kloramfenikol dan menggunakan cara spread plate sebanyak 3-5 tetes. - Biakan selanjutnya diinkubasi selama tiga hari.
1.4 Peremajaan jamurFusariumsetelah diisolasi (Kristiana, 2012)
- Biakan hasil isolasi diambil miseliumnya dengan menggunakan jarum ose yang dilakukan dalam LAF.
- Isolat dipindahkan ke cawan petri yang berisi media PDA baru.
- Diinkubasi selama 3 hari, perlakuan yang sama diulang hingga mendapatkan biakan murni.
1.5 Identifikasi jamurFusariumhasil isolasi
Identifikasi dilakukan secara mikroskopis dan makroskopis dengan berpedoman dari sumber pustaka menurut Barnett and Hunter (1998) dan Ganjdar et,al., (1999).
a) Pengamatan makroskopis
-Jamur yang sudah tumbuh pada media PDA didalam cawan petri diamati. Pengamatan meliputi tipe pertumbuhan koloni, diameter koloni dan warna koloni.
-Hasil dicatat dan difoto. b) Pengamatan mikroskopis
-Isolat jamur Fusarium spp. yang telah murni diambil menggunakan jarum ose dan diletakkan ke object glass dengan ditetesi aquades sebanyak 1 tetes kemudian tutup dengan cover glass.
-Isolat yang berada diatas object glass diletakkan dibawah mikroskop.
-Konidia (mikrokonidia dan makrokonidia) diamati bentuknya dan diukur panjangnya.
-Bentuk konidiofor diamati dan dilihat perbedaannya.
-Hasil dicatat dan difoto.
2. Uji sifat patogenik
2.1 Pembuatan inokulumFusarium spp(Sutrisni dan Widodo, 2012).
2.1.1 Peremajaan isolatFusariumspp.
- Isolat Fusarium yang telah diidentifikasi dipindah pada media PDA baru dalam cawan petri.
- Isolat diinkubasi pada suhu ruang.
2.1.2 Pembuatan medium tanam Fusarium spp. (Sinaga et. al., 2013
dengan modifikasi).
- Jagung giling sebanyak 700 gr dituang kedalam baskom dan dicampur dengan 290 gr dedak.
- Media jagung giling pada botol disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 100ᵒ-121ᵒC, selama 15 menit dan dengan tekanan 2 atm.
2.1.3 Pembuatan inokulum Fusarium spp. (Sinaga et. al., 2013 dengan
modifikasi).
- Masing-masing isolat Fusarium yang telah diremajakan diambil miseliumnya dengan menggunakan jarum ose di dalam LAF.
- Miselium ditanam pada media jagung giling, kemudian ditutup menggunakan alumunium foil dan wrapper.
- InokulumFusariumyang diinkubasi pada suhu ruang selama 7-14 hari. 2.2 Penanaman tanaman Cabai merah (C. annum) (Baharuddin et. al.,
2005)
2.2.1 Sterilisasi tanah
- Tanah dan pupuk kandang yang akan digunakan sebagai media pesemaian dan media tanam masing-masing dimasukkan ke dalam polybag selanjutnya disterilisasi.
- Sterilisasi dilakukan dengan metode panas lembab menggunakan drum selama 9–10 jam pada suhu 90–100oC.
- Setelah disterilisasi, media tersebut dibiarkan selama kurang lebih 24 jam agar suhu menurun.
2.2.2 Penyemaian bibit tanaman Cabai Merah (C. annum)
- Campuran tanah dan pupuk kandang yang telah disterilkan dimasukkan ke dalam baki persemaian sebanyak 3 Kg berukuran 15 cm x 20 cm.
- Benih cabai merah disemai secara merata.
- Tanaman dipelihara hingga berumur 30 hari.
2.2.3 Pembuatan medium tanam dan inokulasi inokulum Fusarium spp.,
(Sutrisni dan Widodo, 2012)
- Polybag plastik berukuran 20 x 20 cm diisi tanah steril sebanyak 2,5 Kg.
- 5 gram inokulum Fusarium dimasukkan ke polybag yang berisi tanah steril kemudian diaduk rata.
- Campuran tanah dan inokulum Fusarium pada medium jagung yang
2.2.4 Perawatan dan pengamatan respon tanaman Cabai Merah (C.
annuum)
- Tanaman cabai merah di siram 2 kali sehari pada pukul 07.00 dan 17.00 WIB.
- Selama proses perawatan berlangsung, pengamatan respon tanaman juga dilakukan dengan melihat gejala kelayuan pada tanaman yang telah diinokulasiFusariumsp.
- Respon tanaman diamati selama 30 hari.
- Hasil dicatat dan difoto.
F. Metode Analisis
Data hasil pengamatan yang diperoleh dianalisis menggunakan metode analisis deskriptif yang bertujuan untuk mengetahui jenis-jenisFusariumsp. yang ditemukan dan sifat patogenik serta non patogenik jamur Fusarum sp. dari sampel tanah perakaran tanaman cabai merah (C. anuum) di Desa Kebanggan, Kecamatan Sumbang, Kabupaten Banyumas.
