i BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Alat dan Bahan 4.1.1 Alat
Alat-alat yang diguanakan dalam penelitian ini antara lain autoklaf TOMY ES-215, canning Electron Microscope (SEM) Jeol JSM-T300, spektrofotometri Serapan Atom (SSA) Perkin-Elmer 5100 PC, Vertical Laminar
Flow Cabinet ESCO, kromatogafi Gas-Spektrofotometri Massa (KG-SM/GC-MS)
Shimadzu QP 2010 S, cawan petri, kuas, mikroskop digital Olympus CX41, refraktometer, seperangkat alat gelas, piknometer, oven BINDER, timbangan digital G-200, preparat kaca, ose, inkubator MFI-250
4.1.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian antara lain adalah aquades, Na2SO4 anhidrat, NaNO3 (E.merck), CaCl2, MgSO4.7H2O, K2HPO4, NaCl, agar, amonium bikarbonat, sodium bikarbonat, disodium salt EDTA, CMC, arkopal, KHPO4, KCl, FeSO4.7H2O, Sukrosa, Tween 80 (E.merck) sebagai pengelmusi minyak, PDA (Potatoes Dextrose Agar), larutan Standar Cd 1000 ppm (E.merck), larutan Standar Pb 1000 ppm (E.merck), larutan Standar Cr 1000 ppm (E.merck), HNO3 pekat (E.merck), sampel minyak atsiri daun wangi lenabatu, sample lichens dan sample batu yang ditumbuhi lichenes
ii 4.2 Cara Kerja Penelitian
4.2.1 Ekstraksi dan analisis kandungan minyak atsiri daun sereh wangi a). Ekstraksi minyak atsiri sereh wangi lenabatu dengan destilasi uap dan air 1. Daun sereh wangi kering ditimbang sebanyak 25 kg, dimasukkan dalam
alat penyulingan atau ketel.
2. Penyulingan dimulai dengan menghidupkan kompor (dengan api kecil) selama 5 jam.
3. Minyak atsiri yang dikeluarkan yang masih bercampur dengan air dipisahkan dengan menggunakan corong pisah.
4. Minyak atsiri yang dihasilkan ditambah dengan Na2SO4 anhidrat.
5. Minyak atsiri yang dihasilkan diuji kualitasnya dengan KG-MS, refraktometer, dan rendemen.
b). Analisis kandungan minyak atsiri sereh wangi lenabatu dengan Kromatografi Gas- Spektoskopi Massa (KG-SM)
Kandungan minyak atsiri yang dihasilkan dianalisis dengan menggunakan KG-SM. Pengujian ini dilakukan guna mengidentifikasi secara kualitatif dan kuantitatif dari komponen individual dalam senyawa campuran komplek. Untuk menentukan berat molekul dengan angat teliti sampai 4 angka dibelakang desimal dan dapat digunakan untuk mengetahui rumus molekul.
Optimasi alat KG-SM
1. Sampel minyak atsiri yang murni diinjeksi 0,10 μL ke dalam alat KG-MS Shimadzu QP 2010 S.
2. Diatur kolom yang digunakan Rtx-5 ms. 3. Diatur suhu kolom yang digunakan 60 oC.
iii 4. Diatur suhu detektor (MS) 250 oC. 5. Diatur suhu injektor 250 oC. 6. Diatur suhu interface 300 oC. 7. Diatur suhu awal 60 oC.
8. Diatur kenaikan suhu 10 oC per menit sampai suhunya 300 oC. 9. Diatur laju alir gas helium 0,51 mL per menit.
Langkah-langkah analisis dengan KG-SM:
1. Dihidupkan stabilizer kemudian menekan saklar power pada KG kea rah ON dan computer serta printer dihidupkan sampai proses pemvakuman.
2. Mengatur tampilan analisis.
3. Sampel diinjeksi ke dalam kolom menggunakan jarum injeksi (syringe).
4. Tempat injeksi, kolom dan detektor dipanaskan pada temperatur dimana sampel mempunyai tekanan uap minimum 10 torr.
5. Tempat injeksi dan detektor biasanya dibuat sedikit lebih panas dibandingkan dengan temperatur kolom untuk mempercepat penguapan sampel dan untuk mencegah kondensasi sampel.
6. Terjadi pemisahan dalam kolom akibat partisi komponen-komponen sampel antara fase gerak dan fase diam.
7. Aliran gas dan sampel yang keluar dari kolom dialirkan ke spektrometer massa yang akan mengidentifikasi komponen analisis berdasarkan massa senyawa.
iv c). Penentuan indeks bias
1. Alirkan air melalui refraktometer agar alat ini berada pada suhu dimana pembacaan akan dilakukan.
2. Suhu tidak boleh berbeda lebih dari ± 2 oC dari suhu referensi dan harus dipertahankan dengan toleransi ± 0,2 oC.
3. Sebelum minyak ditaruh di dalam alat, minyak tersebut harus berada pada suhu yang sama dengan suhu dimana pengukuran akan dilakukan.
4. Pembacaan dilakukan bila suhu sudah stabil.
d). Penentuan berat jenis
1. Dicuci dan dibersihkan piknometer.
2. Dibilas secara berturut-turut dengan etanol dan dietil eter.
3. Dikeringkan bagian dalam piknometer dengan arus udara kering. 4. Disisipkan tutupnya.
5. Dibiarkan piknometer di dalam lemari timbangan selama 30 menit dan ditimbang sebagai m.
6. Diisi piknometer dengan aquades yang telah dididihkan.
7. Dibiarkan pada suhu 20 oC, sambil menghindari adanya gelembung-gelembung udara.
8. Dicelupkan piknometer ke dalam penangas es pada suhu 20oC ± 0,2oC selama 30 menit.
9. Disisipkan penutupnya serta dikeringkan piknometernya.
10. Dibiarkan piknometer di dalam lemari timbangan selama 30 menit. 11. Ditimbang dengan isinya sebagai m1.
v
12. Dikosongkan piknometer tersebut dengan etanol dan dietil eter. 13. Dikeringkan dengan arus udara kering.
14. Diisi piknometer dengan contoh minyak atsiri dan hindari adanya gelembung udara.
15. Dicelupkan kembali piknometer ke dalam penangas es pada suhu 20 oC ± 0,2 oC selama 30 menit.
16. Disisipkan penutupnya dan keringkan piknometer tersebut.
17. Dibiarkan piknometer di dalam timbangan selama 30 menit dan ditimbang sebagai m2
18. Dihitung dengan rumus perhitungan berat jenis sesuai dengan SNI 06-2388- 2006.
4.2.2 Analisis kandungan logam pada minyak atsiri daun sereh wangi a). Analisis kandungan logam berat Pb, Cd dan Cr dengan alat SSA
Prosedur analisis logam Pb, Cd dan Cr menggunakan teknik Spektrofotometer Serapan Atom ada beberapa langkah, yaitu:
1. Ditimbang dengan teliti sampel minyak atsiri daun sereh wangi sebanyak 5 gram ke dalam erlenmeyer 250 mL.
2. Ditambahkan 10 mL HNO3 1:1. 3. Diaduk campuran hingga homogen.
4. Dididihkan campuran selama 15 menit di dalam lemari asam.
5. Dilanjutkan pemanasan sampai contoh mulai kering pada bagian bawahnya tapi belum terbentuk arangnya.
vi
selama 15 menit sampai letupan dari uap Cl2 berhenti, kemudian pemanasan ditingkatkan dan dididihkan sampai volume 5 mL sampai 7,5 mL.
7. Ditambahkan 20 mL air suling dan diaduk. 8. Dituangkan ke dalam labu ukur 50 mL. 9. Dibilas erlenmeyer dengan 5 mL air suling.
10. Dituangkan ke dalam labu ukur 50 mL secara kuantitatif dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis.
11. Disiapkan larutan blanko dengan penambahan pereaksi dan perlakuan yang sama (SNI 3752-2009).
12. Dioperasikan spektrofotometer serapan atom dan dioptimalkan sesuai dengan petunjuk penggunaan alat untuk pengujian Pb, Cd dan Cr.
13. Ditambah matrix modifier dan diatasi gangguan dengan pengukuran sesuai spektrofotometer serapan atom yang digunakan.
12 Dilakukan pengukuran dengan nyala reduksi.
13. Dioperasikan alat dan optimasi alat dengan uji sensitifitas.
14. Diaspirasikan larutan blangko ke dalam spektrofotometer serapan atom kemudian diatur serapan sampai nol sesuai (SNI 06-2385-2006).
15. Diaspirasikan larutan kerja satu persatu ke dalam spektrofotometer serapan atom kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang tertentu sesuai (SNI 06-2385-2006).
vii 4.2.3 Pengujian di lapangan
a). Preparasi sampel minyak atsiri daun sereh wangi
1. Sampel minyak atsiri daun sereh wangi dimurnikan dengan menambahkan Na2SO4 anhidrat.
2. Dibuat konsentrasi minyak atsiri daun sereh wangi 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, dan 25% dengan menambahkan larutan tween 80 sebagai agen pengelmusi.
b). Uji coba minyak atsiri hasil destilasi
Minyak atsiri daun sereh wangi dialikasikan pada batu candi yang ditumbuhi lichenes dengan tahapan sebagai berikut:
1. Dioleskan langsung minyak atsiri sereh wangi ke bagian permukaan benda uji menggunakan kuas.
2. Ditutup dengan plastik agar tidak menguap.
3. Pengamatan dilakukan 24 jam setelah pengaplikasian minyak terhadap lumut kerak.
4. Sebelum dan sesudah pengolesan minyak atsiri permukaan benda uji diamati dengan menggunakan mikroskop dan SEM.
5. Dalam pembuatan konsentrasi minyak tanaman ini digunakan minyak atsiri sereh wangi lenabatu. Masing-masing minyak atsiri dalam penelitian ini digunakan konsentrasi sebesar 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% dan 100%.
4.2.4 Pengujian di laboratorium
a). Pembuatan medium kultur jamur PDA (Potatoes Dextrose Agar) 1. Ditimbang sebanyak 39 gam PDA dicampur dengan aquades 1000 mL.
viii 2. Diaduk sampai larut.
3. Dipanaskan selama 15 menit dengan suhu 100 oC agar larut sempurna. 4. Dimasukkan larutan ke dalam alat autoklaf dengan suhu 121 oC selama 1 jam.
b). Isolasi jamur dari lichenes
1. Dikerik lichenes dari batu candi menggunakan spatula dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang bersih.
3. Diinokulasi jamur dari lichenes ke dalam medium PDA dengan menggunakan metode penuangan selama 48 – 72 jam sampai terbentuk koloni jamur.
4. Diambil koloni yang terbentuk dengan ose.
5. Diinokulasi lagi ke dalam medium agar PDA miring dalam tabung reaksi dengan cara digores secara zigzag dan diinolukasi selama 48-72 jam.
6. Diamati koloni yang terbentuk dengan menggunakan mikroskop.
c). Uji antijamur minyak atsiri daun sereh wangi dengan metode difusi
Uji aktivitas antijamur bertujuan untuk mengetahui daya hambat minyak atsiri daun sereh wangi terhadap pertumbuhan jamur dari lichenes. Langkah-langkahnya adalah sebagai berikut:
1. Disiapkan 8 kertas saring berukuran 6 mm.
2. Direndam kertas saring dengan minyak atsiri daun sereh wangi untuk masing-masing konsentrasi 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, dan 100% serta pembanding berupa kertas saring 6 mm tidak direndam.
3. Diletakan masing-masing kertas uji yang telah direndam pada permukaan medium PDA yang telah ditanami jamur sesuai konsentrasi.
ix
4. Dilakukan pengamatan setiap 24 jam setelah pengaplikasian dengan cara mengukur diameter hambatan dengan garisan yang ada ukurannya millimeter.
d). Analisis hasil uji coba dengan mikroskop dan (SEM)
Pengamatan untuk uji mikroba seperti jamur, ganggang, lichenes
dilakukan dengan menggunakan mikroskop dan SEM. SEM (Scanning Electron Microscope) adalah salah satu jenis mikroskop elektron yang menggunakan berkas elektron untuk menggambarkan bentuk permukaan dari material yang dianalisis. Prosedur Pengoperasian Scanning Electron Microscope, adalah sebagai berikut:
1. Preparasi sampel (coating)
a. Diberi label dan ditempelkan selotip double tip pada holder. b. Ditempatkan sampel diatas selotip pada holder.
c. Holder yang sudah tertempeli sampel ditempatkan diwadah coating. d. Di coating dengan alat Fine coat ion sputler JFC-1100.
e. Ditekan tombol ON untuk pemvakuman selama 2 menit.
f. Diatur vakum posisi high 9, Hv di DC dan HV kontrol setahap demi setahap maksimal 1,5 kV selama 5-10 menit.
g. Dimasukkan sampel kedalam tempat sampel pada SEM.
2. Penyiapan spesimen, penempatan dan penggantian spesimen, mengganti holder spesimen.
3. Observasi Gambar
a. Mengatur arus filament.
x c. Mengatur fokus.
d. Mengarahkan posisi objek. 4. Merekam Gambar (photo)
