MEMPELAJARI KULTUR ANTERA GALUR MUTAN CABAI MERAH KERITING (Capsicum annum. L) SECARA IN-VITRO
(Anther Culture Study of Red Chili Mutant Lines through In Vitro Technique)
Azri Kusuma Dewi 1) dan Ita Dwimahyani 2)
Abstract
Study on anther culture from red chili mutant lines (Capsicum annuum.L) using in vitro technique was carried out based on formation of callus and green spot from chili anther culture. Two kinds of different media based on hormonal composition were used for callus induction. A half of anthers quantities were directly cultured on callus induction medium, while rest of them were treated with cold shock (4oC) for 3 and 6 days subsequently cultured on callus induction medium. The highest callus formation was observed in culture from Ac medium containing 1 mg/l 2,4-D and 0,1 mg/l kinetin and were obtained from 0 days cold shock Kr 0 30%, Kr 20 25% and Kr 40 30% respectively. While cold shock for 3 days increasing 15% callus formation from Kr 40 mutant lines.
I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Capsicum annuum L atau cabai merupakan tanaman hortikultura semusim yang mempunyai nilai ekonomi (Barany et al. 2001). Belakangan ini produksi cabai terus meningkat terutama di negara-negara berkembang dan yang sedang berkembang baik di
benua Afrika maupun Asia (Deptan go.id, 2006). Di Indonesia cabai termasuk komoditas
hortikultura bernilai ekonomi yang dapat dikonsumsi baik sebagai rempah maupun untuk
sayuran. Permintaan cabai di Indonesia diproyeksikan meningkat setiap tahunnya
sehingga impor harus dilakukan kalau produksi dalam negeri tidak dapat terpenuhi (BPS,
2000).
Salah satu varietas cabai yang banyak dibudidayakan di Indonesia adalah cabai
merah keriting. Perbaikan varietas cabai merah keriting seperti ketahanan terhadap
penyakit dapat dilakukan melalui aplikasi teknologi mutasi dan teknik kultur jaringan
sehingga akan memberikan nilai tambah untuk program pemuliaan, terutama dalam usaha
meningkatkan kualitas dan kuantitas produksi cabai secara optimal. Salah satu metoda
dalam kultur jaringan yang banyak digunakan untuk menunjang kegiatan pemuliaan
tanaman adalah kultur antera. Tanaman haploid ganda yang dihasilkan dari kultur antera1
1) , 2)
dapat mencapai homozigot pada generasi kedua. Hal ini akan mempersingkat waktu2
seleksi jika dibandingkan dengan pemuliaan secara konvesional (Morrison dan Evans,
1988) disamping evaluasi karakter kuantitatif yang dapat dipercepat sehingga lebih
menghemat waktu dan tempat (Kasha dan Maluszynski, 2003).
Keberhasilan aplikasi teknik kultur antera dalam mendapatkan tanaman haploid
ganda pada tanaman cabai masih sedikit yang dilaporkan (Wang et al, 1973., Novak FJ,
1974., serta Mityko et al.,1999; Dolcet-Sanjuan et al.,1997 dan Gyulai et al., 2000 dalam Barany et al.,2001). Rendahnya frekuensi regenerasi tanaman yang berasal dari kultur antera disebabkan sulitnya memperoleh kalus embriogenik. Sibi et al (1979) telah
melakukan penelitian mengenai androgenesis dari haploid organ untuk mendapatkan
tanaman haploid ganda, tetapi belum berhasil mendapatkan tanaman yang diinginkan.
Rendahnya frekuensi pembentukan kalus embriogenik dari kultur antera cabai merupakan
salah satu kendala dalam menghasilkan tanaman haploid ganda. Untuk mengatasi hal
tersebut mungkin perlu dilakukan suatu perlakuan awal sebelum antera cabai di induksi
pada media pembentukan kalus. Salah satu perlakuan awal yang pernah dilakukan pada
kultur antera padi adalah dengan memberi perlakuan stres dingin selama 2-3 hari pada
antera sebelum dikultur dan hasilnya menunjukkan dapat memperbaiki frekuensi
pembentukan kalus embriogenik (Qu dan Chen, 1983, Rackoczy et al, 1997, Ishak dan
Ita Dwimahyani, 1997). Disamping itu respon dari masing-masing genotipe tanaman
sangat berbeda antara satu genotipe dengan genotipe lainnya.
1.2. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh variasi hormon tumbuh dan
perlakuan awal stres dingin terhadap frekuensi pembentukan kalus dan spot hijau dari
kultur antera galur mutan cabai merah keriting.
1.3. Hipotesis
Pemberian hormon tumbuh yang berbeda dan perlakuan stres dingin berpengaruh
terhadap pembentukan kalus dan spot hijau dari antera galur mutan cabai merah keriting.
II. TINJAUAN PUSTAKA
Cabai (Capsicum spp.) merupakan sayuran dan rempah paling penting di dunia (Bosland, 1996). Genus Capsicum berasal dari dunia baru, spesies C. annuum dari Meksiko dan spesies lain (C. frutescens, C.baccatum, C. chinense, dan C. pubescens) dari
Amerika Selatan. Oleh pedagang Portugis dan Spanyol, cabai diintroduksikan ke Asia
pada abad ke-16, dan spesies cabai pedas tersebar paling luas di Asia Tenggara (Sanjaya
L dkk. 2002). Lebih dari 100 spesies Capsicum telah diidentifikasi. Lima spesies di
antaranya telah dibudidayakan, yaitu C. Annuum, C. chinense, C. frutescens, C.
pubescens, dan C. baccatum (Vagera, 1990). Klasifikasi spesies-spesies ini didasarkan
pada karakter morfologi, terutama morfologi bunga (Heiser dan Smith, 1953). Cabai
dalam bentuk kering biasanya digunakan sebagai bumbu dapur, dengan rasa dan aroma
spesifik yang disebabkan oleh kandungan capsaicin alkaloid didalamnya. Pada cabai
terkandung beberapa vitamin seperti B1, B2, C dan P yang cukup tinggi jika
dibandingkan dengan sayuran lainnya. Dewasa ini tanaman cabai sudah ditanam
dihampir seluruh bagian dunia. Kegunaannya baik sebagai bumbu masakan dan
penghangat badan sangat diperlukan oleh seluruh lapisan masyarakat (Vagera, 1990).
Seperti tanaman hortikultura lainnya kestabilan produksi cabai juga dipengaruhi
oleh serangan hama dan penyakit. Pemberantasan hama dan penyakit pada tanaman cabai
merupakan salah satu pemeliharaan tanaman yang cukup penting. Banyak jenis hama,
serangga dan kutu daun yang sangat membahayakan kesehatan tanaman dan bahkan
dapat menggagalkan pembuahannya. Penggunaan pestisida adalah salah satu alternatif
pencegahan namun pemberantasan dengan pestisida memerlukan tambahan biaya yang
besar. Penggunaan varietas yang resisten adalah sangat ideal karena dapat menekan biaya
budidayanya (Sunaryono H, 2000).
Pemuliaan cabai pertama dilakukan di Amerika tropis untuk kultivar cabai manis,
untuk cabai pedas pemuliaan baru berkembang akhir-akhir ini. Informasi keragaman
genetik merupakan dasar untuk mengembangkan strategi pemuliaan tanaman (Sanjaya
dkk. 2002). Aplikasi pemuliaan mutasi adalah salah satu cara untuk merakit suatu varietas
baru. Dengan penggunaan radiasi sinar gamma akan memperluas keragaman genetik
yang ada. Kombinasi teknik mutasi dengan kultur jaringan akan mempercepat
III. BAHAN DAN METODA
Persiapan antera cabai
Antera cabai yang digunakan berasal dari galur mutan cabai merah keriting yaitu
Kr20, Kr40 dan Kr0 sebagai kontrol yang berumur 30-40 hari dari saat tanaman mulai
berbunga hingga antera sudah muncul ke permukaan. Sebagian antera diberi perlakuan
dengan stres dingin pada temperatur 4oC dengan variasi perlakuan 3 hari dan 6 hari,
sedangkan sebagian antera lainnya langsung di kultur pada dua jenis media induksi kalus.
Media untuk induksi pembentukan kalus
Media pembentukan kalus yang digunakan adalah media dasar MS (Murashige
dan Skoog, 1962) yang terdiri dari unsur-unsur makro dan mikro kemudian ditambahkan
0,5 mg/l asam nikotinat, 0,5 mg/l pyridoxin, 0,5 mg/l thiamin HCl, 9 gr/l bacto agar, dan
40 gr/l sukrosa. Media dibagi dalam dua jenis berdasarkan komposisi hormon tumbuh
yang digunakan, yaitu media Ac yang terdiri dari 1 mg/l 2,4 D dan 0,1 mg/l kinetin dan
media Bc yang terdiri dari 1 mg/l NAA dan 0,1 mg/l kinetin.
Kultur antera cabai
Antera cabai disterilkan dengan HgCl2 (0,05%) selama 20 menit, kemudian
dibilas tiga kali dengan air suling steril. Bunga yang masih muda (kuncup) dilepaskan
dari tangkainya dengan menggunakan skalpel. Selanjutnya mahkota bunga yang masih
kuncup itu dibuka dan antera cabai yang berwarna hijau dan keunguan tersebut dilepas
satu persatu. Kemudian antera cabai tersebut diinduksikan pada kedua media dalam
cawan petri. Setiap cawan petri berisi 20 antera dan masing-masing perlakuan
menggunakan tiga kali ulangan.
Media regenerasi antera
Kalus yang sudah terbentuk pada media induksi dipindahkan ke media regenerasi
untuk merangsang pembentukan spot hijau. Komposisi media regenerasi kalus hampir
sama dengan media untuk induksi kalus perbedaan hanya terletak pada komposisi
hormon tumbuh yang digunakan yaitu 1 mg/l BAP dikombinasikan dengan 0,05 mg/l
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Antera cabai yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari tanaman yang
berumur 30-40 hari dari waktu pembungaan sampai pada saat antera sudah muncul ke
permukaan. Antera cabai ini berasal dari galur mutan cabai merah keriting yaitu Kr20,
Kr40 dan Kr0 sebagai kontrol. Dari hasil evaluasi karakter morfologi galur-galur mutan
tanaman yang digunakan untuk kultur antera ini sudah memperlihatkan keragaman
(Tabel 1.). Oleh sebab itu aplikasi teknik kultur antera akan mempercepat proses
homogenisasi dari galur mutan yang terseleksi.
Tabel 1. Evaluasi keragaman morfologi galur mutan cabai keriting di lapangan
No Genotipe Jumlah
Hasil pengamatan secara in vitro memperlihatkan antera cabai mulai pecah satu
minggu setelah diinduksi pada media kalus. Selanjutnya beberapa antera mulai
mengalami pembengkakan dan dinding-dindingnya mulai membuka. Kalus dari beberapa
antera mulai terbentuk 3-4 minggu setelah diinduksi. Pertumbuhan kalus ditandai dengan
pecahnya kelopak antera cabai yang diakibatkan oleh hasil pembelahan sel-sel
mikrospora cabai yang tumbuh menjadi massa sel. Namun tidak semua antera cabai yang
pecah mempunyai kemampuan untuk membesar membentuk kalus. Beberapa komponen
termasuk hormon tumbuh yang digunakan dalam media induksi mempunyai peranan
terhadap perkembangan jaringan kalus tersebut. Berdasarkan penelitian yang dilakukan
diperoleh hasil bahwa penggunaan hormon 1 mg/l 2,4 D yang dikombinasikan dengan 0,1
mg/l kinetin pada media Ac lebih cocok untuk merangsang pembentukan kalus
dibandingkan dengan kombinasi hormon tumbuh pada media Bc.
Persentase pembentukan kalus tertinggi diperoleh pada media Ac, dimana hampir
semua genotipe memberikan respon yang baik yaitu berturut-turut 30% pada Kr0, 25%
yang diberikan pada antera cabai menunjukkan hasil nyata terhadap frekuensi
pembentukan kalus hanya pada genotipe Kr40, dimana terjadi peningkatan persentase
pembentukan kalus sebesar 15% dengan pemberian stres dingin selama tiga hari pada
media Ac (Gambar 1.). Dari Gambar 1. juga terlihat bahwa pemberian stres dingin
selama enam hari umumnya menunjukkan penurunan pembentukan kalus pada semua
genotipe. Berdasarkan grafik pembentukan kalus pada media Bc (Gambar 2.) terlihat
perlakuan awal dengan stres dingin selama tiga hari menunjukkan hasil yang tidak jauh
berbeda dengan tanpa perlakuan sedangkan perlakuan enam hari stres dingin cenderung
menurunkan frekuensi pembentukan kalus, selain itu tidak satupun genotipe yang mampu
membentuk kalus pada media ini.
Tabel 2. Persentase pembentukan kalus dengan variasi stres dingin pada media Ac dan Bc.
No Genotipe
Media Ac
Pembentukan kalus (%)
Media Bc
Pembentukan kalus (%)
0 hari 3 hari 6 hari 0 hari 3 hari 6 hari
1 Kr0 30 15 10 10 10 0 (mati)
2 Kr20 25 15 5 5 10 0 (mati)
3 Kr40 30 45 5 15 5 0 (mati)
Tingginya persentase pembentukan kalus pada media Ac dapat disebabkan oleh
komposisi hormon tumbuh yang digunakan. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa
pembentukan kalus pada kedua jenis media tidak serentak dan memerlukan waktu sekitar
3-4 minggu. Hal ini dimungkinkan oleh lamanya penetrasi media ke dalam kelopak
antera untuk merangsang pembelahan sel-sel mikrospora. Menurut Mercy dan Zapata
(1987), posisi antera selama kultur in-vitro juga turut mempengaruhi frekuensi
pembentukan kalus dimana antera yang dikultur dengan posis miring dan salah satu
ujungnya menyentuh media akan memberikan hasil yang lebih baik terhadap
0
Gambar 1. Grafik persentase pembentukan kalus pada media Ac
0
Gambar 2. Grafik persentase pembentukan kalus pada media Bc
Mikro kalus yang terbentuk pada kedua jenis media secara berangsur-angsur
berubah menjadi massa kalus (Gambar 3 dan 4). Pengamatan di bawah mikroskop stereo
menunjukkan ada dua tipe kalus yang terbentuk yaitu kalus yang berwarna putih dan
tidak kompak yang ternyata bersifat non embriogenik sehingga tidak mempunyai
kemampuan untuk berdiferensiasi membentuk pucuk. Tipe kalus ini ditemukan pada
genotipe Kr0 dan Kr20 yang kemudian tidak mampu untuk tumbuh lebih lanjut.
Sedangkan tipe yang kedua yaitu kalus berwarna putih kekuning-kuningan (Gambar 4),
kompak dan bersifat embriogenik, sehingga mempunyai kemampuan untuk beregenerasi.
Perkembangan selanjutnya kalus ini membentuk spot hijau tetapi tidak membentuk
pucuk.
Frekuensi pembentukan kalus dari kultur antera sangat tergantung dari genotipe
dan media induksi yang digunakan (Rackoczy et al, 1997). Qu dan Chen (1983)
menyatakan bahwa pembentukan kalus juga dipengaruhi oleh perlakuan awal yang
diberikan pada eksplan yang akan digunakan seperti stres dingin dan komposisi media
tumbuh kultur antera (Goldberg et al, 1993; Xie et al, 1995; Sun dan Huang, 1990).
Namun Chen (1988) dan Henry et al (1994) menyatakan bahwa genotipe dari tanaman
donor lebih memegang peranan penting terhadap kultur antera. Pemilihan genotipe
sebagai sumber eksplan untuk mempelajari induksi kalus dan regenerasi tanaman dari
kultur antera cabai sangat penting.
Dari hasil yang ditunjukkan di atas mengindikasikan bahwa genotipe Kr40
mempunyai kemampuan untuk membentuk kalus yang lebih baik dibandingkan dengan
genotipe lainnya. Perlakuan stres dingin pada antera cabai sebelum diinduksi ternyata
dapat meningkatkan persentase pembentukan kalus sebagaimana pemberian perlakuan
panas pada suhu 35oC selama 8 hari yang dilakukan oleh Barany et al (2001) pada cabai
varietas Yolo Wonder B.
Pertumbuhan kalus pada media regenerasi menunjukkan hanya genotipe Kr40
yang mampu membentuk spot hijau yaitu sebesar 15%, sedangkan genotipe yang lainnya
mati (Tabel 3.). Frekuensi pembentukan kalus yang tinggi tidak menjamin diperolehnya
kalus embriogenik yang banyak. Kombinasi hormon tumbuh yang tepat dalam media dan
genotipe dari tanaman donor dapat meningkatkan pembentukan kalus embriogenik (Ishak
dan Dwimahyani, 1997).
Tabel 3. Persentase pembentukan spot hijau pada media regenerasi
No Genotipe Tipe kalus Pembentukan spot hijau (%)
1 Kr0 Non Embriogenik 0 (mati)
2 Kr20 Non Embriogenik 0 (mati)
Gambar 3. Tipe kalus nonembriogenik pada kultur antera mutan cabai keriting (C.annuum)
Gambar 4. Tipe kalus embriogenik pada kultur antera mutan cabai keriting (C.annuum)
V. KESIMPULAN
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa pemakaian
media Ac mempunyai kemampuan untuk memperoleh persentase kalus yang lebih tinggi
yaitu berturut-turut Kr0 30%, Kr20 25% dan Kr40 30% pada kondisi tanpa perlakuan
stres dingin (0 hari) jika dibandingkan dengan media Bc. Perlakuan awal dengan stres
dingin selama tiga hari dapat meningkatkan frekuensi pembentukan kalus dan spot hijau
DAFTAR PUSTAKA
Barany, I, et al. 2001. Microspore-derived embryogenesis in pepper (Capsicum annuum L.): subcellular rearrangements through development. Biol. Cell
(2005) 97, 709–722.
BPS. 2002. Survei pertanian produksi tanaman pangan dan sayuran di Indonesia. Biro Pusat Statistik. 185-199.
Chen,Y. 1988. In vitro development of plant from microspores of rice. In Hu H and Hen.Y (eds); Plant somatic genetics and crop improvement. Beijing Univ. Press.27-67.
Deptan.go.id. 2006. Penyakit umum pada tanaman cabai.
Goldberg, RB., TP Beals., and PM Sanders. 1993. Anther development : Basic principles and practical applications. The Plant Cell. 5: 1217-1229.
Heiser CB, and PG Smith. 1953. The cultivated capsicum peppers. Econ. Bot. 7: 214-226.
Sunaryono H. 2000. Budidaya cabe merah. Sinar Baru Algensindo, Bandung.
Henry,Y., Vain P and De Busyer, J. 1994. Genetic analysis of in vitro plant tissue culture responses and regeneration capacities. Euphytica. 79:45-58.
Ishak dan Ita Dwimahyani. 1997. Induksi kalus dan regenerasi tanaman dari kultur antera padi varietas Arias. Jurnal Bioteknologi Pertanian. Vol 2: 44-48. Kasha, KJ and M, Malunszynski. 2003. Production of doubled haploids in crop plants.
An introduction, In doubled haploid production in crop plants, A manual. Kluwer Academic Publisher.1-19.
Sanjaya L dkk. 2002. Keragaman ketahanan aksesi Capsicum terhadap antraknose (Colletotrichum capsici) berdasarkan penanda RAPD. Jurnal Bioteknologi Pertanian, Vol. 7, No. 2, pp. 37-42.
Mercy, ST and FJ, Zapata.1987. Position of anthers at plating and its influence on anther callusing in rice. Plant Cell Reports. 6:318-319.
Morrison, RA and DA, Evans.1988. Haploid plant from tissue culture; New plant varieties in a shortened time frame. Bio Technology. 6 : 684-690.
Murashige, T and F, Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15:473-497.
Novak, FJ. 1974. Induction of a haploid callus in anther cultures of Capsicum sp. Z Pflanzenzucht. 72: 46-54.
Wang, YY., Sun, CS., Wang, CC and Chien, NF. 1973. The induction of pollen plantlets of Triticale and Capsicum annuum from anther culture. Sci sin. 16:147-151.
Xie, J., M, Gao., Q, Cai., X, Cheng., Y, Shen and Z, liang. 1995. Improved isolated microspore culture efficiency in medium with maltose and optimized growth regulator combination in Japonica rice (Oryza sativa, I). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 42:245-250.
