PETUNJUK PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN
Oleh
Ruri Siti Resmisari, M. Si
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG
Daftar Isi
I. Pengenalan Laboratorium II. Sterilisasi alat
III. Pembuatan Media Kultur IV. Sterilisasi Eksplan
V. Inisiasi
I. Pengenalan Laboratorium
A. Pendahuluan
Kultur jaringan dilakukan pada lingkungan yang aseptis dan terkendali, yaitu di laboratorium. Sehingga, pengetahuan mengenai laboratorium kultur jaringan sangat penting bagi orang yang ingin mendalami kultur jaringan, dalam hal ini adalah mahasiswa yang melaksanakan praktikum.
B. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mengenalkan laboratorium kultur jaringan dan alat-alat yang digunakan dalam pelaksanaan kultur jaringan.
C. Alat
1. Laminar air flow cabinet 2. Autoklaf
3. Timbangan analitik 4. pH meter
5. Oven
6. Hot plat and stirer 7. Refrigerator 8. Alat-alat diseksi 9. Glassware
D. Bahan
1. Bahan untuk membuat media
E. Cara Kerja
1. Praktikan dengan tertib masuk ke ruang lab. Kultur jaringan tumbuhan
2. Praktikan diperkenalkan dengan ruangan-ruangan yang ada di lingkungan lab. Kultur jaringan tumbuhan 3. Selain itu, praktikan diperkenalan dengan alat-alat
II. Sterilisasi Alat
A. Pendahuluan
Alat-alat yang dipakai ketika penanaman harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam, gelas dan media tanam disterilkan dengan autoclave.
Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai yang progamable. Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber panas dengan menggunakan kompor gas. Pada autoklaf yang sederhana ini, tekanan dan suhu diatur dengan membesarkan atau mengecilkan sumber api. Kelemahan autoklaf ini adalah perlunya penjagaan dan pengaturan panas secara manual selama masa sterilisasi dilakukan. Keuntungan penggunaan autoklaf ini adalah sederhana pengoperasianya, harganya relatif murah, tidak tergantung pada aliran listrik, dan lebih cepat masak dibandingkan dengan autoklaf listrik.
B. Tujuan
1. Mengetahui alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan
D. Bahan 1. Sabun cuci 2. Aquades
E. Cara Kerja Sterilisasi alat
1. Alat-alat diseksi dan cawan petri dicuci dengan menggunakan sabun cuci kemudian dikeringkan 2. Bungkus alat-alat yang sudah kering tersebut dengan
menggunakan almunium foil
3. Masukkan ke dalam autoklaf selama 15 menit dengan pengaturan tekanan sebesar 17,5 psi dan suhu 121oC
4. Setelah suhu autoklaf dingin, keluarkan alat-alat diseksi dan cawan petri kemudian di simpan di ruang steril
Membuat air steril
1. Botol kultur dicuci dengan menggunakan sabun cuci kemudian dikeringkan
2. Setelah kering, masukkan Aquades sebanyak 100 ml per botol
3. Tutup botol dengan plastik khusus
4. Masukkaan botol yg berisi air tersebut ke dalam autoklaf selama 15 menit dengan pengaturan sebesar 17,5 psi dan suhu 121oC
III. Membuat Media Kultur
A. Pendahuluan
Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media .
Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, macam-macam media kultur jaringan telah ditemukan sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama media tumbuh untuk eksplan ini biasanya sesuai dengan nama penemunya.
Pada umumnya komposisi utama media tanam kultur jaringan, terdiri dari hormon (zat pengatur tumbuh) dan sejumlah unsur yang biasanya terdapat di dalam tanah yang dikelompokkan ke dalam unsur makro, unsur mikro. Hasil yang lebih baik akan dapat kita peroleh bila, kedalam media tersebut, ditambahkan vitamin, asam amino, dan hormon, bahan pemadat media (agar), glukosa dalam bentuk gula maupun sukrosa, air destilata (akuades), dan bahan organik tambahan (Gunawan, 1992).
B. Tujuan
1. Mengetahui jenis-jenis media kultur jaringan tumbuhan
2. Mengetahui cara pembuatan meduia kultur jaringan tumbuhan
1. Gelas piala 1 liter 2. Botol Kultur 3. Plastik 4. Karet
5. Hotplate and stirer 6. pH meter
1. Siapkan alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan dalam proses pembuatan media kultur 2. Timbang media MS sebesar 21,7gr, gula 20gr dan
agar 7gr
3. Larutkan MS, gula dan ZPT ke dalam gelas piala kemudian tambahkan aquades mencapai 1 liter 4. Ukur pH larutan media, atur menggunakan NaOH
dan HCl hingga mencapai pH 5,7 5. Masukkan agar dan didihkan larutan
6. Stelah larutan masak, masukkan ke dalam botol-botol kultur kemudian ditutup dengan plastik
5. Masukkan botol-botol kultur yang berisi larutan media ke dalam autoklaf selama 20 menit dengan
pengaturan tekanan sebesar 17,5 psi dan suhu 121oC
IV. Sterilisisasi Eksplan
A. Pendahuluan
Sterilisasi eksplan yang bebas dari kontaminan merupakan langkah yang sangat penting, karena tanaman yang dari lapang mengandung debu, kotoran-kotoran dan berbagai kontaminan hidup pada permukaannya. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau serta spora-spora. Bila sumber kontaminan ini tidak dihilangkan, maka pada media yang me-ngandung gula, vitamin dan mineral akan ditumbuhi oleh jamur dan bakteri. Apabila eksplan terkontaminasi, maka akan mati oleh persenyawaan beracun yang di produksi dan dikeluarkan oleh bakteri atau jamur.
B. Tujuan
1. Mengetahui bahan-bahan yang digunakan dalam strerilisasi eksplan
D. Bahan
1. Bibit tanaman 2. Aquades 3. Air steril 4. Deterjen
5. Pemutih pakaian (clorox)
E. Cara Kerja
1. Siapkan semua alat dan bahan yang akan digunakan dalam proses sterilisasi eksplan
2. Gunakan gunting untuk mengambil bagian tanaman yang akan dikulturkan, sebaiknya bagian pucuk karena masih muda dan tidak terlalu banyak kontaminasi
3. Masukan potongan eksplan tersebut ke dalam botol kultur yang sudah diisi dengan air bersih
4. Cuci dengan menggunakan deterjen di air mengalir, kemudian masukkan eksplan tersebut ke dalam botol 5. Masukkan eksplan tanaman yang akan dikulturkan ke
dalam larutan fungisida selama 1 jam
6. Eksplan dibawa ke ruang Laminar air flow cabinet 7. Pindahkan eksplan tersebut dari larutan fungisida ke
larutan clorox 30%, 20% dan 10% masing-masing 10 menit
8. Stelah semua proses dilalui, eksplan tersebut dibilas 3 kali dalam air steril
V. Inisiasi Eksplan
A. Pendahuluan
Inisiasi merupakan salah satu aspek dari tumbuh pada tanaman dengan menghasilkan bagian-bagian atau organ baru. Inisiasi adalah tahap pengambilan eksplan dari tanaman induk yangakan diperbanyak secara kultur jaringan. Sebelum melakukan inisiasi sebaiknya terlebih dahulu melakukan sterilisasi. Tujuan utama tahap ini adalah mengusahakan kultur yang aseptic atau aksenik. Aseptik berarti bebas darimikroorganisme, sedangkan aksenik berarti bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan.
B. Tujuan
Mengetahui langkah-langkah penanaman kultur jaringan pada laminar air flow dalam keadaan steril .
C. Alat
1. Media kultur yang sudah disiapkan sebelumnya 2. Eksplan yang sudah disterilisasi
E. Cara Kerja
1. Siapkan semua alat dan bahan yang akan digunakan dalam proses inisiasi eksplan 2. Kemudian nyalakan lampu bunsen.
3. Semprot pinset dengan alkohol 70 % atau celupkan pada alkohol 96 % atau pada spiritus, kemudian bakar di atas lampu bunsen dari pangkal sampai ujung. Lakukan 2 – 3 kali. Langkah ini untuk
memusnahkan spora jamur atau bakteri yang masih menempel pada pinset.
4. Letakkan pinset di atas petridish/botol alkohol. 5. Ambil botol media dan buka.
6. Ambil eksplan dengan pinset dan masukkan langsung ke dalam botol kultur.
7. Tutup rapat dan letakkan disebelah kanan. 8. Agar tekanan dari luar tidak masuk, tutup botol
dapat dilapisi plastik klin wrap.
VI. Multiplikasi (Subkultur)
A. Pendahuluan
Multiplikasi merupakan tahap penumbuhan tunas hasil inisiasi yang dirangsang dengan memotong plantlet dengan media kultur baru. Tahap ini dilakukan dengan metode subkultur yaitu usaha untuk menggantikan media tanaman kultur jaringan dengan media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus dapat terpenuhi.
Subkultur dapat dilakukan beberapa kali sampai jumlah tunas yang dihasilkan sesuai dengan yang kita harapkan. Subkultur yang terlalu banyak dapat menurunkan mutu tunas, seperti terjadinya vitrifikasi (suatu gejala ketidaknormalan fisiologis) dan aberasi (penyimpangan) genetik. Keadaan ini terjadi karena semakin banyak subkultur dilakukan berarti semakin sering tanaman dikondisikan dalam media yang mengandung sitokinin, sehingga daya regenerasinya meningkat.
B. Tujuan
D. Bahan
1. Siapkan semua alat dan bahan yang akan digunakan dalam proses multiplikasi 2. Kemudian nyalakan lampu bunsen.
3. Semprot pinset dengan alkohol 70 % atau celupkan pada alkohol 96 % atau pada spiritus, kemudian bakar di atas lampu bunsen dari pangkal sampai ujung. Lakukan 2 – 3 kali. Langkah ini untuk
memusnahkan spora jamur atau bakteri yang masih menempel pada pinset.
4. Ambil tanaman dari botol kultur yang akan di multiplikasi.
5. Letakkan tanaman di dalam petridish dan dipotong-potong dengan meng-gunakan pisau scapel atau gunting.
6. Ukuran eksplan, bisa pernodlus untuk tanaman berkayu atau pertunas.
7. Kemudian tanam kembali eksplan pada media kultur yang baru. Isi 1 botol kultur bisa 5 -10 eksplan. 8. Tutup rapat dan letakkan disebelah kanan. 9. Agar tekanan dari luar tidak masuk, tutup botol
dapat dilapisi plastik klin wrap.
VII. Aklimatisasi
A. Pendahuluan
Aklimatisasi merupakan proses penyesuaian planlet dari kondisi mikro dalam botol (heterotrof) ke kondisi lingkungan luar (autotrof). Planlet yang dipelihara dalam keadaan steril dalam lingkungan (suhu dan kelembaban) optimal, sangat rentan terhadap lingkungan luar (lapang). Mengingat sifat-sifat tersebut, sebelum ditanam di lapang, planlet memerlukan aklimatisasi. Aklimatisasi dapat dilakukan di rumah kaca atau pesemaian, baik di rumah kaca atau pesemaian. Dalam aklimatisasi, lingkungan tumbuh (terutama kelembaban) berangsur-aengsur disesuaikan dengan kondisi lapang (Rahardja 1989). B. Tujuan
1. Mengetahui cara mempersiapkan tanaman untuk diaklimatisasikan
2. Mengetahui cara mengaklimatisasikan tanaman hasil kultur jaringan dalam media aklimatisasi C. Alat
1. Bak kecambah 2. Sungkup plastik 3. Pinset
4. Ember 5. Sprayer
D. Bahan 1. Planlet
2. Arang, peat moss dan sekam bakar
1. Siapkan semua alat dan bahan yang akan digunakan dalam proses aklimatisasi
2. Keluarkan planlet dari botol kultur kemudian dicuci di air mengalir sampai media kultur yang menempel di akar bersih
3. Siapkan media di dalam bak kecambah
4. Tanam planlet yang sudah bersih di bak kecambah tersebut dengan jarak terrentu
