5 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kalsium dalam Tanaman Kubis
Kalsium merupakan mineral paling banyak yang terdapat di dalam tubuh, yang berkisar 1,5-2% dari berat badan orang dewasa atau kurang lebih sebanyak 1 kg. Dari jumlah ini, 99% berada di dalam jaringan keras yaitu tulang dan gigi terutama dalam bentuk hidroksiapatit [(3Ca3(PO4)2.Ca(OH)2]. Sumber kalsium utama adalah susu dan turunananya seperti keju. Serealia, kacang-kacangan, dan sayuran hijau merupakan salah satu sumber kalsium yang baik (Almatiser, 2004:235).
Kalsium dalam sayuran hijau salah satunya terdapat dalam tanaman kubis. Kubis merupakan tumbuhan dengan nama ilmiah Barassica oleracea
var.capitata. Kelompok capitata ini dimanfaatkan daunnya untuk dimakan. Daun
ini tersusun sangat rapat membentuk bulatan atau bulatan pipih, yang disebut kepala (capitata berarti "berkepala").
6
Kubis segar mengandung air, protein, lemak, karbohidrat, serat, kalsium, fosfor, besi, natrium, kalium, vitamin (A, C, E, tiamin, riboflavin, nicotinamide), kalsium, dan beta karoten. Selain itu, juga mengandung senyawa
sianohidroksibutena (CHB), sulforafan, dan iberin yang merangsang
pembentukan enzim yang bekerja dengan cara menguraikan dan membuang zat-zat beracun yang beredar di dalam tubuh. Tabel 2.1 menunjukan kadar mineral dalam tanaman kubis diatas 3 bulan.
Tabel 2.1 Data Kadar Mineral Pada Tanaman Kubis Usia Diatas 3 Bulan
Unsur
Kadar Mineral Dalam Kubis (%) Rendah Sedang Tinggi N 2,70 – 3,49 3,50 – 4,80 >4,80 P 0,25 – 0,29 0,30 – 0,65 >0,65 K 1,50 – 1,99 2,00 – 4,00 >4,00 Ca 1,00 – 1,29 1,30 – 3,50 >3,50 Mg 0,23 – 0,27 0,28 – 0,80 >0,60 S 0,25 – 0,29 0,30 – 0,75 >0,75 Sumber : Jones, J.R. et al, 1991.
Kekurangan kalsium pada masa pertumbuhan dapat menyebabkan gangguan pertumbuhan. Saat kadar kalsium dalam tulang mengalami penurunan hal tersebut akan mengakibatkan tulang menjadi rapuh dan mudah patah hal ini dapat terjadi pada semua orang dewasa terutama diatas umur 50 tahun, keadaan tersebut dinamakan osteoporosis.
7
Selain osteoporosis kekurangan kalsium dapat pula menyebabkan
osteomalisa yang disebut juga riketsia pada orang dewasa dan biasanya juga
terjadi karena kekurangan vitamin D dan ketidakseimbangan konsumsi kalsium terhadap fosfor. Mineralisisi matriks tulang terganggu, sehingga kandungan kalsium di dalam tulang menurun (Almatiser, 2004:242-243).
2.2 Spektrofotometer Serapan Atom (SSA)
Prinsip analisis dengan SSA adalah atom-atom pada keadaan dasar mampu menyerap energi cahaya pada panjang gelombang tertentu, yang pada umumnya adalah panjang gelombang radiasi yang akan dipancarkan atom-atom itu bila tereksitasi dari keadaan dasar. Jadi jika cahaya dengan panjang gelombang resonansi itu dilewatkan nyala yang mengandung atom-atom tersebut, maka sebagian cahaya tersebut akan diserap dan banyaknya cahaya yang diserap berbanding lurus dengan banyaknya atom pada keadaan dasar yang berada dalam nyala (Bassett, J, et all, 1994;942)
Gambar 2.2 Skema Instrumen Spektrofotometri Serapan Atom Sampel
Nyala
Sumber sinar Monokromator
detektor Perekam Chopper
8
Sinar yang diserap biasanya sinar tampak/UV. Prinsip SSA secara garis besar sama dengan spektrofotometer UV-VIS, hanya saja dibedakan atas cara pengerjaan, cuplikan, peralatan, dan bentuk spektrum atom. Untuk analisis kuantitatif, SSA mengukur kadar total unsur logam dalam satu cuplikan, tidak bergantung bentuk molekul logam dalam cuplikan. Metode ini paling sering digunakan dalam cara kuantitatif untuk menentukan konsentrasi spesies yang menyerap dalam larutan, dengan menggunakan hukum Lambert-Beer:
− ...2.1 di mana A adalah diukur absorbansi, I 0 adalah intensitas cahaya pada suatu panjang gelombang, I adalah intensitas ditransmisikan, L adalah panjang lintasan melalui sampel, dan c yang konsentrasi spesies yang menyerap. Untuk setiap spesies dan panjang gelombang, ε adalah sebuah konstanta yang dikenal sebagai molar kapasitas pengisapan.
Bila suatu larutan yang mengandung senyawa yang akan dianalisis di hembuskan ke dalam nyala maka peristiwa yang akan terjadi secara berurutan adalah:
a. Penyedotan pelarut yang meninggalkan residu padat.
b. Penguapan zat padat dengan disosiasi menjadi atom-atom penyusunya yang mula-mula akan berada dalam keadaan dasar.
c. Beberapa atom akan tereksitasi oleh energi termal dari nyala ke tingkat-tingkat energi yang lebih tinggi, dan mencapai kondisi dimana
9
2.2.1 Analisis Kalsium dengan Spektrofotometri Serapan Atom
Analisis kalsium dengan SSA digunakan untuk sampel dengan jumlah sedikit dan sudah terlebih dahulu mengalami ektraksi untuk mengekstrak Ca tersebut dari sampel yang akan dianalisis. Terdapat dua macam reagen yang digunakan dalam pembuatan larutan standar yaitu dari padatan kalisum karbonat dan kalsium klorida. Selanjutnya dibuat larutan kalsium dengan konsentrasi 1000 ppm. Arus lampu yang digunakan sebesar 10,0 mA dengan tipe nyala okigen-asetilen. Gangguan kimia yang umumnya ditemukan pada penggunaan nyala oksigen-asetilen. Penambahan larutan Lanthan membantu menghilangkan gangguan pada nyala tersebut. Untuk pengukuran kalsium dengan SSA panjang gelombang yang digunakan adalah 422,7 nm dengan lebar celah 0,5 nm, rentang kera optimum 1-4 (µg/ml), dan sensitifitas 0,02 (µg/ml). (Athanasopoulos, N, 2005:9).
2.2.2 Gangguan Pada Spektrofotometri Serapan Atom
Ada beberapa kendala yang masih bisa ditemui dalam penggunaaan Spektrofotometri Serapan Atom. Kendala-kendala ini antara lain gangguan kimia, efek ionisasi, dan efek viskositas pada kecepatan nebulisasi. Karena konsentrasi elemen analit dianggap sebanding dengan keadaan dasar atom di dalam api maka, faktor apapun yang mempengaruhi keadaan dasar elemen analit dapat diklasifikasikan sebagai suatu gangguan. Gangguan yang paling umum terjadi pada analisis dengan SSA adalah sebagai berikut:
10
a. Spektral interferensi disebabkan oleh radiasi yang tumpang tindih bahwa dari sumber cahaya. Gangguan radiasi yang mungkin merupakan garis emisi dari unsur atau senyawa lain, atau radiasi latar belakang umum dari api, pelarut, atau analisis sampel. Ini biasanya terjadi ketika menggunakan pelarut organik, tetapi dapat juga terjadi ketika menentukan hadir natrium dengan magnesium, besi dengan tembaga atau besi dengan nikel.
b. Pembentukan senyawa yang tidak terdisosiasi dalam api. Contoh yang paling umum adalah pembentukan fosfat kalsium dan strontium.
c. Ionisasi dari analit mengurangi sinyal. Ini biasanya terjadi pada barium, kalsium, strontium,natrium dan kalium.
d. Matrix gangguan yang disebabkan oleh perbedaan antara tegangan permukaan dan viskositas solusi dan tes standar.
e. Memperluas dari garis spektral, yang dapat terjadi karena sejumlah faktor. Yang paling umum adalah efek memperluas linewidth:
a) Efek Doppler : Efek ini muncul karena atom akan memiliki kecepatan komponen yang berbeda sepanjang garis pengamatan.
b) Efek Lorentz : Efek ini terjadi sebagai akibat dari konsentrasi atom asing hadir di lingkungan memancarkan atau menyerap atom. Besarnya bervariasi perluasan dengan tekanan gas asing dan sifat-sifat fisik mereka. c) Efek pendinginan : Dalam tekanan rendah spektral sumber, pendinginan
tumbukan dapat terjadi dalam api sebagai akibat dari kehadiran molekul gas asing dengan tingkat getaran yang sangat dekat dengan keadaan garis resonansi.
11
d) Efek pembalikan diri : Atom dari jenis yang sama seperti yang memancarkan radiasi akan menyerap radiasi maksimum pada garis tengah daripada di sayap, yang mengakibatkan perubahan bentuk garis serta intensitasnya. Efek ini menjadi serius jika uap yang menyerap radiasi jauh lebih dingin daripada yang memancarkan radiasi. (Bassett, J, et all, 1994;955-956).
2.3 Validasi Metode
Secara umum, laboratorium penguji pangan menggunakan metode-metode standar (CODEX, AOAC, dan standar nasional lainnya) yang secara ekstensif telah divalidasi melalui percobaan-percobaan antar laboratorium. Namun demikian, tanggung jawab tetap kepada pengguna untuk mendokumentasikan validasi metode dilakukan untuk memenuhi kebutuhan dari laboratorium itu sendiri. Validasi metode adalah suatu proses konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa suatu metode mempunyai unjuk kerja yang konsisten, sesuai dengan apa yang dikehendaki dalam penerapan metode tersebut ( ISO 17025-2005: 5.4.5.1).
Jika suatu metode tidak cukup divalidasi, maka metode tersebut dapat menghasilkan hasil yang salah, dan berakibat hasil tersebut tidak dapat dipercaya. Sebagai contoh, produk pangan yang diekspor mempersyaratkan hasil yang akurat dan dapat dipercaya oleh kedua belah pihak baik negara eksportir maupun importir, dan lebih penting adalah persetujuan hasil dari metode analisa yang distandardisasi. (Mustopa, 2005;2).
12
Semua operasi dan pengukuran dalam metode analisa mempunyai kesalahan yang melekat pada setiap metode. Maka setiap metode yang digunakan laboratorium harus dievaluasi dan diuji kembali untuk menjamin bahwa unjuk kerja suatu metode dapat dimengerti dan menghasilkan data yang sesuai dengan tujuan.
Validasi metode menilai kinerja metode analisa dan menentukan apakah suatu metode cocok dengan tujuan. Data yang dihasilkan menentukan lingkup dan keterbatasan suatu metode, dan keterbatasan suatu parameter pengendalian mutu yang dikembangkan untuk analisa rutin. Validasi metode memberikan tingkat kepercayaan pada hasil analisa dari suatu metode.
Ketika suatu metode baru dikembangkan melalui prosedur penelitian yang dapat dipercaya atau metode standar yang dimodifikasi untuk memenuhi persyaratan khusus, validasi diperlukan pada tahap proses uji tersebut. Data yang dihasilkan selama proses validasi metode memberikan informasi untuk penghitungan estimasi ketidakpastian pengukuran. Proses validasi harus paling tidak mencakup:
2.3.1 Rentang kerja (Linieritas dan Working Range)
Linearitas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon yang proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas menunjukan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam contoh pada kisaran konsentrasi tertentu.
13
Linearitas ditentukan dengan cara membuat kurva kalibrasi dari beberapa set deret larutan strandar yang telah diketahui konsentrasimya (minimal 5 deret larutan standar) . Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah koefisien korelasi (R) yang digunakan untuk mengetahui linearitas suatu metode analisis. Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persayaratan adalah :
- >/= 0,9970 (ICH 1995)
- >/= 0,9980 (WA Laboratory Operations Manager) - >/= 0,9980 (AOAC)
2.3.2 Batas Deteksi (LOD Limit of Detection)
Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko.
Jika blanko tidak menghasilkan sinyal sehingga standar deviasi dari 10 pembacaan tehadap blanko yang sama adalah nol, maka LOD diukur dengan
menggunakan standar.
Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blangko dan formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan.
14
LOD = 3 (SD/b)………2.2 LOD = Rb/Rs + 3s………2.3 Keterangan:
SD = Simpangan baku blanko/deret standar b = Kemiringan garis regresi (Y=bx+a) Rb/Rs = Rata-rata blanko/Rata-rata deret standar
S = Standar deviasi dari blanko contoh/deret standar
2.3.3 Batas kuantitasi (LOQ Limit of Quantitation)
Batas kuantitasi adalah konsentrasi terendah analit yang dapat ditentukan dengan akurasi yang bisa diterima. Untuk metode non instrument umumnya ditentukan dengan melakukan analisis sampel yang mengandung analit dalam jumlah yang diketahui lalu menetapkan kadar terendah analit yang dapat dideteksi dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima.
Untuk metode instrumental umunya dengan mengukur besarnya respon latar belakang analisis dengan cara menganalisis sejumlah larutan blanko sampel (yang mengandung analit) jika data blanko tidak memberikan menghasilkan sinyal sehingga SD (standar deviasi) dari blanko tersebut adalah nol maka SD diganti dari data deret standar sekurang-kurangnya 7x pengulangan. Untuk menghitung LOQ dapat digunakan rumusan:
LOQ = 10 (SD/b)………..2.4 LOQ = Rb/Rs + 3s………2.5 Keterangan:
SD = Simpangan baku blanko/deret standar b = Kemiringan garis regresi (Y=bx+a)
S = Standar deviasi dari blanko contoh/deret standar
15 2.3.4 Selektifitas (selectivity)
Selektifitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil uraian, senyawa sejenis, senyawa asing lainya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan.
Untuk identifikasi metode harus mampu menyeleksi senyawa-senyawa yang ada dalam sampel yang berkaitan dengan struktur molekulnya. Dapat dibuktikan dengan hasil postif (atau dibandingkan dengan bahan acuan standar yang diketahui) dari sampel yang mengandung analit dan digabung dengan hasil negatif dari sampel yang tidak mengandung analit.
Untuk penetapan cemaran dapat dilakukan dengan menguji sampel yang ditambahkan sejumlah tertentu cemaran atau hasil uraian dan terlihat dengan nyata cemaran itu dapat ditetapkan secara akurat dengan presisi yang memadai. Jika cemaran tidak tersedia maka sampel yang diuji harus diperlakukan sebelumnya dengan menyimpan sampel dalam kondisi stress yang relevan (cahaya, panas, kelembaban, hidrolisis asam/basa oksidasi). Dalam kasus ini pengujian dilakukan bersama sampel utuh.
2.3.5 Akurasi
Kecermatan atau akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya dinyatakan dengan nilai sebenarnya (true value) atau nilai yang dianggap benar (accepted value).
16
Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur.
Ada 3 cara dalam metode uji akurasi yaitu: a. Uji pungut ulang (Recovery test)
Pada uji pungut ulang prinsipnya uji dilakukan dengan penentuan perolehan kembali yang ditetapkan dengan cara menambahkan analit dalam jumlah sampel tertentu ke dalam tempat yang mengandung analit yang sama dan ditentukan harga persen perolehan kembali. Uuntuk analisis harga persen perolehan kembali antara 80-110%. Makin dekat hasil analisis yang diperoleh dengan nilai yang sebenarnya maka akurasinya semakin tinggi. Dihitung persen perolehan kembali (% recovery) dengan rumus:
% Recovery = (ି)
x 100%...2.6 Keterangan:
A = Jumlah total analit setelah ditambahkan baku B = Jumlah total analit sebelum ditambahkan baku
C = Baku yang ditambahkan ke dalam analit. .(Harmita, 2004:117). b. Uji relatif terhadap akurasi metode baku
Pada prinsipnya uji dilakukan dengan mengerjakan pengujian paralel atas contoh uji yang sama menggunakan metode uji yang sedang dievaluasi dan metode uji lain yang telah diakui sebagai metode baku.
17
c. Uji terhadap standar reference material (SRM)
Uji terhadap SRM untuk mengevaluasi akurasi suatu metode uji dilakukan dengan menguji SRM dengan menggunakan metode uji yang sedang dievaluasi. Referensi materi dicirikan dengan prosedur metrologically berlaku untuk satu atau lebih sifat tertentu, disertai dengan sertifikat yang memberikan nilai dari properti tertentu, ketidakpastian yang terkait, dan pernyataan ketertelusuran metrologidari bahan tersebut.
2.3.6 Presisi
Reabilitas estimasi atau presisi adalah pengukuran bias random dari suatu metode. Dengan demikian makin besar jumlah ulangan yang dilakukan, kualitas hasil uji makin menglalami peningkatan. Untuk mengukur presisi suatu metode uji dilakukan dengan:
a. Uji ketahanan
Uji ketahanan dilakukan untuk mengetahui perubahan reabilitas metode uji dengan berjalannya waktu karena rentannya metode uji terhadap adanya perubahan kondisi pengujian. Dalam uji ketrahanan ini dilakukan identifikasi faktor-faktor kritis dalam metode uji, mulai dari preparasi contoh uji sampel dengan penetapanya.
b. Uji Repitabilitas
Uji repetabilitas dilakukan untuk mengetahui variabelitas data yang dihasilkan pada dua pengujian berurutan pada kondisi yang sama. Perbedaan
18
absolut kedua data hasil uji diharapkan berada dalam kisaran konfidensi 95%.(Mustopa, 2005;6-7).
c. Uji Reprodusibilitas
Uji reprodusibilitas adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui variabilitas yang dihasilkan pada dua pengujian contoh identik pada kondisi yang berbeda. Perbedaan absolut antara masing-masing data hasil uji diharapkan berada dalam kisaran 95%.
Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi kurang dari 2% Relatif Standar Deviasi (RSD) dengan rumus: SD = ඥ∑(ି)మ ିଵ ……….2.7 % RSD = ௌ x 100%...2.8 Keterangan: Xi = kadar sampel
X = kadar rata-rata sampel n = jumlah perlakuan
2.3.7 Ketangguhan (Ruggedness)
Ketangguhan metode adalah nilai hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dll. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara lab dan antar analis.
19
Ketangguhan metode ditentukan dengan menganalisis sampel yang homogen dalam lab yang berbeda oleh analisis yang berbeda menggunakan kondisi operasi yang berbeda, dan lingkungan yang berbeda tetapi menggunakan prosedur dan parameter uji yang sama. Hasil uji kemudian ditentukan sebagai fungsi dari variabel penentuan. Ketertiruan dapat dibandingkan terhadap keseksamaan penentuan di bawah kondisi normal untuk mendapatkan ukuran ketangguhan metode. (Achmad, 2000;3-6)
Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. Parameter-parameter tersebut harus dinyatakan secara jelas didalam metode yang didokumentasikan sehingga pengguna dapat mengakses keberterimaan metode untuk tujuan tertentu.
