Penelitian ini bertujuan untuk iriengetahui sifat-sifat fisik, kimia dan biologi virus Orf isolal B7 yang telah diisolasi dan diadaptasikan tumbuh secara in vitropada kultur sel . Virus Orf isolal B7 yang telah tumbuh berulangkali pada kultur sel paru-paru janin domba diberi perlakuan secara terpisah meliputi beku pada sulut -200C clan cair suhu kamar 260C yang dilanjutkan dengan pemberian getaran ultrasonik; filtrasi melalui berbagai ukuran filter niikro; pemberian iododeoxyuridine (IDU) ; pemberian chloroform-, pemberian ether; perlakuan untuk kondisi pH asam; perlakuan untuk kondisi pH basa; serta pencanipuran dengan butir darali merah (BDM; beberapa spesies hewan. Virus Orf yang telah mendapatkan masing-masing perlakuan tersebul kemudian diamati aktivitasnya atau pertunibuliannya pada kultur sel . Hasil penelitiar memperlihatkan bahwa virus Orf isolat B7 taltan terhadap perlakuan beku-cair dan getarar ultrasonik, virus tidak dapat tnenetnbus saringan tnikro 0,1 iult, sensitif terhadap iododcoxytiridine (IDU), sensitif terhadap chloroform, serta sensitif terhadap kondisi pH 3 . Sebafknya vines Or tahan terhadap ether, clan tahan terhadap kondisi pH 9. Venis Orf isolat B7 tidak inengagglutinas, butir darah merah (BDM) domba, kambing, kuda, marmot, kelinci dan ayani.
Kata kunci : Virus, orf, karakteristik
Virus Orf adalah penyebab penyakit Orf pada ternak domba dan kainbing. bersifat sanga menular, dan ditandai dengan gejala khas benipa bungkttl-bungkttl berkeropeng pacla unulutlbibir Virusnya termasuk ke dalam golongan vinis parapox, dari keluarga virus poxviriclac (F,\I~tx~I rdar MAYO, 1991).
Penyakit Otf tersebar di selunih dunia, termasuk Indonesia. Di luar negeri agen penyebal penyakit Orf telah lama dipelajari dan vinusnya telah berhasil diisolasi (Aimussm .nn-t, 1958
PLOWRIGHT et at., 1959 ; MACDONALD datl BELL, 1961 ; SAWHNEY, 1972 ; PIo-:C:\tls"rA dal STELLMANN, 1973 ;RENSHAW clanDODD, 1978; RAO dalt MALIK, 1982) . Di Indonesia keberadaal
penyakit Orf pada ternak domba dan kambing sudah sejak lama diketahui (VAN Di;izLAAN, 1919)
Namun, studi yang intensif tentang penyakit dimulai sejak taltun 1984 (SENDt)W et a/., 1984 ADJID dan RONOHARDJO, 1987; ADJID, 1989; ADJID datt MANGtTNWIRY(), 1991 : AD.111), 1991 ADJID dan SUDIBYO, 1992 ; ADJID, 1992). ADHD (1992) melaporkan pertatttakali keberliasilai
pengisolasian virus Orf isolat lokal pada kultur sel .
Deskripsi sifat-sifat virus yang telah diisolasi sangat diperlukan, terutania berkenaan dengat sifat-sifat fisik, kimia dan biologi. Dengan diketahuinya sifat-sifat tersebut ntaka pelestarian dai pemeliharaan virus tadi pada kondisi laboratorium dapat dilakukan secara optimal untuk berbaga tujuan.
910
SeminarNasional Peternakan dam Veteriner 1998
KARAKTERISASI SIFAT-SIFAT FISIK, KIMIA DAN BIOLOGI VIRUS
ORF ISOLAT B7 YANG TELAH BERADAPTASI TUMBUH IN VITRO
PADA KULTUR SEL
R.M.A. ADED Balai Penelitian VeterinerJalan R.E. Martadinata No. 30, P.O. Box 115, Bogor 16114 ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat fisik, kimia, dan biologi virus Orf isolat lokal yang telah berhasil diisolasi pada kultur sel, sebagai informasi dasar virologik yang diperlukan dalam rangka penelitian dan pelestarian virus sebagai plasma nutfah vetcriner.
Virus Orf
Biakan sell
Uji filtrasi
MATERI DAN METODE
Virus Orf isolat lokal B7 yang telah tumbuh dan beradaptasi pada kultur sel primer paru-paru janin domba(ADJID, 1992) digunakan dalam penelitian ini. Virus ini telah ditumbulikan sebanyak
10 siklus pada kultur sel primer paru-paru dan glnjal janin domba. Virus tersebut bcrsifat sitopatik (sifat pertumbuhannya menyebabkan kelainan patologis pada kultur sel).
Kultur sel primer paru-paru janin domba dan sel lestari bovine turbinate (BT) digunakan dalam memperbanyak virus, serta dalam mengukur kandungan virus yang diproduksi pads biakan sel. Kultur sel tersebut ditumbulikan dengan menggunakan media Dulbecco Afinimal
l
asential Medium (DMEM) dengan kandungan 5% Foetal CalfSerum (FCS), 2,5 ltg Amphotcricin B per mlserta 200 iu campuran penisilin-streptomisin per nil.
Tiga mL suspensi virus yang telah sentrifgasi pada putaran 1 .000 g selama 10 menit digunakan sebagai contoh untuk uji filtrasi. Suspensi tersebut dilewatkan pada filter mikro berukuran 0,22 mp, dan 0,1 mp. Filtrat yang diperoleh dari masing-masing perlakuan kemudian dititrasi kandungan virusnya mengikuti prosedur standar(COTTRAL, 1978).
Pengaruh perlakuan beku-cair, dan getaran ultrasonik terhadap infektititas virus secara in vitro
Satu stok suspensi virus yang telah disentrifitgasi pada putaran 1 .000 g selama 10 menit digunakan dalam kegiatan ini. Dua mL suspensi stok tadi diambil pada setiap antara setelah perlakuan beku-cair yang dilakukan sampai 4 kali siklus. Satu mL dari masing-masing contoh tersebut kemudian ditempatkan dalam tabung dan diberikan perlakuan getaran ultrasonik pada amplitudo 30 4 selama 5 detik (Sonifier cell disruptor, Branson sonic Power Company, Connecticut). Perlakuan getaran ultrasonik dilakukan dengan menempatkan tabung berisi suspensi virus dalam baki berisi batu es. Setelah itu seluruh contoh suspensi tersebut disentrifugasi pada putaran 1 .000 g selama 10 menit, yang kemudian dititrasi kandungan virusnya.
Pengaruh iododeoxyuridine (IDU) terhadap daya tumbuh virus
Kultur sel lestari BT ditumbulikan dalam plat plastik steril yang mcmiliki 2-4 lubang (Costar®). Setelah sel diinkubasikan selama semalam, media sel diganti dengan media sel yang baru mengandung 2% FCS. Pada 4 lubang ditambalikan 100 lig IDU per mL media. Dari 4 lubang, 2 lubang ditambalikan 100 pL suspensi virus Orf yang mengandung virus 100 CCID; per 50 ltL. Sedang sisanya 2 lubang tidak ditambah suspensi virus sebagai kontrol perlakuan . Pada plat yang sama 2 lubang tidak ditambah IDU dan tidak ditambah suspensi virus, serta 2 lubang tidak ditambah IDU tetapi ditambah suspensi virus. Kemudian plat tersebut diinkubasikan pada 37°C. Ketika kultur sel tanpa IDU yang diinfeksi oleh suspensi virus Orf memperlihatkan tanda-tanda
Seminar Nasional Peternakan dan Veteriner 1998
sitopatik pada sel dengan kadar 80% sampai 90%, kultur set dalain seruua lubang dipanen. Pemanenan kultur sel dilakukan dengan pengerokan lapisan set yang dilanjutkan dengan perlakuan beku-cair suspensi sel sebanyak 3 kali . Suspensi set kemudian dijernilikan dengan cara pemutaran pada 1.000 g selama 10 merit (Beckman TJ-10). Cairan atas suspensi lalu dikoleksi. Suspensi virus yang diperoleh kemudian dititrasi terhadap kandungan virtsnya. Adanya pengaruh perlakuan diukur berdasarkan titer virus. Virus Infectious Bovine Rhinotracheilis (IBR, Strain Colorado, JCU, Tonwsville) dan Enterovirus (Enterovinis 66/27, JCU, Townsville) diikutsertakan pada pengaruh IDU sebagai pembanding positif dan negatif pada uji ini.
Pengaruh ether terhadap pertumbuhan virus
Dua mL suspensi virus masing-masing ditempatkan dalam 4 botol bijou . Terhadap 2 botol bijou ditambahkan 0,5 mL diethyl ether (Merck). Dua botol lainnya tidak diberi ether. Botol tersebut kemudian diinkubasikan selama 1 jam pada suhu 4°C. Setiap 15 unenit botol dikocok untuk mencampur ether dan virus. Botol yang diberi ether dan yang tidak diberi ether (kontrol) kemudian disimpan pada suhu 4°C selama semalam. Suspensi virus tadi kemudian dituangkan pada cawan petri dan dibiarkan beberapa saat dalam ruangan kabinet biohazard sehingga ethernya habis menguap. Kedua Suspensi virus tersebut (perlakuan dan kontrol) kemudian diukur kandungan virusnya dengan cara titrasi virus.
Pengaruh chloroform terhadap pertumbuhan virus
Satu mL suspensi virus ditempatkan masing-masing dalam 4 botol bijou . Terhadap dua botol tersebut ditambahan 0,05 niL chloroform (Ayax Chemical), kemudian dikocok secara periodik selama 10 menit. Baik suspensi virus yang diberi cairan chloroform dan tidak (konlrol), diputar pada 1 .000 g selama 10 menit. Cairan atas dari kedua contoh tadi diambil dan kandungan vinisnya dititrasi.
Pengaruh pH asam terhadap days tumbuh virus
Pengaruh pH asain terhadap virus Orf dilakukan sebagai berikut: dalam suatu tabung 0,5 niL suspensi virus Orf dicampurkan dengan 2 mL media sel pH 2,5, sehingga pH akhirnya menjadi 3 . Sebagai kontrol, 0,5 mL suspensi virus Orf ditambahkan pada 2 nil- media set pH 7,2. Kedua suspensi virus tersebut kemudian diinkubasikan pada 37°C. Pada jam ketiga setelah inkubasi, dari kedua suspensi tersebut diambil contohnya dlla ulangan masing-nlaslng sebanyak 0,5 niL. Untuk suspensi virus yang diperlakukan asam, suspensi tersebut ditambahkan 0,5 nil- media set pH 9,5. Sebagai kontrol, suspensi virus ditambah dengan 0,5 niL media set pH 7,2. Kedua jenis contoh suspensi tersebut (perlakuan dan kontrol) kemudian dititrasi kandungan virusnya .
Pengaruh pH basa terhadap daya tumbuh virus
Pengaruh pH basa terhadap virus dilakukan sebagai berikut: dalani sualu tabung 0,5 niL suspensi virus ditambahkan dengan 2 mL media set pH 9,5 sehingga pH akhirnya menjadi 9. Sebagai kontrol, dalam suatu tabung 0,5 niL suspensi virus ditambahkan pada 2 niL media set pH 7,2 . Kedua suspensi virus tersebut kemudian diinkubasikan pada 37°C. Pada jam ke tiga setelah inkubasi, dari kedua suspensi tersebut diambil contohnya sebanyak 2 ulangan masing-masing 0,5 mL. Untuk suspensi virus yang diperlakukan basa, suspensi tersebut ditambah dengan 0,5 mL media sel pH 2,5. Terhadap kontrol, suspensi virus ditambah dengan 0,5 niL media set pH 7,2. Keduajenis contoh suspensi tersebut kemudian dititrasi kandungan vinisnya.
Uji agglutinasi virus terhadap butir darah merah (BDM) hewan
Lima puluh pL suspensi virus yang telah diencerkan dua kali secara seri dalam larutan penyangga fosfat (PBS) pH 7,2 ditempatkan pada cawan mikro. Lima puluh FLl_ suspensi 0,5% butir darah merah (BDM) masing-masing dari domba, kambing, kuda, marmot, kelinci dan ayam ditambahkan pada plat mikro yang mengandung suspensi virus tersebut dengan 4 ulangan. Suspensi 0,5% BDM dari masing-masing spesies tanpa suspensi virus digunakan sebagai kontrol . Plat mikro tersebut kemudian ditempatkan pada suhu kamar. Suspensi tersebut kemudian diamati setiap 30 merit terhadap adanya reaksi agglutinasi BDM oleh virus. Pengamatan dilakukan sampai suspensi 0,5% BDM kontrol memperlihatkan adanya pengendapan lengkap.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penelitian dapat dilihat pada Tabel 1 dan 2 . Dari tabel-tabel tersebut terlihat bahwa virus Orf isolat B7 sensitif terhadap bahan kimia iododeoayuridine (IDU), chloroform, dan pH asam. Virus tersebut agak tahan terhadap ether, serta tahan terhadap pH basa. Virus Orf B7 tahan terhadap perlakuan beku-cair dan getaran ultrasonik, serta tidak dapat menembus saringan mikro 0,1 mp, tetapi dapat menembus saringan mikro 0,22 m~t. Virus Orf isolat B7 tidak unengagglu-tinasi butir darah merah (BDM) dari liewan domba, kambing, kuda, marmot, kelinci dan ayam .
IDU merupakan bahan kimia yang dapat mengganggri proses replikasi DNA. Tidak tumbuhnya virus Orf yang dicampur dengan bahan kimia tersebut nrenunjukkan bahwa virus tersebut memiliki DNA yang sangat diperlukan untuk kelangsungan hidupnya.
MITCHINER (1969) telah mendemonstrasikan bahwa ether tidak mampu mcrusak lapisan
pelindung bagian luar (envelope) virus Orf. Sebaliknya chloroform menusak lapisan tersebut . Ini merupakan alasan mengapa virus Orf isolat B7 secara cepat dapat diinaktifasi olch adanya chloroform, tetapi tidak oleh ether.
Hasil penelitian memperlihatkan bahwa virus Orf isolat B7 tahan terhadap pH basa, tetapi sensitif terhadap pH asam. Alasan pasti behim diketahui, tetapi yang jelas bahwa virus tersebut menjadi inaktif Data-data ini memberikan informasi bahwa dalam penreliliaraan virus Orf isolat B7 harus dihindari kondisi pH yang rendah. Data-data ini juga menipcrliliatkan untuk menghapushamakan lingkungan (kondisi di laboratorium) yang tercemar virus Orf dapat digunakan cairan dengan derajat keasaman sama atau kurang dari pH 3 .
Virus Orf isolat B7 ternyata tidak iemiliki antigen permukaan yang dapat mengagglutinasi butir darah merah beberapa spesies hewan meliputi hewan domba, kambing, kuda. niannot, kelinci dan ayam. Dengan demikian dapatlah diketahui bahwa pengenubangan uji diagnosis mmenggunakan sel darah merah sebagai indikator langsung tidak dapat dilakukan . Pengenubangan uji diagnosis menggunakan reaksi agglutinasi secara tidak langsung mungkin saja dapat dilakukan seperti halnya yang dilakukan olehMAEDAdan ScoTT(1985).
ADJID(1992) melaporkan bahwa virus Orf isolat B7 berbentuk ellips, berukuran sekitar 266f
37,68 nm panjang dan 139 f 17,78 nm lebar. Dengan demikian tidaklall menglierankan kalau
virus tersebut dapat melewati saringan mikro berukuran 0,22 mp, tetapi tidak untuk filter berukuran 0,1 mp. Namun demikian data-data ini memperlihatkan bahwa penyaringan dengan saringan mikro ukuran 0,22 rn~t dapat menuninkan titer virus seratus kali lipat, yang menyarankan umuk tidak menggunakan ukuran mringan tersebut bagi keperluan dekontaininasi atau penuirman virus.
3. Iododeoxyuridine (DU)
914
Seminar Nasional Peternakan dan Veteriner 1998
Virus Orf isolat B7 tahan terhadap perlakuan proses beku-cair serta getaran ultrasonik. Data-data ini menunjukkan bahwa virus Orf sangat kuat. Sifat-sifat ini sangat menguntungkan, karena dapat mempermudah cara pemanenan virus dari sel yang terinfeksi dengan tcknik beku-cair . SAWHNEY (1972) juga melaporkan bahwa proses beku-cair biakan sel yang terinfeksi vines Orf dapat meningkatkan titer virus karena virusnya dapat keluar dari sel akibat pecalinya dinding sel.
- Isolat B7 - IDU - Kontrol - Virus IBR - IDU 0 t) - Kontrol 7,0 - Enterovinis - IDU 6,3 - Kontrol 6,8 4. Ether - Ether 2,1 - Kontrol 5,0 5. Chloroform - Chloroform 0 - Kontrol 6,0 6. pH - pH 3 - Jam ke-1 0 - Jam ke-3 0 - pH 9 - Jam ke-1 4,5 - Jam ke-3 5,2 - Kontrol - Jam ke-1 3,7 - Jam ke-3 4,7
Tabel 1. Perganih berbagai Perlakuan
1 . Uji filtrasi
perlakuan fisik dan kimia terhadap infektifitas virus Orf isolat lokal B7 Titer vines (Log,o per unl)
- Mikro filter 0,22 mg 3,7
- Mikro filter 0,10 mg 0
- Kontrol 5,7
2. Beku-cair dan ultrasonik
- 1 siklus 5,8
- 2 siklus 4,8
- 3 siklus 4,9
Tabel 2. Hasil uji agglutinasi virus Orf isolat B7 terhadap butir darah merah (BDM) berbagai jenis Hwan
0,5 % BDM Hwan Reaksi agglutinasi
1 . Domba negatif 2. Kambirg negatif 3. Kmda negatif 4. Kelinci negatif 5. Marmot negatif 6. Ayam negatif
Hasil penelitian di luar negeri memperlihatkan bahwa virus Orf sensitif terhadap IDU (PRECAUSTAclan STELLMANN, 1973); sensitif terhadap chloroform (PRECAUSTA dan STELLMANN, 1973); agak tahan terhadap ether (TRUEBLOOD dan CHOW, 1963; PRECAUSTA dan STELLMANN, 1973); tidak mengagglutinasi butir darah merah (ABDUSSALAM, 1958; BU-x'roN clan FRASER, 1977); serta tahan terhadap perlakuan proses beku-cair dan getaran ultrasonik (PLOWIZIGHTet al., 1959;SAWHNEY, 1972). Dari data-data ini terlihat bahwa secara umum sifat-sifit fisik, kinfia, clan biologi virus Orf isolat B7 memiliki kesamaan dengan sifat virus Orf yang telah diisolasi di luar negeri.
KESIMPULAN
Dari hasil penelitian ini disimpulkan bahwa virus Orf isolat B7 sensitif terhadap balian kimia iododeoxyuridine (IDU), chloroform, clan pH asam. Virus tersebut agak tahan terhadap ether, serta tahan terhadap pH basa. Virus Orf B7 talian terhadap perlakuan beku-cair dan getaran ultrasonik, tidak dapat menembus saringan mikro 0,1 In1I, tetapi dapat menembus saringan Inikro 0,22 mlt. Virus Orf isolat B7 tidak mengagglutinasi butir darah merah (BDM) dari Hwan domba, kambing, kuda, marmot, kelinci dan ayam. Sifat-fisik, kimia, dam biologi virus Orf isolat B7 ini secara umum memiliki kesamaan dengan virus Orf yang telah diteliti oleh penelili di luar negeri.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih atas bantuan IN M. Gorieti clan H. Auiyani yang telah menyediakan kultur sel untuk penelitian ini .
DAFTAR PUSTAKA
ABDUSSALAM,M. 1958. Contagious pustular dermatitis. IV.huununological reactions.J. Comp . Pailr.68:23-35 ADJID, A. clan P.RONOHARDJO . 1987. Uji agar gel presipitasi (AGP) untuk mendeteksi virus penyakit Orf.
Pentyakit HewanXIX(34):84-87
ADJID, A. 1989. Penyakit Orf di Jawa Barat: hifeksi alam clan buatan. Proceeding I'ertemuan Illniah Ruminansia, Cisania 8-10 November 1988. Pusat Penelitian clan Pengembangan Peteniakan, Bogor. pp. 123-128.
ADJID, R.M.A. clan H. MANGUNWIRYO. 1991 . Kejadian penyakit Orf pada teniak domba di Jawa Barat. Penyakit Hewan XXIII(4 l ):23-28.
ADJID, R.M.A. 1991 . Studi kasus beberapa wabah penyakit Orf pada kambing dan domba. Seminar Agroindustri Peternakan di Pedesaan. Ciawi, 10-11 Agustus 1992. Balai Penelitian 'I'eniak. Pusat Penelitian clan Pengembangan Peternakan, Bogor. Hal. 543-550.
Seminar Nasional Peternakan dan Veteriner 1998
ADIIIm, R.M.A. dan A. SUDIBYO. 1992. Identifikasi beberapa bakteri yang berperan sebagai infeksi sekunder pada kejadian penyakit Orf (dakangan). PenyakitHewan XXIV(44):71-75.
ADm, R.M.A. 1992. Studi penyakit Orf (dakangan) di Indonesia: Isolasi agen penyebab pada biakan sel domba. Penyakit Hewan XXIV(44):85-92.
BUXTON, A.S. and G. FRASER. 1977. Pox viruses. In : Animal Microbiology. Vol. II. (Eds. A. 13(IxrON and G. FRASER). Blackwell Scientific Publication Ltd. Edinburgh. pp. 677-693.
COTrRAL, G.E. 1978. Poxvirus. In: Manual ofStandardized Methodsfor Veterinary Microbiology. (Ed. G.E. CoTTRAL). Courstack Publ. Assoc. London. pp. 273-287
FAUQUET,. C.M. dan M.A. MAYO. 1991. Virusfamilies and groups. In Classification and Nomenclature of Viruses. Fifth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. (Eds. R.B . FRANCKI, C.M. FAUQUET, D.L. KNUDSON and F. BROWN). Archieves of Virology Supplement 2 . Springer-Verlag, Wien, New York. pp. 63-79.
MACDONALD, A. and T.M. BELL. 1961. Growth of contagious pustular dermatitis virus in human tissue culture. Nature 192:91-92
MAEDA, A.D. and G.R. SCOTT. 1985 . Use of indirect haemagglutination test to detect humoral antibodies of orfdisease. Indian. J. Exp. Biol. 23(1):65-67
MITCHINER, M.B. 1969. The envelope of vaccinia and orf vinises: An electron-chemical investigation. J. Gen. Virol. 5 :211-220
PLOwRIGHT, W., M.A.WITCON.18,and R.D. FERRIS. 1959. Studies with strain ofcontagious pustular dermatitis viruses in tissue culture. Arch. ges. Virusforsch. 9:214-231
PRECAUSTA, P., and C.H. STELLMANN. 1973 . Isolation and comparative study in vitro of 5 strains of contagious ecthyma of sheep. Zbl. Vet. Med. B. 20:340-355
RAO. M.V.S. and B.S. MALIK. 1982. Behaviour ofSheep Pox, Goat Pox and ContagiousPusttdarDermatitis Viruses in Cell Cultures. hid. Comp. Mic. hmn. & hif. Dis. 3:26-33
RENSHAW, H.W. and A.G. DODD. 1978. Serologic and cross inum inity studies with contagious ecthyma and goat pox vines isolates from Western United States. Arch. Virol. 56:201-210
SAWHNEY, A.N. 1972. Studies on the virus of contagious pustular dermatitis: Physico-chemical properties. Indian Vet. J. 49:14-19.
SENDOw, I, A. ADIID, TIANDRAGITA, L. PAREDE, dan H. MANGUNWIRYO. 1984. ISolasl dan Identifkasi virus Orf di hldonesia. Proceeding Pertemuan Ilmiah Penelitian Ruminansia Kecil 22-23 November 1983. Bogor.
TRUEBLOOD, M.S. and T.L. CHOW. 1963 . Characterisation of the agents of ulcerative dennatosis and contagious ecthyma. Ant. J. Vet. Res. 24:47-51
