THIS PAGE INTENTIONALLY LEFT BLANK

(1)

(2)

(3)

PENERBIT:

Jurusan Biologi FMIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta

ALAMAT PENERBIT/REDAKSI:

Jl. Ir. Sutami 36A Surakarta 57126. Tel. +62-271-663375; +62-271-646994 Psw. 387, Fax.: +62-271-646655.

E-mail: [email protected]. Online: www.biology.uns.ac.id.

TERBIT PERTAMA TAHUN:

2000

ISSN:

1412-033X

TERAKREDITASI BERDASARKAN KEPUTUSAN

DIRJEN DIKTI DEPDIKNAS RI No. 52/DIKTI/Kep/2002

PEMIMPIN REDAKSI/PENANGGUNGJAWAB:

S u t a r n o

SEKRETARIS REDAKSI:

Ahmad Dwi Setyawan

Purin Candra Purnama

PENYUNTING PELAKSANA:

Marsusi, Solichatun (Botani), Edwi Mahajoeno, Agung Budiharjo (Zoologi),

Wiryanto, Kusumo Winarno (Biologi Lingkungan)

PENYUNTING AHLI:

Prof. Ir. Djoko Marsono, Ph.D.

(UGM Yogyakarta)

Prof. Dr. Hadi S. Alikodra, M.Sc.

(IPB Bogor)

Prof. Drs. Indrowuryatno, M.Si.

(UNS Surakarta)

Prof. J.M. Cummins, M.Sc., Ph.D.

(Murdoch University Australia)

Prof. Dr. Jusup Subagja, M.Sc.

(UGM Yogyakarta)

Prof. Dr. R.E. Soeriaatmadja, M.Sc.

(ITB Bandung)

Dr. Setijati Sastrapradja

(Yayasan KEHATI Jakarta)

Dr. Dedi Darnaedi

(Kebun Raya Bogor)

Dr. Elizabeth A. Wijaya

(Herbarium Bogoriense Bogor)

Dr. Yayuk R. Suhardjono

(Museum Zoologi Bogor)

BIODIVERSITAS, Journal of Biological Diversity mempublikasikan tulisan ilmiah, baik hasil penelitian asli maupun telaah pustaka (review) dalam lingkup keanekaragaman hayati (biodiversitas) pada tingkat gen, spesies, dan ekosistem. Setiap

naskah yang dikirimkan akan ditelaah oleh redaktur pelaksana, redaktur ahli, dan redaktur tamu yang diundang secara khusus sesuai bidangnya. Dalam rangka menyongsong pasar bebas, penulis sangat dianjurkan menuliskan karyanya dalam Bahasa Inggris, meskipun tulisan dalam Bahasa Indonesia yang baik dan benar tetap sangat dihargai. Hingga nomor

ini, jurnal dikirimkan kepada institusi-institusi yang meminta tanpa biaya pengganti, sebagai bentuk pertukaran pustaka demi mendorong penelitian, perlindungan dan pemanfaatan lestari keanekaragaman hayati. Jurnal ini terbit dua kali

setahun, setiap bulan Januari dan Juli.

Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta juga menerbitkan BioSMART, Journal of Biological Science untuk mempublikasikan tulisan ilmiah, baik hasil penelitian asli maupun telaah pustaka (review) dalam lingkup biologi murni dan

(4)

PEDOMAN UNTUK PENULIS

Format penulisan pada nomor ini merupakan acuan utama bagi

para penulis, adapun pedoman ini hanya merupakan ringkasannya. Setiap naskah harus disertai surat pengantar yang menyatakan bahwa tulisan merupakan hasil karya penulis atau para penulis dan belum pernah dipublikasikan. Penulis diminta mengirimkan dua kopi naskah dan satu disket ukuran 3 ½”, kecuali naskah yang dikirim melalui e-mail. Pada koreksi terakhir kembali diminta satu disket untuk pencetakan.

Tulisan diketik pada satu sisi kertas putih, ukuran A4 (210x297 mm2), dalam satu kolom, menggunakan spasi ganda, jenis huruf

Times New Roman, ukuran 12 point, dengan jarak tepi 2 cm di semua

sisi. Program pengolah kata atau jenis huruf tambahan dapat digunakan, namun harus PC compatible dan berbasis Microsoft Word. Nama ilmiah (genus, spesies, author), dan kultivar atau strain disebutkan secara lengkap pada penyebutan pertama kali. Nama genus dapat disingkat setelahnya penyebutan yang pertama, kecuali menimbulkan kerancuan. Nama author dapat dihilangkan setelah penyebutan pertama. Misalnya pertama kali ditulis Rhizopus oryzae L. UICC 524, selanjutnya ditulis R. oryzae UICC 524. Nama daerah dapat dicantumkan apabila tidak menimbulkan makna ganda. Penyebutan nama ilmiah secara lengkap dapat diulang pada bagian Bahan dan Metode. Tatanama kimia dan biokimia mengikuti aturan IUPAC-IUB. Simbol-simbol kimia standar dan penyingkatan untuk nama kimia dapat dilakukan apabila jelas dan umum digunakan, misalnya pertama kali ditulis lengkap butilat hidroksitoluen (BHT) selanjutnya ditulis BHT. Ukuran metrik menggunakan satuan SI, penggunaan satuan lain harus diikuti nilai ekuivalen dengan satuan SI pada penyebutan pertama. Penyingkatan satuan, seperti g, mg, ml, dan sebagainya tidak diikuti titik. Indek minus (m-2_{, l}-1_{, h}-1_{) disarankan} untuk digunakan, kecuali dalam hal-hal seperti “per-tanaman” atau “per-plot”. Persamaan matematika tidak selalu dapat dituliskan dalam satu kolom dengan teks, untuk itu dapat ditulis secara terpisah. Angka satu hingga sepuluh dinyatakan dengan kata-kata, kecuali apabila berhubungan dengan pengukuran, sedangkan nilai di atasnya dituliskan dalam angka, kecuali di awal kalimat. Pecahan sebaiknya dinyatakan dalam desimal. Dalam teks digunakan “%” bukannya “persen”. Pengungkapan ide dengan kalimat yang rumit dan bertele-tele perlu dihindari, sebaiknya digunakan kalimat yang efektif dan efisien. Naskah hasil penelitian diharapkan tidak lebih dari 25 halaman (termasuk gambar dan tabel), naskah telaah pustaka menyesuaikan, masing-masing halaman berisi 700-800 kata, atau sebanding dengan naskah dalam nomor penerbitan ini.

Judul ditulis secara padat, jelas, dan informatif, maksimum 20 kata. Judul ditulis dalam bahasa Indonesia dan Inggris untuk naskah dalam bahasa Indonesia atau bahasa Inggris saja untuk naskah dalam bahasa Inggris. Naskah yang terlalu panjang dapat dibuat berseri, tetapi naskah demikian jarang diterbitkan jurnal ini. Judul pelari (running title) sekitar 5 kata. Nama penulis atau para penulis pada naskah kelompok ditulis secara lengkap dan tidak disingkat. Nama dan alamat institusi ditulis lengkap dengan nama dan nomor jalan (lokasi), kode pos, nomor telepon, nomor faksimili, alamat e-mail dan website. Pada naskah kelompok perlu ditunjukkan penulis untuk korespondensi beserta alamat dengan urutan seperti di atas. Abstract sebaiknya tidak lebih dari 200 kata, ditulis dalam bahasa Indonesia dan Inggris untuk naskah dalam bahasa Indonesia atau bahasa Inggris saja untuk naskah dalam bahasa Inggris. Kata kunci (Keywords) sekitar 5 kata, meliputi nama ilmiah dan daerah (apabila ada), topik penelitian dan metode-metode khusus yang digunakan. Pendahuluan (Introduction) sekitar 400-600 kata, meliputi latar belakang, tinjauan pustaka dan tujuan penelitian. Bahan dan Metode (Materials and Methods) sebaiknya ditekankan pada cara kerja dan cara analisis data. Hasil dan Pembahasan (Results and Discussion) ditulis sebagai satu rangkaian, pada tulisan yang cukup panjang sebaiknya dibuat beberapa sub judul. Pembahasan merupakan jawaban pertanyaan mengapa dan bagaimana hasil penelitian dapat terjadi, bukan sekedar mengungkapkan kembali hasil penelitian dalam bentuk kalimat. Pembahasan yang lengkap dan menyeluruh lebih disukai dari pada pembahasan yang tidak tuntas. Naskah telaah pustaka tanpa sub judul Bahan dan Metode, serta Hasil dan Pembahasan. Kesimpulan (Conclusion) sebaiknya tetap diberikan, meskipun biasanya sudah terungkap pada Hasil dan Pembahasan. Ucapan terima kasih (Acknowledgments) apabila diperlukan ditulis secara singkat. Gambar dan Tabel maksimum 3 halaman, dapat dibuat dengan tinta cina atau printer laser. Judul gambar ditulis di bawah gambar, sedangkan judul table ditulis di atas tabel. Foto dicetak pada kertas glossy dan diberi keterangan. Gambar berwarna dapat diterima apabila informasi ilmiah dalam naskah dapat hilang tanpa gambar tersebut. Setiap gambar dan foto sebaiknya menyertakan file digital. Penulis dianjurkan menyertakan foto atau gambar untuk sampul depan, meskipun tidak dimuat dalam naskah

sendiri.Tidak ada lampiran, semua data atau analisis data dimasukkan dalam Hasil dan Pembahasan.

Pustaka dalam naskah ditulis dalam bentuk nama belakang penulis dan tahun. Pada kalimat yang diacu dari beberapa penulis, maka nama penulis diurutkan berdasarkan kebaharuan pustaka. Naskah yang ditulis oleh dua penulis, maka nama keduanya disebutkan, sedang naskah yang ditulis oleh tiga penulis atau lebih, maka hanya nama penulis pertama ditulis diikuti et al. atau dkk., misalnya: Sprent dan Sprent (1990) atau (Suranto et al., 1998; Baker and Manwell, 1991; Smith 1982a, b). Pada sitasi bertingkat digunakan kata cit atau dalam, misalnya (Gyorgy, 1991 cit Coward, 1999) atau Gyorgy (1991, dalam Coward, 1999).

Daftar Pustaka diketik dengan spasi ganda. Sitasi mengikuti CBE-ELSE-Vancouver style dengan modifikasi sebagai berikut: Jurnal:

Suranto, S., K.H. Gough, D.D. Shukla, and C.K. Pallaghy. 1998. Coat protein sequence of Krish-infecting strain of Johnson-grass mosaic potyvirus. Archives of Virology 143: 1015-1020.

Buku:

Sprent, J.l., and P. Sprent. 1990. Nitrogen Fixing Organisms: Pure

and Applied Aspects. London: Chapman and Hall.

Bab dalam buku:

Baker, C.M.A. and C. Manwell. 1991. Population genetics, molecular markers and gene conservation of bovine breeds. In: Hickman, C.G. (ed.). Cattle Genetic Resources. Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V.

Abstrak:

Liu, Q., S. Salih, J. Ingersoll, R. Meng, L. Owens, and F. Hammerschlag. 2000. Response of transgenic ‘Royal Gala’ apple (Malus x domestica Borkh.) shoots, containing the modified cecropin MB39 gene to Erwinia amylovora [084]. Abstracts of

97th Annual International Conference of the American Society for Horticultural Science. Lake Buena Vista, Florida, 23-26 July 2000.

Prosiding:

Alikodra, H.S. 2000. Keanekaragaman hayati bagi pembangunan dae-rah otonom. Dalam: Setyawan, A.D. dan Sutarno (ed.). Menuju

Taman Nasional Gunung Lawu, Prosiding Semiloka Nasional Konservasi Biodiversitas untuk Perlindungan dan Penyelamatan Plasma Nutfah di Pulau Jawa. Surakarta, 17-20 Juli 2000.

Skripsi, Tesis, Disertasi:

Purwoko, T. 2001. Biotransformasi Isoflavon oleh Rhizopus oryzae

UICC 524 dan Aktivitas Antioksidan Isoflavon Aglikon dari Tempe terhadap Oksidasi Minyak Kedelai. [Tesis]. Jakarta: Universitas

Indonesia. Informasi dari Internet:

Rosauer, D. 1998. Forest Disturbance and Succession. http:// www.anu.edu.au/ Forestry/silvinative/ daniel/chapter1/1.1.html Naskah publikasi “in press” dapat disitasi dan dicantumkan dalam daftar pustaka. “Komunikasi pribadi” dapat disitasi, tetapi tidak dapat dicantumkan dalam daftar pustaka. Penelitian yang tidak dipublikasi-kan atau sedang dalam tahap pengajuan publikasi tidak dapat disitasi. Beberapa catatan tambahan. Naskah diketik tanpa tanda hubung (-), kecuali kata ulang. Penggunaan huruf “l” (el) untuk “1” (satu) atau “O” (oh) untuk “0” (nol) perlu dihindari. Simbol α, β, χ, dan lain-lain dimasukkan melalui fasilitas insert, bukan mengubah jenis huruf. Kata-kata dan tanda baca sesudahnya tidak diberi spasi.

Kemajuan Naskah. Pemberitahuan naskah dapat diterima atau ditolak akan diberitahukan sekitar satu bulan setelah pengiriman. Naskah dapat ditolak apabila materi yang dikemukakan tidak sesuai dengan misi jurnal, kualitas materi rendah, format tidak sesuai, gaya bahasa terlalu rumit, terjadi ketidakjujuran keaslian penelitian, dan korespondensi tidak ditanggapi. Penulis atau penulis pertama pada naskah kelompok akan mendapatkan satu eksemplar jurnal yang memuat tulisannya selambat-lambatnya sebulan setelah naskah diterbitkan. Penulis akan kembali mendapatkan satu eksemplar jurnal nomor penerbitan berikutnya.

PENTING: Penulis atau para penulis dalam naskah kelompok setuju memindahkan hak cipta (copyright) naskah yang diterbitkan

BIODIVERSITAS, Journal of Biological Diversity kepada Jurusan

Biologi FMIPA UNS Surakarta. Penulis tidak lagi diperkenankan menerbitkan naskah secara utuh tanpa ijin penerbit. Penulis atau pihak lain diperkenankan memperbanyak naskah dalam jurnal ini selama tidak untuk tujuan komersial. Untuk penemuan baru, penulis disarankan mengurus hak patennya sebelum mempublikasikan dalam jurnal ini.

(5)

B I O D I V E R S I T A S ISSN: 1412-033X

Volume 5, Nomor 1 Januari 2004

Halaman: 1-6

Kloning Gen Penisilin V Asilase dari Bacillus sp BAC4

Melalui

Pembuatan Pustaka Genom

Gene Cloning of Penicillin V Acylase from Bacillus sp BAC4 by Genomic Library

ELFI SUSANTI VH

♥

, SRI RETNO DWI ARIANI

Program Studi Kimia Jurusan PMIPA FKIP Universitas Sebelas Maret Surakarta 57126 Diterima: 12 Agustus 2002. Disetujui: 3 Nopember 2003

ABSTRACT

This research was aimed to clone and identify penicillin V acylase (PVA) gene of Bacillus sp. BAC4 by genomic library. Chromosome DNA of Bacillus sp. BAC4 was isolated by Wang method. pHB201 of E. coli was isolated by alkali lyses method. Recombinant DNA of Bacillus sp. BAC4 chromosome fragment and pHB201 was made by ligase process using T4 DNA ligase. Transformation of E. coli using this recombinant plasmid was carried out according to Mandel-Higa method. The results indicated that chromosome DNA fragment of Bacillus sp. BAC4 was bigger 23 kb with purity 1,3. Plasmid DNA fragment of E coli was 6,5 kb. Transformants laboring pHB201 recombinant plasmid was screen as blue-white colonies in a medium containing IPTG/X-gal and chloramphenicol.

PENDAHULUAN

Antibiotik merupakan senyawa kimia yang

diguna-kan untuk membunuh atau menghambat

pertumbuh-an mikroorgpertumbuh-anisme penyebab infeksi. Kelompok pertumbuh-

anti-biotik β-laktam sangat penting dalam terapi

pengobat-an. Salah satu antibiotik kelompok ini adalah penisilin,

yang ditemukan Alexander Fleming pada tahun 1929

(Crueger dan Crueger, 1982). Antibiotik ini spesifik

menghambat sintesis dinding sel bakteri dan telah

banyak digunakan untuk terapi pengobatan penyakit

infeksi.

Antibiotik penisilin pada awalnya digunakan untuk

mengobati penyakit infeksi yang banyak terjadi pada

saat perang dunia kedua. Namun beberapa tahun

kemudian, pengobatan penyakit infeksi dengan

anti-biotik ini tidak efisien lagi, karena banyak

mikroorga-nisme telah menjadi resisten. Oleh karena itu, dengan

perkembangan ilmu pengetahuan, dikembangkan

antibiotik-antibiotik baru melalui modifikasi struktur

penisilin agar efektifitas antibiotik ini dapat diperoleh

kembali (Wilson, 1982)

Berbagai turunan penisilin telah dibuat dan

digunakan. Dalam proses pembuatan turunan

antibiotik, banyak dilibatkan gen pengkode

enzim-enzim tertentu, contohnya gen penisilin V asilase

(PVA) yang banyak ditemukan pada bakteri dan

jamur. Enzim ini merupakan kunci dalam pembuatan

antibiotik

β-laktam semisintetik karena dapat

meng-hidrolisis penisilin V untuk menghasilkan senyawa

antara yaitu asam 6-amino penisilanat (6-APA), suatu

senyawa antara untuk memproduksi penisilin

semi-sintetik, diantaranya metilsilin, kloksasilin, ampisilin

dan karbenisilin (Hammond, 1978). Senyawa 6-APA

yang diperoleh melalui proses hidrolisis enzimatis ini,

ikatan amida pada rantai sampingnya terputus.

Peningkatan produksi enzim PVA

banyak

dilakukan melalui pendekatan genetik, yaitu dengan

memindahkan gen pengkode PVA ke dalam suatu sel

inang yang dapat mengekspresikan gen tersebut

dengan aktivitas tinggi (Priest, 1984). Kloning gen

PVA telah banyak dilakukan. Kloning gen yang

mengkode PVA dari Bacillus sphaericus dan

ekspresinya dalam Escherichia coli dan Bacillus

subtilis telah diteliti (Olson, et al., 1985). Strain lokal

Bacillus sp. BAC4 selain memproduksi penisilin G

asilase (PGA) juga menghasilkan PVA.

Teknologi DNA rekombinan atau rekayasa

genetika merupakan suatu metode yang dilakukan

untuk memanipulasi DNA suatu makhluk hidup

tertentu guna memperoleh sifat-sifat tertentu dalam

organisme tersebut. Pada umumnya dalam teknologi

♥ Alamat korespondensi:

Jl. Ir. Sutami 36A Surakarta 57126.

Tel.: +62-271-648939. Fax.: +62-271-648939 e-mail: [email protected]

(6)

B I O D I V E R S I T AS Vol. 5, No. 1, Januari 2004, hal. 1-6

2 DNA rekombinan, peneliti berusaha menambahkan

sifat-sifat unggul ke dalam suatu organisme, sehingga

diharapkan menjadi organisme yang menguntungkan

kehidupan manusia (Glick dan Pasternack, 1994).

Pustaka genom (genomic library) adalah

kumpulan klon rekombinan dalam bentuk plasmid,

phage atau kosmid yang membawa fragmen molekul

DNA tertentu secara independen, berukuran tertentu

dan merupakan kumpulan keseluruhan informasi

genetik suatu organisme (Winnaker et al., 1987).

Kebolehjadian suatu gen spesifik dalam kumpulan

klon rekombinan dipengaruhi oleh panjang fragmen

DNA dan tingkat kompleksitas genom. Semakin tinggi

tingkat suatu spesies, maka semakin kompleks

genomnya. Beberapa tahap penting yang dapat

menentukan keberhasilan pembuatan pustaka genom

adalah penyiapan fragmen DNA, penyiapan vektor,

reaksi ligasi, dan perbanyakan DNA dalam sel inang.

Pustaka genom dapat dibuat dengan memurnikan

DNA kromosom dan memotong DNA tersebut secara

parsial dengan enzim restriksi tertentu, baik melalui

variasi konsentrasi enzim maupun variasi waktu

inkubasi. Fragmen tersebut diharapkan mewakili

keseluruhan gen pada suatu organisme. Selanjutnya

fragmen DNA diinsersikan ke vektor yang sesua,i

sehingga dihasilkan vektor rekombinan. Hasil

pengemasan (packing) dapat ditransfeksi ke dalam

sel inang yang sesuai, sedangkan bila menggunakan

vektor plasmid, hanya dilakukan transformasi dengan

metode kejutan panas (heat shock) ke dalam sel

inang (Boulnois et al., 1987)

Spesies Bacillus sangat cocok untuk produksi

enzim, kecuali B. cerus dan B. anthracis. Mikroba

jenis Bacillus tidak menghasilkan toksin, mudah

ditumbuhkan, dan tidak memerlukan substrat yang

mahal. Kemampuan Bacillus untuk bertahan pada

temperatur tinggi, tidak adanya hasil samping

meta-bolisme, dan kemampuannya untuk menghasilkan

sejumlah besar protein ekstra seluler membuat

Bacillus merupakan organisme favorit untuk industri.

Saat ini Bacillus subtilis dipakai sebagai organisme

inang untuk studi DNA-rekombinan (Doi et al., 1992).

Dalam penelitian ini, gen PVA dari Bacillus sp.

BAC4 akan diklon ke dalam vektor plasmid

meng-gunakan pustaka genom. Pustaka genom dibuat

dengan memurnikan DNA kromosom Bacillus sp.

BAC4 dan memotong DNA tersebut secara parsial

dengan enzim restriksi tertentu melalui variasi

konsentrasi enzim. Fragmen tersebut diharapkan

mewakili seluruh gen yang terdapat pada suatu

organisme. Selanjutnya fragmen DNA diinsersikan ke

vektor yang sesuai sehingga menghasilkan vektor

rekombinan. Hasil pengemasan (packing) ditransfeksi

ke dalam sel inang yaitu E. coli. Ekspresi skrining

dilakukan untuk melihat aktivitas PVA klon

rekombinan. Pengukuran aktivitas enzim PVA

didasarkan pada jumlah 6-APA yang dibebaskan

pada reaksi hidrolisis enzimatik penisilin V.

Dari uraian di atas ingin diketahui apakah kloning

gen PVA dari Bacillus sp. BAC4 dapat dilakukan

dengan menggunakan pembuatan pustaka genom.

Jika telah didapatkan klon yang positif terhadap uji

aktivitas PVA, akan dilihat bagaimana ekspesi serta

aktivitas PVA dalam E. coli.

Penelitian ini bertujuan untuk mengklon dan

meng-identifikasi gen PVA dari Bacillus sp. BAC4. Studi

perbandingan gen PVA dan aktivitas enzim PVA dari

beberapa spesies akan memberikan pengertian yang

lebih mendalam mengenai hubungan antara struktur

dan fungsi enzim dari beberapa bakteri.

BAHAN DAN METODE

Bahan

Mikroorganisme, yaitu Bacillus sp. BAC4 dan

E.coli JM109 diperoleh dari Laboratorium Rekayasa

Genetika, Pusat Penelitian Antar Universitas, Institut

Teknologi Bandung. Diperlukan pula enzim restriksi

HindIII, enzim T

4

ligase, enzim RNAse, protenase-K,

dan DNA standar. Bahan untuk ekstraksi DNA, yaitu

gliserol, media LB (Luria Bertani medium) padat,

medium LB cair, bufer lisis terdiri dari 0,15 M NaCl,

0,1 M EDTA pH 8 dan 10 mg lizosim, SDS 10%,

NaClO

4

5 M, kloroform:isoamil alkohol (24:1), etanol

95%, etanol 70 %, bufer TEN terdiri dari 10 mM Tris

HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8, dan 100 mM NaCl,

RNAse, proteinasi K, fenol:kloroform:isoamilalkohol

(25:24:1 v/v/v), dan ddH

2

O. Cara kerja

Penentuan aktivitas enzim PVA. Uji

pendahulu-an dilakukpendahulu-an dengpendahulu-an mengukur aktivitas enzim PVA

dalam Bacillus sp. BAC4 menggunakan metode

Konferld (1978). Aktivitas PVA diukur berdasarkan

jumlah 6-APA yang dibebaskan. Satu unit aktivitas

didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan

untuk menghasilkan 1 μmol 6-APA permenit pada

suhu 37

0

C. Isolasi DNA kromosom Bacillus sp. BAC4.

Isolasi DNA kromosom Bacillus sp. BAC4 dilakukan

dengan metode Wang (Doi dan McGloughlin, 1992).

Tingkat kemurnian DNA ditentukan dengan

spektro-fotometer sinar UV pada panjang gelombang 260 dan

280 nm. Karakterisasi DNA dilakukan menggunakan

elektroforesis gel agarosa dengan konsentrasi gel

0,8%. Konsentrasi larutan DNA kromosom hasil

isolasi dapat diperkirakan dengan membandingkan

intensitas warna pitanya dalam gel agarosa dengan

intensitas pita standar yang telah diketahui ukuran

dan konsentrasinya.

Isolasi DNA plasmid pHB201 dari E. coli. Isolasi

ini dilakukan dengan metode lisis alkali. Lisis sel

bakteri dilakukan secara kimia menggunakan

kombinasi larutan EDTA dan lisozim, suatu senyawa

yang merusak protein tanpa merusak molekul DNA

maupun RNA. Proses lisis sel ini dipercepat dengan

penambahan SDS, yang akan menghilangkan

mole-kul lipid sehingga membran sel dapat terbuka secara

perlahan. Pada metode ini, sebagian besar protein

(7)

SUSANTI VH dan ARIANI – Kloning gen PVA dari Bacillus

3 dan RNA tidak larut. Penambahan fenol:kloroform:

isoamilalkohol (25:24:1) diharapkan dapat

meng-ekstrak protein, sedangkan molekul RNA didegradasi

dengan menggunakan RNase.

Tingkat kemurnian DNA diukur menggunakan

spektrofotometer sinar UV pada panjang gelombang

260 dan 280 nm. Karakterisasi DNA plasmid

dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa dengan

konsentrasi gel 0,8%. Konsentrasi larutan DNA

plasmid hasil isolasi dapat diperkirakan dengan

membandingkan intensitas warna pitanya dalam gel

agarosa dengan intensitas pita standar yang telah

diketahui ukuran dan konsentrasinya.

Pemotongan DNA kromosom dan DNA plasmid.

Pemotongan DNA plasmid, DNA asing, dan DNA

rekombinan dilakukan menggunakan enzim restriksi

tertentu dengan kondisi tertentu (Sambrook et al.,

1989). Enzim restriksi yang dipergunakan adalah

enzim HindIII untuk memotong DNA plasmid dan

DNA asing. Hasil pemotongan DNA dengan enzim

restriksi diamati dengan elektroforesis gel agarosa.

Ligasi DNA kromosom ke dalam DNA vektor

(pHB201). Ligasi fragmen DNA asing ke dalam vektor

plasmid PHB201 dilakukan menggunakan enzim T

4

ligase. Hasil ligasi ini merupakan DNA plasmid

rekombinan yang siap untuk ditransformasikan ke

dalam E coli JM 109.

Transformasi ke E.coli JM109 dengan DNA

rekombinan. Terdapat dua tahap penting dalam

prosedur transformasi, yaitu penyiapan sel kompeten

dan pemasukkan DNA ke dalam sel inangnya.

Pembuatan sel kompeten E.coli JM 109 dilakukan

menurut metode Mendel dan Higa yang telah

dimodifikasi (Sambrook et al., 1989).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji aktivitas PVA dalam kultur Bacillus sp. BAC4

dilakukan untuk membuktikan bahwa bakteri tersebut

benar-benar menghasilkan enzim PVA secara

ekstra-seluler. Hasil uji menunjukkan bahwa Bacillus sp.

BAC4 menghasilkan enzim PVA, diperlihatkan

dengan adanya aktivitas PVA dari bakteri tersebut.

Aktivitas PVA tertinggi dicapai pada jam ke-12. Pada

grafik hubungan antara aktivitas PVA dengan waktu

(Gambar 1), terlihat adanya pola naik dan turun. Hal

ini diduga karena enzim PVA yang dihasilkan bersifat

ektraseluler, sehingga kestabilannya tidak

dikendali-kan lagi oleh sel, melaindikendali-kan oleh lingkungannya.

Isolasi DNA kromosom Bacillus sp. BAC4

dilaku-kan dengan metode Wang (Doi dan McGloughlin,

1992). Metode ini dilakukan dalam beberapa tahap

meliputi pembiakan bakteri, pemecahan dinding sel,

dan pemurnian DNA kromosom. Pembiakan bakteri

dilakukan pada suhu 37

0

C dan sel dipanen pada fasa

logaritma. Pemanenan pada saat ini dipilih karena

pada fasa ini sel bakteri relatif masih muda, sehingga

memudahkan pemecahan dinding sel. Pemecahan

dinding sel dilakukan secara enzimatik menggunakan

lisozim dan SDS. DNA dipisahkan dari debris sel dan

protein melalui ekstraksi menggunakan campuran

kloroform:isoamilalkohol (24:1 v/v). Kloroform dapat

mendenaturasi protein dan melarutkan lipid serta

dapat memisahkan fasa organik dan fasa air,

se-dangkan isoamilalkohol akan membantu pemisahan

kedua fasa ini agar lebih sempurna. Pemurnian DNA

dilakukan menggunakan campuran fenol:kloroform:

isoamilalkohol (25:24:1 v/v/v). Penggunaan campuran

ini menyebabkan terjadinya presipitasi protein tetapi

DNA dan RNA tetap berada dalam fasa air.

Penghilangan RNA dilakukan dengan penambahan

RNase.

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 0 5 1 0 1 5 W a k tu In k u b a s i (ja m )

Aktivitas PVA (U/ml)

Gambar 1. Hubungan antara aktivitas PVA dengan waktu inkubasi kultur Bacillus sp. BAC4.

Kemurnian dan konsentrasi DNA hasil isolasi

dihi-tung secara kuantitatif dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Dari hasil

pengukuran diperoleh bahwa konsentrasi DNA

Bacillus sp. BAC4 adalah 0,6 μg/μl dengan tingkat

kemurnian 1,3. Hasil ini menunjukkan bahwa DNA

hasil isolasi masih kurang murni, diduga masih

meng-andung protein atau sisa-sisa fenol. Visualisasi DNA

genom Bacillus sp. BAC4 dalam 0,8% gel agarosa

tampak sebagai satu larik dengan ukuran lebih dari

23 kb dengan marker DNA λ/HindIII (Gambar 2).

DNA plasmid pHB201 diisolasi dari E. coli dengan

metode lisis alkali skala kecil. Isolasi diawali dengan

penanaman satu koloni tunggal bakteri E.coli yang

mengandung plasmid pHB201 pada medium LB cair

yang mengandung antibiotik kloramfenikol. Hal ini

dilakukan karena plasmid pHB201 memiliki gen

resisten kloramfenikol, sehingga diharapkan koloni

yang tumbuh dalam medium adalah koloni bakteri

yang mengandung plasmid pHB201. DNA plasmid

yang diperoleh dianalisis menggunakan elektroforesis

gel agarosa (0,8%). Hasil analisis elektroforesis

disajikan pada Gambar 3. Terlihat ahwa molekul DNA

plasmid pHB201 memberikan 2 larik. Kedua larik

tersebut menunjukkan adanya berbagai bentuk

konformasi DNA plasmid. Larik yang berada paling

bawah adalah super coiled monomer DNA,

sedangkan pita paling atas merupakan DNA plasmid

dengan konformasi rilex open circular.

(8)

4 Ukuran DNA plasmid tersebut tidak dapat

diban-dingkan dengan standar I karena konformasi

molekul-nya berbeda. DNA λ/HindIII memiliki konformasi linier,

sedangkan DNA plasmid memiliki konformasi

covalently closed circular (ccc). Oleh karena itu DNA

plasmid perlu dipotong menggunakan enzim restriksi

tertentu sehingga konformasinya menjadi linier dan

dapat dibandingkan dengan marker DNA λ/HindIII.

Pemotongan DNA kromosom dan DNA plasmid

pHB201 hasil isolasi dilakukan dengan enzim restriksi

HindIII. Enzim ini disolasi dari Haemophilus influenze

Rd dan mempunyai urutan pengenal AAGCTT.

Pemotongan DNA kromosom dan DNA plasmid

dengan enzim HindIII akan menghasilkan ujung

lengket AGCT (Brown, 1991). Analisis elektroforesis

gel agarose (0,8%) terhadap hasil pemotongan DNA

kromosom dan DNA plasmid disajikan pada Gambar

4. Hasil pemotongan DNA plasmid dengan enzim

HindIII memberikan satu pita berukuran 6,5 kb.

Ligasi antara fragmen DNA kromosom dengan

plasmid pHB201 dilakukan dengan enzim T4 DNA

ligase secara acak. Hasil ligasi dapat dianalisis

dengan elektroforesis gel agarose (0,8%) karena

mempunyai komposisi yang berbeda dibandingkan

molekul sebelumnya (Gambar 5). Campuran reaksi

ligasi kemungkinan mengandung molekul DNA

rekombinan yang dikehendaki, molekul vektor yang

tidak mengalami ligasi, fragmen DNA kromosom yang

tidak mengalami ligasi, dan molekul vektor yang telah

melingkar kembali tanpa adanya insersi DNA.

a

b

Gambar 4. Elekroferogram DNA kromosom dan DNA plasmid pHB201 yang telah dipotong dengan enzim HindIII (1a = marker DNA λ/HindIII, 2a, 3a, 4a = DNA kromosom yang telah dipotong. 1b = marker DNA λ/HindIII, 2b,5b = plasmid pHB201 yang belum dipotong, 4b= DNA plasmid pHB201 yang telah dipotong).

Gambar 2. Elektroferogram Hasil Isolasi DNA Kromosom Bacillus sp. BAC4 (1 = marker DNA λ/HindIII; 2, 3 = DNA kromosom hasil isolasi).

Gambar 3. Elektroforegram hasil isolasi DNA plasmid pHB201 (isi kesemua sumur merupakan pHB201 dari berbagai tabung).

(9)

SUSANTI VH dan ARIANI – Kloning gen PVA dari Bacillus

5

Gambar 5. Elektroferogram hasil ligasi fragmen DNA kromosom dengan plasmid pHB201.

Plasmid rekombinan hasil ligasi digunakan untuk

mentransformasi sel inang E. coli JM109.

Transfor-man yang diperoleh ditumbuhkan pada media LB

padat yang mengandung kloramfenikol, X-gal, dan

IPTG. Vektor pHB201 membawa gen kloramfenikol

menyebabkan koloni yang tumbuh bersifat resisten

terhadap antibiotik kloramfenikol. Penyisipan DNA

pada daerah gen lacZ dapat diseleksi berdasarkan

warna koloni yang dihasilkan dengan adanya X-gal

dan IPTG.

Hasil transformasi ditandai dengan tumbuhnya

koloni biru dan putih (Gambar 6.). Koloni warna putih

menandakan adanya vektor dengan DNA sisipan,

sedangkan koloni warna biru menandakan tidak

terdapatnya DNA sisipan pada vektor pHB201.

Adanya koloni biru dan putih disebabkan DNA sisipan

dimasukkan pada daerah pengkode gen lacZ. Gen

lacZ tersebut merupakan daerah pengkode enzim β

galaktosidase. Enzim ini dapat menguraikan senyawa

mirip laktosa yaitu X-gal, dan adanya IPTG sebagai

penginduksi dihasilkan senyawa galaktosa dan

5-bromo-4-kloroindigo yang berwarna biru. DNA sisipan

yang masuk pada daerah pengkode gen lacZ

menyebabkan gen tersebut akan rusak dan sebagai

hasilnya tidak ada aktivitas enzim yang dikode oleh

gen lacZ. Enzim β galaktosidase tidak diproduksi dan

koloni warna putih dihasilkan (Brown et al., 1991).

KESIMPULAN

Dari hasil penelitian ini diketahui bahwa DNA

kromosom Bacillus sp BAC4 dan pemotongan DNA

kromosom hasil isolasi dengan enzim restriksi HindIII

menghasilkan fragmen yang berukuran lebih besar

dari 23 kb dengan tingkat kemurnian 1,3. DNA

plasmid yang diisolasi dari bakteri E. coli dan

pemotongan DNA plasmid hasil isolasi dengan enzim

restriksi HindIII menghasilkan fragmen berukuran 6,5

kb. Plasmid rekombinan hasil ligasi digunakan untuk

mentransformasi sel inang E. coli JM109. Hasil

transformasi ditandai dengan tumbuhnya koloni biru

dan putih. Disarankan untuk dilakukan kloning

dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction)

dan dilakukan transformasi menggunakan inang lain.

DAFTAR PUSTAKA

Boulnois, G.J. 1987. Genomic Library Cloning, Genom Cloning and

analysis A Laboratory Guide. Oxford: Blacwaell Scientific

Publication.

Brown, T.A. 1991. Pengantar Kloning Gen. Penerjemah: Sumiati, A.M dan Praseno. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica. Glick,B., and J.J. Pasternack. 1994. Molecular Biotechnology:

principle and Applications of Recombinant DNA. Washington,

D.C.: American Society for Microbiology.

Hammond, S.M. and P.A. Lambert. 1978. Antibiotics and

Antimicrobial Action. New York: Edward Arnold.

Kieser, T. 1984. Factor affecting the isolation of ccc DNA from Streptomyces lividans and Escherichia coli. Plasmid 12: 19-36.

Korfeld, J.M. 1978. A new colorimetric method for the determination of 6-aminopenicillanic acid. Analytical Biochemistry 86:

(10)

6

128.

Morrison, D.A., 1979. Transformation and preservation of competent bacterial cells by freezing. Methods in Enzymology 68: 326-331.

Olsson, A., H. Thomas, N. Bjorn, U. Mathias, and G. Sten. 1985. Molecular cloning of Bacillus sphaericus penicillin V amidase gene and its expression in Escherichia coli and Bacillus subtilis. Applied and Environmental Microbiology 49: 1084-1089.

Priest, F.G. 1984. Extracellular Enzymes. London: Van Nostrand Reinhold Co. Ltd.

Sambrook, J., T. Maniatis, and E.F. Fritsch. 1989. Molecular

Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor

Laboratory.

Vandamne, E.J. and J.P. Voets. 1974. Microbial penicillin acylases.

Advance Applied Microbiology 17: 311-369

Wilson, L. and L. Gisvold. 1982. Textbook of Organic Medicinal and

Pharmaceutical Chemistry. Philadelphia: Harper and Row

Publishers, Inc.

Winnacker, E.L. 1987. From Gene to Clones Genomic Libraries. New York: VHC Verlagsgesellschaft mbHi.

(11)

Halaman: 7-12

Analisis Kualitas Produk Fermentasi Beras (Red Fermented Rice)

dengan Monascus purpureus 3090

The analysis of the quality of red fermented rice (RFR) product with Monascus

purpureus 3090

DJUMHAWAN R. PERMANA

♥

, SUNNATI MARZUKI, D. TISNADJAJA

Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong - Bogor 16911

Diterima: 31 Agustus 2003. Disetujui: 15 Desember 2003.

ABSTRACT

Analysis of red fermented rice product with Monascus purpureus 3090 was conducted on monascus floor product (MFP-264), MFP-244 and rice monascus product (RMP). Evaluation of microbiological, pigment intensity and lovastatine content analysis result was aimed to see quality differences on each production of 5 kg rice raw material. Of both product types (MFP-264, RMP) which only oven dried compare to MFP-244 which is sterilized in autoclave showed a significantly difference of population level on total microorganism colonies, that is mould 26x106 propagule/ml, bacteria 13x106 cell/ml (MFP-264), mould 85x106 propagule/ml, bacteria 265x106 cell/ml (RMP). The MFP-244 produced highest absorption spectra 0.3513-0.4050 compare to MFP-264 0.3110-0.3324, rice monascus product (RMP) 0.3343-0.3663. Pigment biosynthesis seems occurred at sexual developmental stage or conidia formation of M. purpureus 3090, which is produced color changes of yellow pigment, orange pigment, and red pigment. Lovastatine content of MFP-264 has Rf value 0.84 MFP-244 Rf 0.83 and RMP Rf 0.82 showed higher value compare to Rf 0.81 of the lovastatine standard solution.

PENDAHULUAN

Red Fermented Rice (RFR) dikenal juga dengan

nama angkak merupakan hasil fermentasi beras yang

menggunakan kapang Monascus purpureus. Angkak

berasal dari Cina yang dikenal pula dengan nama

angquac, red rice, Chinese red rice, beni koji, dan

aga koji (Church dalam Palo et al., 1960). Di Taiwan

pembuatan angkak menggunakan M. anka nakagawa

dan M. anka sato. Jenis lain yang sering digunakan

adalah M. ruber, Monascus F-2, M. bropunctatus dan

M. rubiginous. Dari beberapa strain kapang

monascus yang paling banyak digunakan adalah M.

purpureus NRRL 2897 karena menghasilkan kadar

pigmen yang tinggi (Broder et al., 1980). Monascus

mampu memproduksi pigmen kuning dari monascin

dan ankaflavin, pigmen jingga dan merah dari

rubropungtamine dan monascorubin, pigmen

rubropunctatin dan monascorubramin (Sherperd,

1977). Selain memproduksi pigmen, Monascus juga

menghasilkan enzim α dan β–amilase, glukoamilase,

protease, dan lipase (Lin, 1973; Steinkraus, 1983).

Sedangkan adanya senyawa statin berkhasiat bagi

kesehatan tubuh. Monascus dalam bentuk tepung

dapat dijadikan campuran makanan dan minuman

suplemen sebagai penurun kadar kolesterol.

Kegunaan monascus dapat mengobati berbagai

penyakit termasuk infeksi, gangguan pencernaan

termasuk diare, dan meningkatkan sirkulasi darah.

Berdasarkan resep obat-obatan Cina, angkak

menyembuhkan penyakit asma dan kelainan urinasi

(Steinkraus, 1998). Di Cina, Taiwan, dan Filipina

angkak telah digunakan sebagai pewarna makanan

maupun minuman seperti chinese cheese dan

bagoong makanan khas Filipina dan anggur merah

(Susanti, 1998). Pembuatan RFR dilakukan dengan

menggunakan bahan dasar beras sebagai substrat

media tumbuh kapang M. purpureus. Di Thailand

salah satu jenis beras khao-mali menghasilkan

angkak yang berwarna gelap keungu-unguan dengan

pigmen menembus ke seluruh bagian dalam beras.

Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi hasil

produksi tepung monascus pada skala 5 kg bahan

baku beras meliputi, uji mikrobiologi, uji pigmen, dan

kandungan lovastatin.

Jl. Raya Bogor Km. 46, Cibinong-Bogor 16911. Tel.: +62-21-8754587. Fax.: +62-21-8754588.

(12)

BIODIVERSITAS Vol. 5, No. 1, Januari 2004, hal. 7-12

8 BAHAN DAN METODE

Proses pengolahan bahan

ba-ku beras menjadi produk tepung

monascus disajikan pada Gambar

1. Bahan

Mikroorganisme.

Mikroorganisme yang digunakan

pada penelitian ini adalah M.

purpureus

3090 dari koleksi

biakan Pusat Penelitian

Bioteknologi-LIPI Cibinong-Bogor.

Beras. Beras yang digunakan

adalah beras putih dengan

kualitas cukup baik dan tidak

terlalu lengket.

Media. Biakan persediaan

(stock culture) ditumbuhkan pada

medium agar kentang dektrose

(PDA) miring (Difco, USA) dan

secara rutin diremajakan se-tiap

2-3 bulan. Pengembangan

inokulum dilakukan dengan

menggunakan labu erlenmeyer

250 ml yang berisi medium cair

terdiri dari: 0,5 g KH

2

PO4, 0,3 g

NaNO

3

, 0,2 g MgSO

4

.7H

2

O, 0,2 g

MSG, dan 0,002 g CaCl

2

2H

2

O. Semua bahan tersebut dilarutkan

dalam 200 ml akuades dan

dikocok sampai homogen dengan

menggunakan shaker. Setelah itu diinokulasi dengan

5 ml suspensi spora M. purpureus dari PDA miring

yang berumur 5 hari. Inkubasi dilakukan dengan

menggunakan rotary shaker pada suhu 30

0

C selama

5 hari.

Inokulum 2 ml dimasukkan ke dalam media beras

dalam botol yang telah disiapkan sebelumnya.

Botol-botol beras diletakkan dalam rak berada pada ruang

inkubasi. Pengamatan secara visual dilakukan setiap

hari serta setiap 2 hari botol-botol tersebut harus

dikocok agar pertumbuhannya merata. Proses

inkubasi atau fermentasi dilakukan selama 14 hari

yang selanjutnya dilakukan pemanenan.

Analisis mikrobiologi

Perhitungan koloni untuk menghitung jumlah total

pertumbuhan mikroorganisme kapang dan bakteri

dilakukan dengan cara pengenceran. Pengertian

istilah propagul diberikan bagi kapang sebagai

struktur reproduksi dalam bentuk potongan populasi

hifa atau miselium. Sedangkan pengertian koloni

diberikan untuk bakteri yang diartikan sebagai bagian

dari populasi individu mikroorganisme dari jenis yang

sama setelah dipisahkan (Parker, 1986).

Sampel yang dianalisis terdiri dari 1 contoh produk

tepung monascus tidak disterilkan, 1 contoh produk

monascus beras tidak disterilkan dan 1 contoh produk

tepung monascus yang disterilkan. Sampel sebanyak

1 g dimasukkan ke dalam erlenmeyer berisi 99 ml

akuades steril, lalu dikocok dengan shaker hingga

homogen selama 5 menit, sehingga diperoleh

pengenceran 10

-2

. Dari pengenceran 10

-2

ini diambil 1

ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml

akuades steril, sehingga diperoleh pengenceran 10

-3

dan seterusnya dilakukan perlakuan sama sampai

pengenceran 10

-6

. Masing-masing pengenceran 10

-6

dari kapang dan bakteri dipipet 0,1 ml dan

diinokulasikan ke dalam media agar PDA pada cawan

petri untuk kapang, sedangkan bakteri digunakan

media nutrien agar (NA). Kedua kultur diinkubasi

pada suhu 28

0

C untuk kapang dan 32

0

C untuk

bakteri, masing-masing selama 48 jam.

Analisis intensitas pigmen

Kandungan pigmen yang terdapat dalam RFR

diukur berdasarkan absorbannya dengan

spektrofoto-meter UV-Visible pada panjang gelombang 354 nm,

388 nm, dan 401 nm. Sebanyak 0,1 g masing-masing

contoh produk monascus (RFR) ditimbang

dimasuk-kan ke dalam tabung reaksi, lalu diekstrak dengan 7,5

ml etanol 40%, dikocok menggunakan vortex selama

1 menit lalu dibiarkan mengendap. Larutan diekstrasi

kembali sebanyak 3 kali, disentrifugasi selama 15

menit pada kecepatan 10.000 rpm. Larutan jernih

dipipet 1 ml, lalu diencerkan 10 kali dengan akuades.

Beras

Perendaman dalam air (1 : 1) selama semalam

Sterilisasi dengan pengukusan selama 2 jam

Inokulasi dengan 2 ml inokulum untuk 100 g beras

Inkubasi s.d. 14 hari

Pengeringan dalam oven untuk menurun kadar air selama 1-2 hari, suhu 700C

Penggilingan

Sterilisasi, suhu 1600C selama 2 jam

Pengemasan Uji mikrobiologi, kandungan pigmen, dan lovastatin Inokulum (bibit) Monascus purpures umur 5 hari (1) (2) (3) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (4)

(13)

PERMANA dkk. – Kualitas angkak Monascus purpureus

9 Analisis kualitatif lovastatin

Lovastatin dapat dipisahkan dengan ekstraksi

kloroform. Pemisahan hasil ekstraksi diuji secara

kualitatif menggunakan metode kromatografi lapisan

tipis (thin layer chromatography; TLC) pada plate 25

DC-Alufollin 20x20 cm, 25 TLC alumunium sheet

20x20 cm, Silica gel (60 F24). Kandungan lovastatin

dilihat berdasarkan perbedaan migrasi eluen (CHCl

3

:

CH

3

OH = 5 : 1 ) (v/v). Perhitungan Rf ditentukan

sesuai yang dilakukan Moestofa (2002).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil uji mikrobiologi ketiga macam produk

monascus dengan cara pengenceran (dilution

method) dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Rata-rata jumlah propagul kapang dan koloni bakteri dari 3 produk monascus setelah diinkubasi 48 jam.

Kapang Bakteri

Produk Nx106

propagul/ml

Nx106 sel/ml Produk monascus tepung

(PTM-264)

26 13

Produk monascus tepung steril (PTM-244)*

tt tt

Produk monascus beras (PMB) 85 56 Keterangan: *) disterilkan pada autoklaf (suhu 121 oC : waktu 15 menit ), tt = tidak tumbuh.

PTM-264 mengandung jumlah total propagul

kapang sebanyak 26x10

6

propagul/ml dan koloni

bakteri sebanyak 13x10

6

sel/ml. Sementara jumlah

total propagul kapang maupun koloni sel bakteri pada

PTM-244 yang melalui proses sterilisasi tidak

menunjukkan pertumbuhan mikroorganisme.

Pertumbuhan kapang maupun bakteri ditemukan

relatif lebih banyak pada sampel PMB (Tabel 1.)

kemungkinan hal ini disebabkan oleh kadar air yang

lebih tinggi dalam partikel beras dibandingkan dengan

bentuk tepung monascus.

Hasil permurnian dan identifikasi kapang secara

morfologi diperoleh isolat kapang, yaitu: Trichoderma

sp. sebagai kontaminan dan M. purpureus. Kedua

jenis kapang itu diperoleh dari PTM-264 yang tidak

mengalami sterilisasi autoklaf. Produk tepung

monascus steril (PTM-244) tidak menunjukkan

pertumbuhan kapang. Hal itu disebabkan PTM-244

sebelum dianalisis dilakukan sterilisasi terlebih dahulu

dibandingkan PTM-264 yang hanya mengalami

proses pemanasan dengan suhu oven. Pada produk

monascus beras (PMB) jumlah total pertumbuhan

kapang maupun bakteri lebih tinggi dibandingkan

PTM-264.

Pada Gambar 2. ditunjukkan bentuk pertumbuhan

kapang Trichoderma sp. Kapang ini dipertelakan

sebagai salah satu kapang kontaminan pada produk

tepung monascus yang diakibatkan proses sterilisasi

kurang efektif.

a

b

c

Gambar 2. A. Pertumbuhan spora kapang Trichoderma sp., B. Pertumbuhan isolat murni pada media PDA di cawan petri umur 2 hari, C. Bagian hifa dari morfologi Trichoderma sp. Pembesaran 1000 x. Garis = 5 μm.

(14)

10 Kandungan pigmen pada berbagai produk RFR

dapat terekstraksi alkohol 40% dan terukur intensitas

warna berdasarkan absorbannya dengan

spekrofotometer pada panjang gelombang 354 nm,

388 nm, dan 401 nm. Pengukuran serapan terhadap

ketiga perlakuan contoh ditunjukkan dari nilai

maksimumnya, dimana absorban dari senyawa

tersebut sudah mendekati daerah tampak UV.

Penginderaan ketiga panjang gelombang tersebut

sesungguhnya hanya menunjukkan warna bening,

tidak menunjukkan warna apapun. Mungkin hal ini

disebabkan oleh penggunaan sinar tampak di bawah

panjang gelombang 402 nm.

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 354 388 401 Panjang gelombang (nm) A b so rb an si A B C

Gambar 3. Intensitas warna pada berbagai produk yang difermentasi oleh M. purpureus. A. produk tepung monascus (PTM-264); B. produk tepung monascus steril (PTM-244); C. produk monascus beras.

Gambar 4. Struktur kimia biosintesis pigmen dari Monascus sp (Sherperd, 1977).

a

b

c

Gambar 5. Morfologi M. purpureus 3090 dilihat dengan foto mikroskop fase-kontras (x 1000). A. Bagian morfologi menghasilkan pigmen kuning (garis = 1,5 μm); B. Bagian ascomata menghasilkan pigmen jingga (orange) (garis = 2,5 μm); dan C. Bagian ascomata dewasa menghasilkan pigmen merah (garis = 4 μm).

(15)

PERMANA dkk. – Kualitas angkak Monascus purpureus

11

Gambar 6. TLC senyawa lovastatin. S, standar; A, PTM-264; B, PTM-244; dan C, PMB.

a

b

Gambar 7. A. produk monascus beras belum digiling, B. produk tepung monascus steril (PTM-244).

Hasil analisis serapan absorbansi spektrum

terendah diperoleh dari contoh PTM-264

dibandingkan kedua perlakuan tersebut. Sedangkan

hasil serapan spektrum rata-rata tertinggi adalah

0,3513-0,4050 yang diperoleh PTM-244. Sementara

serapan spektrum yang dihasilkan produk monascus

beras adalah 0,3443-0,3540. Pengaruh pengunaan

ketiga panjang gelombang tidak menunjukkan

perbedaan yang nyata pada berbagai contoh produk.

Dilaporkan bahwa pigmen kuning memiliki serapan

maksimum relatif rendah dibandingkan pigmen jingga

dan merah yang dihasilkan dalam medium kultur

terendam maupun kultur padat, pigmen kuning

menunjukkan serapan spektrum yang lebih tinggi (Lin

dan Suen 1973; Carels dan Sherpherd; Wong et al.,

1981; Lin dan Lizuka 1982; dalam Youngsmith, et al.,

1993). Beberapa pigmen yang dihasilkan kapang M.

rubropunctatus adalah pigmen kuning (monascin) dan

pigmen jingga (rubropunctatin), sedangkan M.

purpureus

menghasilkan pigmen jingga

(monascorubrin) dan pigmen kuning (monascin).

Biosintesis pigmen ini dilihat dari struktur kimia untuk

setiap warna akan berbeda (Broder et al., 1980).

Biosintesis pigmen ditentukan juga oleh jenis

medium (Susanti, 1998). Produksi pigmen M.

purpureus akan dipengaruhi rasio C/N dalam medium

(Lin, 1973; Wong 1981). Kandungan nitrogen nitrat

dan nitrogen ammonia dapat meningkatkan produksi

pigmen karena secara efektif mampu mendorong

metabolisme ammonium nitrat (Hawker, 1950 dalam

Sukandar, 2003). Perkembangbiakan seksual dan

pembentukan konidia akan dipacu oleh kandungan

nitrogen organik yang optimum. Karena secara

kuantitatif jumlah pigmen yang dihasilkan signifikan

dengan pembentukan konidia (Carels et al., 1977).

Perbedaan morfologi M. purpureus 3090

menunjukkan tingkat biosintesis pigmen pada

perkembangbiakan seksual (Gambar 5.).

Pada Gambar 6. memperlihatkan reaksi produk

dengan eluen (CHCl

3

:CH

3

OH = 5:1) pada

kromatografi lapisan tipis (TLC). Nilai Rf

masing-masing produk, yaitu PTM 264, PTM 244, dan PMB

adalah 0,84, Rf 0,83, dan Rf 0,83. Sedangkan nilai Rf

standar lovastatin adalah (Rf 0,81).

Kandungan lovastatin paling tinggi diperoleh dari

contoh produk kapang monascus (PTM-264) yang

memiliki nilai Rf 0,84 lebih tinggi dibandingkan nilai

standar lovastatin. Sedangkan contoh produk

monascus beras (PMB) menghasilkan nilai Rf

terendah (0,82). Perbedaan hasil produksi monascus

dalam bentuk beras dan tepung disajikan pada

Gambar 7.

KESIMPULAN

Kapang M. purpureus 3090 yang diisolasi dari

produk tepung monascus (PTM-264) pada kondisi

populasi mikroorganisme campuran (26x10

6

propagul/ml) masih menunjukkan daya viabilitas.

Proses sterilisasi menggunakan autoklaf terhadap

PTM-244 menunjukkan efektifitas cukup tinggi untuk

mematikan mikroorganisme, sehingga produk

tersebut aman dikonsumsi.

Biosintesis pigmen oleh M. purpureus 3090 pada

fase perkembangbiakan menghasilkan berbagai

tingkatan pigmen: kuning (monascin), jingga

(rubropunctatin), dan merah (monascorubramin).

Hasil analisis intensitas serapan warna tertinggi

diperoleh PTM-264 0,3513-0,4050. Kandungan

pigmen dari ketiga perlakuan produk tidak

(16)

12 menunjukkan adanya pengaruh suhu pemanasan

terhadap kestabilan pigmen. Produksi pigmen sangat

dipengaruhi oleh komposisi dan pembentukan

konidia, yang secara kualitatif menambah pigmen.

Nilai Rf 0,84 adalah kandungan lovaslatin tertinggi

yang diperoleh dari contoh PTM-264. Sementara

contoh PMB memiliki kandungan lovastatin terendah

dengan nilai Rf 0,82. Namun demikian ketiga

perlakuan di atas menunjukkan kandungan lovastatin

lebih tinggi dibanding nilai Rf larutan standar

lovastatin (0,81).

DAFTAR PUSTAKA

Broder, C.U. and P.E. Kochler. 1980 Pigments by Monascus purpureus with regard quality and quantity. Food Science 576-569.

Carels, M. and D. Sherperd. 1977. The effect of different nitrogen source on pigment production and sporulation of Monascus species in submerged, shaken culture. Canadian Journal of

Microbiology 23: 1360-1372.

Hasseltine, C.W. 1965. A millenium of fungi, food and fermentation.

Mycologia 57: 149-197.

Lin, C.F. 1973. Isolation and cultural condition of Monascus sp. for the production of pigment in a submerged culture. Journal of

Fermentation Technology 51: 407-414.

Moestofa, H.A. dan H.E. Krisnandi. 2002. Dasar-dasar

Khromatografi dengan Instrumentasi. Bogor: Sekolah

Menengah Analis Kimia.

Palo, M.A., L.V. Adeva, and L.M. Maceda. 1960. A study on angkak and its production. The Philippine Journal of Science, 89 (1): 1-19.

Parker, S.P. 1986. Kamus Biologi. New York: Mc Graw-Hill Book, Company.

Steinkraus, H. 1983. Indigenous Fermented Food New York: Marcel Dekker.

Sukandar. 2003. Singkong sebagai subtrat yang potensial untuk produksi zat warna Monascus. Proseding Seminar Nasional

Teknologi Proses Kimia V. Jakarta: Program Studi Teknik

Kimia, Fakultas Teknik UI.

Susanti, M.T. 1998. Optimasi Kondisi Operasi Proses Produksi

Pigmen Angkak pada Fermentasi beras oleh Monascus

purpureus. Semarang: Universitas Diponegoro.

Wong, H.C., Y.C. Lim, and P.E. Kochler. 1981. Regulation of growth and pigmentation of Monascus purpureus by carbon and nitrogen consentration, Mycologia 73: 649-654.

Yongsmith, B., W. Tabloka, W. Yongmanitchai, and R. Bavavoda. 1993. Culture conditon for yellow pigment formation by Monascus sp. KB10 grown on cassava medium. World Journal

(17)

Halaman: 13-16

Populasi Bakteri dari Tanah di Desa Tudu-Aog, Kecamatan

Passi, Kabupaten Bolaang Mongondow, Sulawesi Utara

Population of bacteria from soil in Tudu-Aog village, Passi district, Bolaang

Mongondow, North Sulawesi

SRI PURWANINGSIH

1♥

, RIANI HARDININGSIH

1

, WARDAH

2

, AGUS SUJADI

2

1

Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi-LIPI, Bogor 16122.

2

Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi-LIPI, Bogor 16002. Diterima: 21 Agustus 2003. Disetujui: 30 Oktober 2003.

ABSTRACT

An experiment was conducted in order to know the population of bacteria from soil in Tudu-Aog village, Passi district, Bolaang Mongondow, North Sulawesi, the purpose of the research was to study the population of bacteria from soil. Fourthy six soil samples were taken from two location, namelyTudu-Aog village and Bugis mountain. Isolation was done by dilution methods on YEMA medium (for Rhizobium bacteria), Winogradsky’s (for Azotobacter bacteria), Pycosvkaya (for Phosphat Solubilizing Bacteria), and selective Difco Pseudomonas (for Pseudomonas bacteria). Incubation at room temperature (27-280C) until 15 days, and the enumeration with plate count method. The highest enumeration of Rhizobium bacteria with plant rhizosphere of Alocasia esculenta (27x105 CFU/g soil), Theobroma cacao (29x105 CFU/g soil),and Euphorbia paniculata (26x105 CFU/g soil), Azotobacter bacteria with plant rhizosphere of Lycopersicum esculantum (38x105 CFU/g soil), Eugenia aromaticum (43x105 CFU/g soil), Andropogon sp. (34x105 CFU/g soil), Phosphat Solubilizing bacteria with plant rhizosphere of Sechium edule (27x105 CFU/g soil), Cinnamomum sp. (48x105 CFU/g soil), Cyathea sp. (72x105 CFU/g soil), and Pseudomonas bacteria with plant rhizosphere of Oryza sativa (18x105 CFU/g soil), Vanilla sp. (12x105 CFU/g soil), dan Saurauia sp.(19x105 CFU/g soil).

PENDAHULUAN

Desa Tudu-Aog terletak di kawasan hutan lindung

gunung Bugis, Sulawesi Utara, merupakan kawasan

hutan lindung yang memiliki keanekaragaman hayati

cukup tinggi. Usaha penggalian sumber daya hayati

belum banyak dilakukan dan dilaporkan, terutama

mikrobia dari tanah. Salah satu mikrobia tanah adalah

bakteri tanah. Bakteri tanah mempunyai banyak

sekali manfaatnya antara lain penyedia unsur hara,

terutama unsur nitrogen, penghasil zat pengatur

tumbuh seperti sitokinin, giberelin dan indol asam

asetat (IAA), dan mampu melarutkan unsur fosfat

yang dalam bentuk terikat menjadi tersedia, serta

sebagai agen biokontrol dan lain-lain (Alexander,

1977), sehingga dapat meningkatkan pertumbuhan

tanaman, yang pada akhirnya dapat meningkatkan

kesuburan tanah.

Untuk meningkatkan tingkat kesuburan tanah dan

produktivitas hutan, perlu didukung data dan

informasi tentang bakteri tanah. Bakteri tanah banyak

sekali jenisnya dan fungsinya, antara lain bakteri

Rhizobium mempunyai kemampuan mengikat

nitrogen bebas yang berada di udara menjadi amonia

(NH

3

) yang akan diubah menjadi asam amino yang

selanjutnya menjadi senyawa nitrogen yang

diperlukan oleh tanaman untuk tumbuh dan

berkembang (Allen dan Allen, 1981). Bakteri

Azotobacter berfungsi sebagai penambat N

2

yang

melimpah di atmosfer dan menyediakan nitrogen bagi

tanaman, bakteri itu tergolong sebagai bakteri

pemacu tumbuh (plant growth promoting

rhizobacteria atau yield increasing bacteria) yang

mengandung vitamin dan zat pengatur tumbuh

seperti IAA, kinetin dan giberelin (Tang et al., 1983:

Glick, 1995). Bakteri pelarut fosfat berfungsi dalam

melarutkan fosfat yang dalam bentuk terikat menjadi

tersedia, meningkatkan fosfat tersedia, memperbaiki

Jl. Ir. H. Juanda 18, Bogor 16122.

Tel.: +62-251-324006. Faks.: +62-251-325854

(18)

14 pertumbuhan tanaman dan meningkatkan efisiensi

pemupukan fosfat (Subba-Rao, 1994), dan memiliki

kemampuan melarutkan mineral-mineral fosfat

melalui sekresi asam organik (Kucey, 1987) dan atau

enzim fosfatase (Illmer dan Schiner, 1992).

Penggunaan inokulan bakteri pelarut fosfat mampu

meningkatkan produksi padi antara 10 sampai 70%

dengan peningkatan produksi rata-rata sekitar 28%

(Datta et al., 1982). Sedangkan bakteri Pseudomonas

berpotensi ekonomis sebagai agen biokontrol (Dupler

dan Baker, 1984). Jumlah, jenis, dan aktivitas

mikrobia dalam tanah dipengaruhi oleh beberapa

faktor, antara lain tersedianya energi dan sumber

hara, kondisi fisik, kimia, serta biologi tanah.

Sebaliknya aktivitas mikrobia tanah sangat membantu

tersedianya unsur hara yang diperlukan oleh

tanaman.

Sebagai upaya untuk mengetahui keberadaan

bakteri dari tanah tersebut diatas, maka dilakukan

inventarisasi dan isolasi bakteri dari tanah tersebut

dengan tujuan untuk mengetahui populasi bakteri dari

tanah dari berbagai lokasi dan pada perakaran

tanaman ladang dan hutan, dengan harapan

didapatkan koleksi bakteri dari tanah yang

selanjutnya dapat digunakan sebagai inokulan (pupuk

hayati) pada daerah tersebut.

BAHAN DAN METODE

Pengambilan tanah. Sebanyak 500 g contoh

tanah diambil dari kedalaman 0-15 cm secara random

pada daerah perakaran suatu tanaman, dimasukkan

dalam polybag, kemudian dibawa ke laboratoriun dan

disimpan pada suhu 4-8

o

C. Sebanyak 16 contoh

tanah diambil dari daerah perakaran tanaman ladang

desa Tudu-Aog pada ketinggian 720 m dpl (di atas

permukaan laut), 13 sampel tanah pada daerah

perakaran tanaman komersial desa Tudu-Aog pada

ketinggian 710 m dpl, dan 17 sampel tanah pada

daerah perakaran tanaman obat dari desa Tudu-Aog

dan gunung Bugis pada berbagai ketinggian.

Isolasi bakteri dari tanah. Isolasi bakteri dengan

cara pengenceran dengan menggunakan pelarut

NaCl 0,85% dengan seri pengenceran 10

-1

-10

-7

.

Sampel (100 μl) dituang ke petridish yang telah berisi

media YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar) (Vincent,

1970) untuk bakteri Rhizobium, Winogradsky

,

s salt

agar (Winogrdsky

,

s, 1949, dalam Thompson dan

Skerman, 1979) untuk bakteri Azotobacter,

Picovskaya agar (Sundara-Rao dan Sinha, 1963)

untuk bakteri pelarut fosfat, dan selektif Difco

Pseudomonas Isolation Agar untuk bakteri

Pseudomonas. Sampel diratakan dengan spatula,

dan diinkubasikan pada suhu kamar (27-28

o

C), setiap

hari diamati pertumbuhannya dan dihitung jumlah

koloninya. Penghitungan jumlah koloni dilakukan

dengan metode cawan hitung (plate count) (Lay,

1994).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil isolasi menunjukkan bahwa populasi bakteri

Rhizobium, Azotobacter, bakteri pelarut fosfat dan

Pseudomonas bervariasi pada masing-masing contoh

tanah yang diamati (Tabel 1., 2. dan 3.). Hasil isolasi

bakteri dari tanah di desa Tudu-Aog pada ketinggian

720 m dpl menunjukkan bahwa populasi bakteri

Rhizobium tertinggi pada contoh tanah dari perakaran

tanaman Alocasia esculenta (27x10

5

CFU/g tanah)

dan terendah pada contoh tanah yang tanpa tanaman

(3x10

5

CFU/g tanah). Populasi bakteri Azotobacter

tertinggi pada contoh tanah dari perakaran tanaman

Lycopersicum esculantum (38x10

5

CFU/g tanah) dan

terendah pada contoh tanah tanpa tanaman (2x10

5

CFU/g tanah). Populasi bakteri pelarut fosfat tertinggi

dari perakaran tanaman Sechium edule (27x10

5

CFU/g tanah) dan terendah pada contoh tanah tanpa

tanaman (4x10

5

CFU/g tanah), sedangkan populasi

bakteri Pseudomonas tertinggi dari contoh tanah dari

perakaran tanaman Oryza sativa (18x10

5

CFU/g

tanah) dan terendah pada contoh tanah tanpa

tanaman (1x10

5

CFU/g tanah) (Tabel 1.).

Hasil isolasi bakteri dari tanah di desa Tudu-Aog

pada ketinggian 710 m dpl menunjukkan bahwa

populasi bakteri Rhizobium tertinggi pada contoh

tanah dari perakaran tanaman Theobroma cacao

(29x10

5

CFU/g tanah) dan yang terendah pada

contoh tanah yang tanpa tanaman (3x10

5

CFU/g

tanah). Populasi bakteri Azotobacter tertinggi pada

contoh tanah dari perakaran tanaman Eugenia

aromaticum (43x10

5

CFU/g tanah) dan terendah pada

contoh tanah tanpa tanaman (5x10

5

CFU/g tanah).

Populasi bakteri pelarut fosfat tertinggi pada contoh

tanah dari perakaran tanaman Cinnamomum sp.

(48x10

5

CFU/g tanah) dan yang terendah pada

contoh tanah tanpa tanaman (2x10

5

CFU/g tanah),

sedangkan populasi bakteri Pseudomonas tertinggi

pada contoh tanah dari perakaran tanaman Vanilla

sp. (12x10

5

CFU/g tanah) dan terendah pada contoh

tanah tanpa tanaman (2x10

5

CFU/g tanah) (Tabel 2.).

Hasil isolasi bakteri dari tanah di desa Tudu-Aog

dan gunung Bugis menunjukkan bahwa populasi

bakteri Rhizobium tertinggi pada contoh tanah dari

perakaran tanaman Euphorbia paniculata (26x10

5

CFU/g tanah) dan yang terendah pada contoh tanah

yang tanpa tanaman (5x10

5

CFU/g tanah). untuk

populasi bakteri Azotobacter tertinggi pada contoh

tanah dari perakaran tanaman Andropogon sp.

(34x10

5

CFU/g tanah) dan terendah pada contoh

tanah tanpa tanaman (2x10

5

CFU/g tanah). Populasi

bakteri pelarut fosfat tertinggi pada contoh tanah dari

perakaran tanaman Cyathea sp. (72x10

5

CFU/g

tanah) dan terendah pada contoh tanah tanpa

tanaman (4x10

5

CFU/g tanah), sedangkan populasi

bakteri Pseudomonas tertinggi pada contoh tanah

dari perakaran tanaman Saurauia sp. (19x10

5

CFU/g

tanah) dan terendah pada contoh tanah tanpa

tanaman (2x10

5

CFU/g tanah) (Tabel 3.).

(19)

PURWANINGSIHdkk. – Bakteri di Tudu-Aog, Sulawesi Utara

15

Tabel 1. Populasi bakteri dari tanah pada perakaran tanaman ladang di desa Tudu-Aog, pada ketinggian 720 m dpl. Populasi bakteri dari tanah (x105 CFU/g tanah)

No. Perakaran tanaman

Rhizobium Azotobacter Bakteri pelarut fosfat Pseudomonas

1. Vigna unguiculata 12 11 12 3 2. Arachis hypogaea 7 5 9 5 3. Glycine max 11 12 17 6 4. Vigna sinensis 9 13 13 8 5. Oryza sativa 4 9 5 18 6. Solanum melongena 5 4 7 9 7. Manihot utilissima 9 5 4 6 8. Capsicum frutescen 6 13 11 13 9. Zea mays 11 25 7 11 10. Ipomea batatas 16 11 21 9 11. Sechium edule 14 10 27 7 12. Alocasia esculenta 27 31 21 16 13. Lycopersicum esculantum 22 38 26 2 14. Monordica charantia 24 5 24 4 15. Carica papaya 12 17 10 5 16. Tanpa tanaman 3 2 4 1

Tabel 2. Populasi bakteri dari tanah pada perakaran tanaman komersial di desa Tudu-Aog, pada ketinggian 710 m dpl. Populasi bakteri dari tanah (x105 CFU/g tanah)

No. Perakaran tanaman

1. Pometia pinnata 6 22 19 5 2. Aleurites molucana 7 42 41 6 3. Coffea arabica 4 21 11 3 4. Theobroma cacao 29 17 8 9 5. Eugenia arimaticum 5 43 44 10 6. Garcinia mangostana 7 6 19 3 7. Cinnamomum sp. 9 23 48 7 8. Nephelium lappaceum 11 14 27 4 9. Vanilla sp. 21 7 16 12 10. Lansium domesticum 8 10 27 8 11. Ananas comosus 16 9 13 9 12. Myristica fragan 8 11 3 6 13. Tanpa tanaman 3 5 2 2

Tabel 3. Populasi bakteri dari tanah pada perakaran tanaman obat dari gunung Bugis dan desa Tudu-Aog. Populasi bakteri dari tanah (x105 CFU/g tanah) No. Perakaran tanaman

1. Magnolia sp. 12 8 26 4 2. Cyathea sp. 9 9 72 9 3. Quercus sp. 8 5 14 6 4. Cempaka kuning 10 5 28 5 5. Suku Liliaceae 14 11 63 10 6. Agathis celebica 16 4 5 7 7. Caryota sp. 8 3 13 8 8. Saurauia sp. 9 7 14 19 9. Magnolia sp. 6 9 8 11 10. Suku Clusiaceae 7 11 9 15 11. Suku Euphorbiaceae 7 19 12 5 12. Mallotus sp. 8 34 7 7 13. Andropogon sp. 26 21 5 11 14. Coleus aromaticus 8 11 16 16 15. Euphorbia paniculata 12 9 13 4 16. Crotalaria sp. 12 4 6 2 17. Tanpa tanaman 5 2 4 1