18 BAB 3
PERCOBAAN
3.1 Bahan Percobaan
Agarosa (MD Bio) , akrilamid (Promega), bisakrilamid (Promega), amonium oksalat (Bratachem), Bacto Triptone (Difco), fuchsin basa (Bratachem), Bovine Serum Albumin (BSA), Tris basa (Promega), asam asetat glasial, dNTP (deoksinukleotida trifosfat) (MDBio), enzim Taq Polymerase (MDBio), etanol (Bratachem), etilen diamin tetraasetat (Bratachem), besi (II) sulfat (Bratachem), gliserol (Bratachem), iodin (Bratachem), isopropanol (Merck), dikalium hidrogen fosfat (Bratachem), kalium dihidrogen fosfat (Bratachem), kalium iodida (Bratachem), kalium klorida (Bratachem), kristal violet (Bratachem), tembaga (II) sulfat (Bratachem), loading buffer (MDBio), lysozyme (MDBio), magnesium klorida (MDBio), marka DNA (MDBio), N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamin (TEMED), natrium hidroksida (Merck), natrium karbonat (Bratachem), natrium klorida (Bratachem), natrium sitrat (Merck), nitro blue tetrazolium (NBT), phosphate buffer saline (PBS), Phenyl methane sulphonyl fluoride (PMSF), primer forward BactF1 (5’AGAGTTTGATC(A/C)TGGC TCAG3’) (Research Biolabs), primer reverse UniB1 (5’GGTTAC(G/C)TTG TTACG ACTT3’) (Research Biolabs), reagen Folin Ciocalteu, riboflavin (Merck), seng sulfat (Bratachem), sodium dodecyl sulphate (SDS), dapar PCR (MDBio), Tris HCl, dan ekstrak ragi (Difco).
3.2 Alat Percobaan
Alat Freeze-Dry (Snijders Scientific), Elektroforesis agarosa (Biorad), Elektroforesis poliakrilamid (Biorad Mini Protean II), Freezer - 20°C (Denpoo), Gel Dryer (BioRad Gel Dryer Model 583), Inkubator (Lequeux), Inkubator Goyang (GSL), Kompor Listrik (Rommelsbacher), Kotak cahaya (30 cm x 30 cm x 30 cm dengan lampu Phillips 18 W model Cool Daylight), Laminar Airflow Cabinet (Microflow), Mesin PCR (Applied Biosystem 2720 Thermal Cycler), Mikroskop (Olympus CH2), Otoklap (All American), Oven (LTE, Ltd), Sentrifuga (GS 15R Centrifuge Beckman, Biofuge Fresco Heraeus Instrument, Mikro 200R Hettich Zentrifugen), Sonikator (Fisher Sonic Dismembrator Model 300), Spektrofotometri (Beckman DU7500i, Milton Roy Spectronic 21D) Timbangan Elektronik (Sartorius), UV Transluminator (Vilber Lourmat), dan alat gelas yang biasa digunakan dalam laboratorium bioteknologi.
3.3 Sampel
Sampel bakteri diperoleh dari koleksi bakteri laboratorium bioteknologi, Sekolah Farmasi, Institut Teknologi Bandung sebanyak 29 sampel yang identitas spesiesnya belum diketahui.
3.4 Tahap Penentuan Aktivitas
Pada tahap ini dilakukan pewarnaan Gram dan pengamatan bentuk sel bakteri sebagai pengujian awal, kemudian dilakukan penumbuhan bakteri dan ekstraksi protein. Sampel protein total yang diperoleh digunakan untuk menentukan aktivitas SOD dari bakteri. 3.4.1 Pengujian Awal
Pewarnaan Gram dan pengamatan bentuk bakteri dilakukan sebagai pengujian awal. Pada kaca objek bersih diteteskan satu tetes aquades, kemudian dengan menggunakan jarum ose steril diusapkan biakan mikroba, dihomogenkan dan dibiarkan mengering. Pada usapan yang telah mengering diteteskan satu tetes kristal violet dan didiamkan satu menit. Selanjutnya dibilas menggunakan Lugol hingga bercak kristal violet hilang, kemudian diteteskan satu tetes Lugol dan dibiarkan 30 detik. Bercak Lugol dibilas sampai warna bilasan bening menggunakan etanol 95%. Setelah itu, setetes larutan fuchsin diteteskan dan setelah 30 detik dibilas kembali dengan aquades. Pewarnaan pada koloni diamati menggunakan mikroskop. Warna ungu pada sel menunjukkan Gram positif, sedangkan warna merah menunjukkan Gram negatif.
3.4.2 Penumbuhan Bakteri
Penumbuhan kultur mikroba dilakukan pada media Luria Bertani (LB) padat. Setiap jenis ditumbuhkan dalam dua jenis media padat, yakni dengan dan tanpa garam logam. Untuk sampel Sukasirna, Seskau 2, TK Cibodas, Bandung, SCK, SEDAL cle II3, BBK Bengkok,
BCD, Ciismun 4, MKS 11, dan MKS 13, masing – masing mikroba ditumbuhkan pada 2 media padat yaitu media LB dengan dan tanpa garam logam (1 mM ZnSO4.7H2O, 1mM
CuSO4.5H2O, 0,1 mM MnCl2.4H2O dan 0,1 mM FeSO4.7H2O). Mikroba diinokulasikan
dengan mengoleskan stok gliserol ke media padat menggunakan batang kapas steril ke seluruh permukaan agar. Kultur diinkubasi 24 jam pada suhu 37°C dan keseluruhan inokulum yang tumbuh di permukaan agar dipanen untuk kemudian dipindahkan ke dalam 10 mL Phosphate Buffer Saline (PBS) steril. Absorbansi pada panjang gelombang 580 nm diukur dan disesuaikan dengan pengenceran hingga bernilai 0,4 – 0,6.
Penumbuhan isolat nomor STLA 6A, Ciismun 2 dan MKS 1 dilakukan pada media Nutrient Agar (NA) padat selama 24 jam pada suhu 37°C, kemudian dipindahkan ke media LB cair dengan dan tanpa logam dengan konsentrasi sama. Kultur cair diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C di inkubator goyang. Kemudian sebanyak 750 µL dari kultur cair tersebut dipindahkan ke media segar berjenis sama dan diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37°C di inkubator goyang. Setelah itu absorbansi diukur pada panjang gelombang 580 nm dan disesuaikan dengan pengenceran hingga 0,4 – 0,6. Setelah dilakukan perhitungan absorbansi, kultur cair siap disentrifugasi untuk diperoleh peletnya. 3.4.3 Ekstraksi Protein Total
Inokulum pada media cair yang telah diukur absorbansinya disentrifuga dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit pada suhu 10°C. Supernatan dibuang, kemudian ditambahkan 500 μL PBS dan disentrifuga pada kondisi yang sama selama 5 menit. Supernatan kembali dibuang dan endapan pelet diresuspensikan dengan 1,5 mL larutan Phosphate Buffer Saline (PBS). PMSF ditambahkan ke dalam larutan resuspensi pelet hingga konsentrasi akhir 1mM. Ekstrak protein total diperoleh setelah dilakukan pemecahan sel bakteri dengan sonikator. Pemecahan suspensi sel bakteri dilakukan dalam siklus berupa sonikasi selama 30 detik dan istirahat selama 30 detik di dalam penangas es. Sonikasi dihentikan ketika kekeruhan suspensi sel bakteri berkurang secara bermakna. Hasil sonikasi diendapkan dengan alat sentrifuga pada kecepatan 12000 rotasi per menit (rpm) pada suhu 6°C selama 10 menit. Ekstrak protein total berupa supernatan dari hasil sentrifuga diambil dan dipekatkan dengan liofilisasi hingga setengah volume awal. Hasil pemekatan ditempatkan dalam tabung steril berukuran 1,5 ml dan disimpan pada alat pendingin bersuhu -20°C. 3.4.4 Pengujian Aktivitas SOD Total dengan Spektrofotometri
Ke dalam vial yang bersih dan kering ditambahkan 200 μL larutan EDTA 0,1 M, 100 μL larutan NBT 1,5 mM dan 50 μL sampel protein. Campuran larutan dihomogenkan dengan alat vortex dan diinkubasi di dalam tangas es selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 50 μL riboflavin 0,12 M dan dapar fosfat hingga volume 3 mL. Selanjutnya dilakukan inkubasi di pada suhu ruang, setelah 25 menit ditambahkan 50 μl riboflavin dan diinkubasi dalam kotak cahaya selama 15 menit. Absorbansi diukur dengan spektrofotometri dengan panjang gelombang 560 nm. Selain sampel dibuat juga larutan pembanding dengan mengganti 50 μL sampel menjadi 50 μL larutan NBT 1,5 mM, larutan pembanding diberi perlakuan yang sama dengan sampel. Aktivitas superoksida dismutase dinyatakan dalam
nilai persentase inhibihisi yakni persen rasio absorbansi sampel dan absorbansi pembanding.
3.4.5 Pengujian Aktivitas SOD Total dengan Zimografi
Zimografi merupakan identifikasi aktivitas enzimatik dengan menggunakan gel poliakrilamid. Sampel protein yang mengandung 3 µg protein total bersama loading buffer protein (perbandingan 5:1) dimasukkan ke dalam sumur gel poliakrilamid, dan dilakukan elektroforesis pada 80 V selama 15 menit kemudian dilanjutkan pada 120 V selama 60 menit. Gel hasil elektroforesis direndam dalam 10 mL larutan NBT 1,23 mM selama 15 menit, selanjutnya gel dicuci dengan aquades dan ditambahkan 10 mL larutan yang mengandung riboflavin 2,8 x 10-2 mM dan TEMED 28 mM. Kemudian gel direndam dalam keadaan gelap selama 15 menit. Setelah itu gel kembali dicuci dengan aquades dan diinkubasi di dalam kotak cahaya selama 20 menit dalam keadaan terendam aquades. Hasil dikeringkan menggunakan gel dryer dan dipindai.
3.5 Tahap Identifikasi Gen 16S rDNA
Setelah didapatkan 6 sampel protein dengan aktivitas tertinggi, dilakukan isolasi DNA dari bakteri - bakteri penghasil protein tersebut sebagai cetakan pada tahap reaksi PCR 16S rDNA. Hasil reaksi PCR 16S rDNA ditentukan urutannya dengan penentuan urutan nukleotida. Identifikasi spesies didapatkan setelah memasukkan data hasil penentuan urutan nukleotida ke bank data NCBI dengan bantuan program BLAST.
3.5.1 Isolasi DNA Bakteri
Sebanyak 1 ml kultur cair disentrifuga pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit, kemudian supernatan dibuang. Apabila jumlah pelet sel yang diperoleh kurang, maka langkah sebelumnya dapat diulang dengan kembali menambahkan 1 ml kultur cair, disentrifuga pada kondisi yang sama dan dibuang supernatannya. Perlakuan selanjutnya untuk bakteri Gram negatif dan Gram positif berbeda. Untuk bakteri Gram positif, sebelumnya pelet sel diresuspensi terlebih dahulu dengan 480 μl larutan EDTA 50 mM. Selanjutnya ditambahkan 120 μl lysozyme dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 45 detik. Setelah itu campuran disentrifuga pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit dan dibuang supernatannya.
Langkah yang selanjutnya dilakukan adalah juga merupakan perlakuan awal pada bakteri Gram negatif. Sebanyak 600 μL Nuclei Lysis Solution ditambahkan ke dalam pelet sel dan diresuspensikan perlahan. Kemudian diinkubasi pada suhu 80°C selama 5 menit dan didinginkan hingga mencapai suhu ruang. Selanjutnya ditambahkan 200 μL Protein Precipitation Solution dan dihomogenkan dengan alat vortex pada kecepatan tinggi. Setelah itu diinkubasi di dalam tangas es selama 5 menit dan disentrifuga pada kecepatan 13000 rpm selama 3 menit. Supernatan diambil dengan hati – hati untuk menghindari terbawanya endapan dan dipindahkan ke dalam tube steril berukuran 1,5 mL lain yang telah berisi 600 μL isopropanol bersuhu ruang. Campuran supernatan dan isopropanol dihomogenkan secara perlahan hingga terlihat bayangan putih. Tube disentrifuga pada kecepatan 13000 selama 2 menit dan dibuang supernatannya, selanjutnya ditambahkan 600 μL etanol 70%, disentrifuga pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit dan dibuang supernatannya.
Endapan dibiarkan hingga benar – benar kering, kemudian ditambahkan 100 μL DNA Rehydration Solution dan diinkubasi selama 24 jam pada pendingin bersuhu 4°C. Isolat DNA yang diperoleh disimpan pada pendingin bersuhu -20°C. Hasil yang diperoleh, diperiksa keberadaannya dengan menggunakan elektroforesis agarosa.
3.5.2 Amplifikasi Gen 16S rDNA
PCR dilakukan menggunakan primer forward BactF1 dan primer reverse UniB1. Campuran reaksi PCR dilakukan dengan menambahkan 16,8 μL Milli Q Water ke dalam tube steril berukuran 200 μL. Selanjutnya berturut – turut ditambahkan 2,5 μL Buffer Taq tanpa MgCl2; 2,5 μL MgCl2; primer UniB1 dan BactF1 masing – masing 1 μL; 0,5 μL
dNTP; 0,2 μL Enzim Taq DNA Polimerase dan dihomogenkan. Terakhir ditambahkan cetakan DNA yang diperoleh dari tahap isolasi DNA.
Kondisi reaksi pada satu siklus PCR yang dilakukan adalah; (1) tahap denaturasi awal, suhu 94°C selama 2 menit; (2) tahap amplifikasi, suhu denaturasi 94°C selama 1 menit, suhu annealing 48°C selama 1 menit, suhu elongasi 72°C selama 1 menit; (3) tahap paska elongasi, suhu 72°C selama 10 menit. Produk PCR diidentifikasi dengan menggunakan elektroforesis agarosa, pita produk PCR terletak pada marka 1 dan 2 kilobasa (kb).
3.5.3 Penentuan Urutan Nukleotida
Penentuan urutan nukleotida dilakukan dua arah dengan metode enzimatik Sanger dengan bantuan perusahaan Makrogen. Penentuan jumlah sampel DNA yang ditentukan urutan nukleotidanya dilakukan dengan perhitungan perkiraan konsentrasi DNA dengan membandingkan intensitas fluorosensi pita produk PCR dengan intensitas fluorosensi pita marker, jumlah DNA yang dibutuhkan dalam reaksi adalah 1000 ng. Selain sampel DNA juga disertakan kedua primer forward dan reverse dengan konsentrasi 3,33 pmol/µl.
Hasil penentuan urutan nukleotida dianalisis dengan bantuan program Sequencher dan BLAST dari NCBI. Analisis penentuan nukleotida meliputi pemeriksaan daerah ketersambungan dari pensejajaran hasil kedua primer, pemeriksaan tipe rantai serta pemeriksaan parameter BLAST.
