PENGARUH SUPLEMENTASI INSULIN TRANSFERIN SELENIUM (ITS) PADA MEDIA MATURASI TCM-199 TERHADAP EKSPRESI KALSIUM (Ca

(1)

ii TESIS

PENGARUH SUPLEMENTASI INSULIN TRANSFERIN

SELENIUM (ITS) PADA MEDIA MATURASI TCM-199

TERHADAP EKSPRESI KALSIUM (Ca

2+

) INTRASELULER

DAN PERSENTASE MATURASI

OOSIT SAPI

PENELITIAN EKSPERIMENTAL LABORATORIS

Oleh:

SITI ELIANA ROCHMI

061314153007

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOLOGI REPRODUKSI FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA

(2)

iii

PENGARUH SUPLEMENTASI INSULIN TRANSFERIN

SELENIUM (ITS) PADA MEDIA MATURASI TCM-199

TERHADAP EKSPRESI KALSIUM (Ca

2+

_{) INTRASELULER}

DAN PERSENTASE MATURASI

OOSIT SAPI

PENELITIAN EKSPERIMENTAL LABORATORIS

TESIS

untuk memperoleh gelar Magister dalam Program Studi Ilmu Biologi Reproduksi pada Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga

Surabaya

SITI ELIANA ROCHMI

NIM

061314153007

PROGRAM STUDI MAGISTER

ILMU BIOLOGI REPRODUKSI

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA

(3)

iv

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam Tesis berjudul:

PENGARUH SUPLEMENTASI INSULIN TRANSFERIN

SELENIUM (ITS) PADA MEDIA MATURASI TCM-199

TERHADAP EKSPRESI KALSIUM (Ca

2+

_{) INTRASELULER}

DAN PERSENTASE MATURASI

OOSIT SAPI

tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar Magister di suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surabaya, 17 Desember 2015

Siti Eliana Rochmi

(4)

v

TESIS INI TELAH DISETUJUI 17 Desember 2015

Oleh: Pembimbing Ketua

Dr. Hardijanto, drh., M.S.

NIP. 195205191978031002

Pembimbing

Prof.Dr. Wurlina, drh.,MS.

NIP. 195409181983012001

Mengetahui,

Ketua Program Studi Ilmu Biologi Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga

Prof.Dr. Wurlina, drh.,MS.

(5)

vi

Usulan Penelitian Tesis ini Telah diuji dan dinilai pada Tanggal : 13 Juli 2015

PANITIA PENGUJI USULAN PENELITIAN TESIS

Ketua : Dr. Hardijanto, drh., M.S. Anggota : 1. Prof. Dr. Wurlina, drh.,MS.

2. Prof. Dr. Imam Mutofa, drh., M.Kes 3. Dr. Widjiati, drh., M.Si

(6)

oosit matur paling tinggi dibandingkan dengan dosis yang lain dalam penelitian ini.

Penggunaan ITS pada maturasi oosit in vitro pada kambing (Firmiaty, 2014) diperoleh hasil yang belum signifikan dengan dosis 5 µg/ml dan 10 µg/ml. pada penelitian ini maturasi oosit menunjukkan hasil yang signifikan dan dosis terbaik suplementasi ITS adalah 20 µg/ml.

(7)

vii

Hasil Penelitian Tesis ini Telah diuji dan dinilai pada: Tanggal : 8 Desember 2015

PANITIA PENGUJI HASIL PENELITIAN TESIS

Ketua : Prof. Dr. Imam Mutofa, drh., M.Kes Anggota : 1. Dr. Widjiati, drh., M.Si

2. Dr. Suherni Susilowati, drh., M.Kes 3. Dr. Hardijanto, drh., M.S.

(8)

viii Tesis ini Telah diuji dan dinilai pada: Tanggal : 17 Desember 2015

PANITIA PENGUJI TESIS

Ketua : Prof. Dr. Imam Mutofa, drh., M.Kes Anggota : 1. Dr. Widjiati, drh., M.Si

2. Dr. Suherni Susilowati, drh., M.Kes 3. Dr. Hardijanto, drh., M.S.

4. Prof. Dr. Wurlina, drh.,MS.

Surabaya, Januari 2016

Program Studi Magister Ilmu Biologi Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Airlangga Dekan,

(9)

ix

UCAPAN TERIMA KASIH

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas karunia yang telah diberikan kepada penulis sehingga dapat melaksanakan penelitian dan menyelesaikan tesis dengan judul Pengaruh Suplementasi Insulin Trasferrin Selenium (ITS) pada Media Maturasi Terhadap Ekspresi Kalsium (Ca2+_{) Intraseluler dan Persentase}

Maturasi Oosit.

Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada : Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga, Prof. Dr. Pudji Srianto, drh., M.Kes. atas kesempatan yang diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini.

Dr. Hardijanto, drh., M.S. selaku pembimbing pertama dan Prof. Wurlina, drh., M.S. selaku pembimbing kedua serta Ketua Program S2-Studi Ilmu Biologi Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga yang telah banyak menyempatkan waktu untuk membimbing, bertukar pikiran, dan saran yang bermanfaat dalam proses penyelesaian tesis ini.

Prof. Dr. Imam Mutofa, drh., M.Kes selaku ketua penguji, Dr. Widjiati, drh., M.Si. selaku sekretaris penguji sekaligus pembimbing penelitian, dan Dr. Suherni Susilowati, drh., M.Kes selaku anggota penguji yang telah banyak membantu dalam rangkaian proses penyelesaian tesis ini.

Seluruh Staf Pengajar S2-Ilmu Biologi Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan Universittas Airlangga atas wawasan keilmuan yang diberikan selama menimbah ilmu pada pendidikan Magister.

Ayahanda Sugiman, SE., Ibunda Umi Yuriati, Adek Agus Tsani Maulana yang telah memberikan doa dan dukungan selama ini.

(10)

x

selama pelaksanaan penelitian, serta Agung Budianto Achmad, drh., M.Si. yang telah membantu selama penyelesaian tesis ini.

Keluarga angkatan 2013 S2-Ilmu Biologi Reproduksi, Yhogga Pratama Dinata, drh., Dikky Eka Mandala Putranto, drh., M.Si., Yanita Mutiaraning Viastika, drh., Novarina Sulsia I., drh, Ayu Ira Marita, drh., dan Anna Ismawati, drh. atas kebersamaannya selama ini.

Andri Purbianto, dr. yang telah memberikan banyak masukan, doa, motivasi dan mendengarkan keluh kesah selama penyelesaian tesis ini, sahabat Mia Zakia R., drh., M.Si., Ria Wahyu, drh., Rieska Nursita, drh., Anita Rahmawati, drh., Tri Wahyu H., drh., Putri Dwi K., drh., Alfiana Laili drh., Indrawan Arif Rahman, serta Ustadz M. Husni Mubarok Al Hafidz yang telah banyak memberikan dorongan, motivasi, serta doa selama penyelesaian tesis ini.

Serta pihak-pihak lain yang sangat membantu dalam penyelesaian tesis ini yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu.

(11)

xi

RINGKASAN

Pengaruh Suplementasi Insulin Transferrin Selenium (ITS) Pada Media Maturasi TCM-199 Terhadap Ekspresi kalsium (Ca2+) Intraseluler dan

Persentase Maturasi Oosit

Perkembangan bioteknologi reproduksi ternak banyak memberikan manfaat bagi kehidupan manusia khususnya dalam dunia peternakan diantaranya inseminasi buatan (IB) dan transfer embrio (TE). Untuk keperluan transfer embrio dibutuhkan embrio dalam jumlah banyak dengan aplikasi in vitro fertilization

(IVF) meliputi in vitro maturation (IVM) dan in vitro culture (IVC). Kualitas

embrio yang diperoleh dari maturasi oosit yang belum matur dilakukan secara IVM, IVF, dan IVC tidak lebih tinggi dari 30-40 % dengan menggunakan teknik dasar. Maturasi oosit dilakukan dalam inkubator steril pada suhu 38,50_{C dengan} CO2 5% dan kelembaban 95% sehingga dapat meningkatkan produksi reactive oxygen species (ROS). Pematangan oosit dengan aplikasi IVM dipengaruhi oleh

suplementasi yang digunakan, kualitas oosit, resiko kontaminasi, dan media kultur. Suplementasi Insulin Transferin Selenium (ITS) dalam medium pematangan oosit dapat meningkatkan jumlah oosit matang. Maturasi oosit turut dipengaruhi oleh peran kalsium intraseluler. Aktivitas kalsium intraseluler yang tinggi merupakan salah satu penanda oosit berada pada Metafase II (MII) atau oosit telah matang dan siap untuk fertilisasi.

Penelitian ini bertujuan mengetahui peran Insulin Transferrin Selenium (ITS) terhadap proses peningkatan maturasi oosit in vitro dengan adanya

peningkatan ekspresi kalsium intraseluler dan persentase maturasi oosit dengan pewarnaan imunositokimia dengan metode streptavidin biotin complex dan

pewarnaan acto arcein.

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium In Vitro dan Laboratorium Patologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga pada bulan Juli hingga Oktober 2015. Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Pengambilan sampel dilakukan dengan cara aspirasi ovarium sapi yang diperoleh dari Rumah Potong Hewan. Folikel yang diaspirasi berukuran 2-6 mm menggunukan spuit sekali pakai denga jarum 18G. Oosit hasil aspirasi kemudian dicuci dengan PBS tiga kali dan medium maturasi dua kali.

Proses maturasi oosit menggunakan medium TCM-199 yang ditambahkan FSH 100 IU/ml, LH 100 IU/ml, BSA 3% dan ITS (Insulin Transferrin Selenium). ITS yang digunakan untuk suplementasi dalam media kultur berbeda tiap perlakuan yaitu 0 µg/ml (P0), 10 µg/ml (P1), 15 µg/ml (P2), dan 20 µg/ml (P3). Setiap petridish berisi empat drop media maturasi 50 µg/ml yang telah dilapisi mineral oil kemudian diinkubasi pada inkubator CO2 5%, kelembapan 95%, suhu

38,5o_{C selama 22 jam. Kemudian dilakukan evaluasi untuk identifikasi ekspresi} kalsium intraseluler dengan pewarnaan Imunositokimia metode streptavidin biotin complex serta perhitungan persentase maturasi oosit dengan pewarnaan aceto

(12)

xii

(13)

xiii

SUMMARY

Effect of Insulin Transferrin Selenium (ITS) Supplementation in Maturation Medium TCM -199 to Intracelular calcium Expression and Percentage of

Maturity Bovine Oocyte

Developmental of animal reproduction biotechnology provides benefits for human life, especially livestock world such as artificial insemination and embrio transfer. Embrio transfer requires a lot of embryos using in vitro culture (IVC) consist in vitro maturation (IVM) and in vitro culture (IVC). An embryos quality from maturing oocyte which immature carried on IVM, IVF and IVC not higher than 30-40% used basic technique. Oocyte maturation was done in sterile incubator at 38,5o_{C with CO2 5% and humidity 95% so it could increase the} Reactive Oxygen Species (ROS) production. IVM methods for oocyte maturation are affected by supplementation usage, oocyte quality, contaminated risk, and culture medium. Insulin Transferrin Selenium (ITS) supplementation in maturation medium can increase the number of mature oocytes. Oocyte maturation also influenced of intracelular calcium. High intracelular calcium Activity is one of the sign that oocyte in Metaphase II (MII) or oocyte have matured and ready for fertilization.

This study was to determine role of Insulin Transferrin Selenium to bovine oocyte were matured in vitro against improved intracelular calcium expresion and percentage of oocyte diameter and maturity bovine oocyte by immunocytochemistry using strepravidin biotin complex method and aceto orcein staining.

This study was conducted in Laboratorium In Vitro and Laboratorium Patologi Veteriner Faculty of Veterinary Medicine Airlangga University on July to October 2015. The study design used Completely Randomized Design (CRD). Sampling was done by bovine ovarian follicle aspiration obtained from slaughterhouse. Aspirated follicles are 2-6 mm using disposable syringe with Needle 18G. Oocytes from aspirated follicles are washed by PBS three times and twice in maturation medium.

Maturation process used TCM-199 medium which added by FSH 100 IU/ml, LH 100 IU/ml, BSA 3% and ITS (Insulin Transferrin Selenium). ITS dose which used in culture medium are different for each treated group. The treated groups are P0 (0 µg/ml), P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml), and P3 (20 µg/ml). Each petridish has four drops maturation medium 50 µg/ml coated by mineral oil then incubated in CO2 incubator with CO2 5%, Humidity 95% and 38.5o_{C due 22 hours} then evaluated using streptavidin biotin method immunocytochemistry staining for intracelular calsium expression identification and aceto orcein staining for calculating maturity bovine oocyte.

(14)

xiv

(15)

xv

EFFECT OF INSULIN TRANSFERRIN SELENIUM (ITS) SUPPLEMENTATION IN MATURATION MEDIUM TCM -199 TO INTRACELULAR CALCIUM EXPRESSION

AND PERCENTAGE OF MATURITY BOVINE OOCYTE

Siti Eliana Rochmi

ABSTRACT

Insulin Transferrin Selenium (ITS) has been used in vitro maturation system to support in vitro maturation of oocyte. The study aims was to determine role of Insulin Transferrin Selenium to bovine oocyte were matured in vitro against intracelular calcium as maturation mediator by immunocytochemistry using strepravidin biotin complex method and percentage of maturity bovine oocyte by aceto orcein staining. Maturation process used TCM-199 medium which added by FSH 100 IU/ml, LH 100 IU/ml, BSA 3% and ITS (Insulin Transferrin Selenium). ITS dose which used in culture medium are different for each treated group. The treated groups are P0 (0 µg/ml), P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml), and P3 (20 µg/ml). Oocytes were incubated in CO2 incubator with CO2 5%, Humidity 95% and 38.5o_{C due 22 hours. The result showed ITS} supplementation in maturation medium P0 (0 µg/ml) has significantly difference (p<0,05) compared P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml ) and P3 (20 µg/ml) of intracelular calcium expression but intracelular calcium expression of P1 (10 µg/ml) and P2 (15 µg/ml) has no significanly difference (p>0,05). In other way, ITS supplementation has significantly difference (p<0,05) for all and each treated groups P0 (0 µg/ml), P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml ), and P3 (20 µg/ml) of percentage of bovine oocyte. Conclusion of ITS supplementation in maturation medium TCM-199 can increase intracelular calcium expression and maturity bovine oocyte were matured in vitro.

Key Words: in vitro maturation, Insulin Transferrin Selenium, TCM-199,

(16)

xvi

PENETAPAN PANITIA PENGUJI ... vi

UCAPAN TERIMA KASIH ... ix

SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG ... xx

BAB 1 PENDAHULUAN ... 1

1.1. Latar Belakang ... 1

1.2. Rumusan Masalah ... 5

1.3. Tujuan Penelitian ... 6

1.3.1. Tujuan Umum Penelitian ... 6

1.3.2. Tujuan Khusus Penelitian ... 6

1.4. Manfaat Penelitian ... 7

2.1.2 Folikulogenesis ... 12

2.2. Maturasi Oosit ... 14

2.2.1 Maturasi Inti Oosit ... 17

2.2.2 Maturasi Sitoplasma Oosit ... 19

2.3. Mobilisasi Ca2+_{pada Maturasi Oosit ...} ₁₉

2.4. Insulin Transferrin Selenium ... 21

2.5. Antioksidan ... 24

(17)

xvii

3.1. Kerangka Konseptual ... 26

3.2. Hipotesis Penelitian ... 28

BAB 4 METODE PENELITIAN... 29

4.1. Rancangan Penelitian ... 29

4.2. Populasi, Besar Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel ... 29

4.2.1 Populasi ... 29

4.2.2 Besar Sampel ... 29

4.2.3 Teknik Pengambilan Sampel ... 30

4.3 Variabel Penelitian ... 31

4.3.1 Variabel Bebas (Independent variable) ... 31

4.3.2 Variabel Tergantung (Dependent variable) ... 31

4.3.3 Variabel Terkendali ... 31

4.4 Bahan Penelitian ... 31

4.5 Instrumen Penelitian ... 32

4.6 Lokasi dan Waktu Penelitian ... 32

4.7 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data ... 33

4.7.1 Maturasi Oosit ... 33

4.7.2 Identifikasi Ekspresi Ca2+_{Intraseluler Dengan Metode} Imunositokimia ... 34

4.7.3 Perhitungan Persentase Oosit Mature (MII) Dengan Pewarnaan Aceto-Orcein ... 35

4.8 Analisis Data ... 36

4.9 Kerangka Operasional ... 36

BAB 5 HASIL PENELITIAN ... 37

5.1 Data Pengukuran Ekspresi Kalsium Intraseluler ... 37

5.2 Data Perhitungan Persentase Maturasi Oosit ... 40

BAB 6 PEMBAHASAN ... 41

6.1 Ekspresi Kalsium Intraseluler ... 41

6.2 Persentase Maturasi Oosit ... 45

BAB 7 KESIMPULAN ... 49

7.1 Kesimpulan ... 49

7.2 Saran ... 49

DAFTAR PUSTAKA ... 50

(18)

xviii

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

3.1 Metode Perhitungan Immunositokimia……….35

5.1 Rerata ekspresi kalsium intraseluler yang Dimaturasi In Vitro

dengan suplementasi ITS……… 37

5.2 Mean dan standar deviasi Persentase Maturasi oosit Sapi

(19)

xix

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1 Skema Ovarium ... 9

2.2 Proses Oogenesis ... 11

2.3 Morfologi oosit sapi immatur ... 15

2.4 Klasifikasi oosit dengan pewarnaan aceto orcein ... 18

2.5 Mobilisasi Ca2+_{kumulus dalam maturasi oosit}_... ₂₀

2.6 Sistem Pertahanan Antioksidan ... 24

5.1 Hasil Pewarnaan Imunositokimia Ekspresi Kalsium Intraseluler ... 39

(20)

xx

APC = Anafase-promoting complex

AREG = Amphiregulin

ART = Assisted Rreproductive Technologi

ATP = Adenosin triphosphate

BNJ = Beda Nyata Jujur

BSA = Bovine Serum Albumin

BTC = Betacellulin

Ca2+ ₌_Calcium

CaMKII = calmodulindependent protein kinase II cAMP = cyclic adenosine monophosphate

cm = centimeter

CO2 = Karbon dioksida

COC = Cumulus Oocyte Complex

Cu = Cupro

CSF = Cytostatic factor

DAB = 3,3-diaminbenzidine tetrahydrochloride

DNA = Deoxyribonucleic Acid

dkk = dan kawan-kawan

EGF = Epidermal Growth Factor

EREG = Epiregulin

ERK = Extracelluler-regulated Kinase

et al = et alia

Fe = Ferum

FSH = Folicle Stimulating Hormon

G2 = Gap kedua

GLUT-4 = Glucose Transporter Type 4

GSH = Glutathione

GSSH = Glutathione reduktase

GV = Germinal Vesicle

GVBD = Germinal Vesicle Break Down

H2O2 = Hydrogen peroxide

HA = Hyaluronic Acid

IB = Inseminasi Buatan

IGF-I = Insuline like growth Factor-I

IGF-II = Insuline like growth Factor-II

(21)

xxi ITS = Insulin Transferin Selenium

IU = International Unit

IVC = In Vitro Culture

IVF = In Vitro fertilization

IVM = In Vitro Maturation

Kg = Kilogram

L = Liter

LH = Luteinizing Hormon

M = Mitosis

MAPK = Mitogen Activated Protein Kinase

MAPKK = MAPK Kinases

MAS = Meiosis Activated sterol

MEK = Mitogen-activated ERK-activating Kinase

mg = mili gram

MII = Metaphase II

ml = mili liter

mm = mili meter

Mn = Mangan

MPF = Maturation Promoting Factor

mRNA = messenger-RNA

NaCl = Natrium Clorida

O2- ₌_{Superoxide anion radical}

OH- ₌_{Hydroxyl radical}

PI3K = Phosphatidylinositole 3-Kinase PB I = Polar Body I

PBS = Phosphate Buffer Saline

PEIV = Produksi Embrio In vitro

pH = Derajat Keasaman

PKA = Protein Kinase A

RAL = Rangcangan Acak Lengkap

ROS = Reactive Oxydative Species

RPH =Rumah Potong Hewan

Se = Selenium

SERCA = Sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase

SPSS = Statistical Package for Social Scientific