EFEKTIVITAS EKSTRAK DAUN UNGU UNTUK
MENURUNKAN KADAR TNFα DAN NO
Studi eksperimental pada mencit Swissyang diinfeksi Staphylococcus aureus
Effectiveness of Extract Gratophyllum pictum (L.) Leaves to Reduce
Level of TNFα and NO
Experimental studies in Swiss mice infected by Staphylococcus
aureus
Tesis
Untuk memenuhi sebagian persyaratan Mencapai derajat Sarjana S-2
Magister Ilmu Biomedik
Nur Patria Tjahjani 22010113410004
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO
SEMARANG
2015
TESIS
EFEKTIVITAS EKSTRAK DAUN UNGU UNTUK
MENURUNKAN KADAR TNFα DAN NO
Studi eksperimental pada mencit Swiss yang diinfeksi Staphylococcus aureus
Disusun oleh :
Nur Patria Tjahjani 22010113410004
telah dipertahankan di depan Tim Penguji pada tanggal 17 Juni 2015
dan dinyatakan telah memenuhi syarat untuk diterima
Menyetujui Pembimbing
Pembimbing I Pembimbing II
Prof.Dr.dr.Tri Nur Kristina,DMM.,M.Kes dr. Endang Sri Lestari, PhD NIP. 195905271986032001 NIP.196610161997022001
Mengetahui :
Ketua Program Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro
.dr. A. Zulfa Juniarto, MSi Med, Sp.And,PhD NIP. 197006081997021001
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis ini adalah hasil pekerjaan saya sendiri
dan di dalamnya tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh
gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan lembaga pendidikan lainnya, serta
tidak terdapat unsur-unsur yang tergolong plagiarism sebagaimana dimaksud
dalam PerMendiknas No.17 Tahun 2010.Pengetahuan yang diperoleh dari hasil
penerbitan maupun yang belum atau tidak diterbitkan, sumbernya dijelaskan di
dalam tulisan dan daftar pustaka.
Semarang,Juni 2015
Nur Patria Tjahjani
RIWAYAT HIDUP
A. Identitas
Nama : Nur Patria Tjahjani, S.Si.,Apt. Tempat/tanggal lahir : Surakarta, 5 Januari 1971 Agama : Islam
Jenis Kelamin : Perempuan.
B. Riwayat Pendidikan
1. SDN Sompok II Semarang : Lulus Tahun 1983 2. SMPN 2 Semarang : Lulus Tahun 1986 3. SMAN 1 Semarang : Lulus Tahun 1989 4. Fak. Farmasi UGM Yogyakarta : Lulus Tahun 1996 5. Magister Ilmu Biomedik UNDIP Semarang : 2013 – Sekarang.
C. Riwayat Pekerjaan
1. Tahun 1996 – Sekarang : Staf Pengajar Tetap DIII Analis Farmasi dan Makanan 17 Agustus 1945 Semarang
2. Tahun 1996 – Sekarang : Apoteker Penanggung Jawab Apotek Fortuna Semarang.
3. Tahun 2009 – Sekarang : Staf Pengajar Tidak tetap di Poltekkes Kemenkes Negeri Jurusan Analis Kesehatan Semarang.
D. Riwayat Keluarga
1. Nama Suami : Dwi Nugroho, SH 2. Nama Anak : Fatkhan Maulana Akbar
Fahmi Nur Rizki Madani Fahma Nurrudina
Fadlan Noorikhsan
KATA PENGANTAR
Segala puji kehadirat Allah SWT atas rahmat, nikmat dan perkenan-Nya
sehingga dapat diselesaikannya tesis dengan judul “Efektivitas Ekstrak Daun
Ungu Untuk Menurunkan Kadar TNF-α dan NO (Studi eksperimental pada
mencit Swiss yang diinfeksi Staphylococcus aureus )". Tesis ini disusun sebagai
bagian dari tugas akhir dalam rangka menyelesaikan studi di Program Magister
Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro.Dalam penyelesaian
tesis ini, penulis banyak mendapatkan bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu
penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan kepada :
1. Rektor Universitas Diponegoro yang telah memberikan ijin dan kesempatan kepada penulis untuk meningkatkan ilmu pengetahuan pada
program studi ilmu biomedik.
2. Prof. Dr. dr. Tri Nur Kristina, DMM, M.Kes, Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang dan selaku dosen pembimbing I atas
segala kesabaran dan ketulusannya yang telah banyak meluangkan waktu,
tenaga, pengarahan, serta memberikan dorongan, inspirasi kepada penulis
dalam menyelesaikan tesis ini.
3. dr. Endang Sri Lestari, Ph.D, selaku dosen pembimbing II atas segala kesabaran dan ketulusannya yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga,
pengarahan dan memberikan dorongan, motivasi kepada penulis dalam
menyelesaikan tesis ini.
4. dr. Achmad Zulfa Juniarto, MSi. Med.Sp.And.Ph.D, Ketua Program Studi Ilmu Biomedik Program Pasca Sarjana Universitas Diponegoro yang telah
memberikan ijin dan kesempatan untuk menempuh pendidikan.
5. Dr.dr. RA Kisdjamiatun RMD, MSc, dan Dr.dr. Nyoman Suci Widyastiti, M.Kes,Sp.PK selaku tim penguji yang telah memberi masukan dan saran.
6. Seluruh Guru Besar dan Dosen di lingkungan Magister Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro yang telah memberikan pengetahuan
dan ilmunya selama penulis menempuh pendidikan.
7. Seluruh jajaran civitas akademika AKAFARMA-AAK 17 Agustus 1945 yang telah memberi dukungan moril dan materiil sehingga penulis dapat
melaksanakan studi lanjut.
8. Ririn Lispita Wulandari S.Farm.,Apt dan Annaas Setyawan Ns, terimakasih atas kebersamaannya, bantuan dan motivasinya sehingga
penulis dapat menyelesaikan tesis ini.
9. dr. Fransisca PH, MSi.Med., terimakasih atas bantuan dan motivasinya. 10. Suami (Dwi Nugroho) dan anak-anakku tercinta (Fatkhan Maulana Akbar,
Fahmi Nur Rizki Madani, Fahma Nurrudina, dan Fadlan Noorikhsan)
yang tiada henti memberikan doa, semangat, dukungan, yang sangat
berharga bagi penulis
11. Semua pihak yang telah membantu dan tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, atas budi baik mereka penulis sampaikan terima kasih.
Keterbatasan pengalaman, pengetahuan, dan pustaka dari penulis sehingga
tesis ini masih banyak kekurangan dan kelemahan.Untuk itu, saran dan kritik yang
konstruktif sangat membantu agar tesis ini dapat menjadi lebih baik dan sebagai
masukan bagi penulis untuk penelitian selanjutnya.
Akhir kata, semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi para pembaca dan
dapat meningkatkan penggunaan tanaman obat asli Indonesia supaya menjadi tuan
rumah di negeri sendiri.
Semarang, Juni 2015
Nur Patria Tjahjani
DAFTAR ISI
Halaman
Halaman Judul ... i
Lembar Pengesahan ... ii
Lembar Monitoring ... iii
Pernyataan ... iv
Riwayat Hidup ... v
Kata Pengantar ... vi
Daftar Isi ... ix
Daftar Tabel ... xiv
Daftar Gambar ... xv
Daftar Grafik... xvi
Daftar Lampiran ... xvii
Daftar Singkatan ... xviii
Abstrak ... xx BAB I PENDAHULUAN ... 1 1.1 Latar Belakang ... 1 1.2 Perumusan Masalah ... 4 1.3 TujuanPenelitian ... 4 1.4 Manfaat Penelitian ... 4 1.5 Orisinalitas Penelitian ... 5 ix
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 7
2.1 Tumor Necrosis Factor α (TNF-α) ... 7
2.2 Nitrit Oksida ... 8
2.2.1 Pembentukan NO teraktivasi ... 8
2.3 Hubungan antara TNF-α dan NO ... 10
2.4Staphylococcus ... 11
2.4.1 Morfologidan Identifikasi S. aureus ... 11
2.4.2 Struktur BakteriS. aureus ... 12
2.4.3 Faktor Virulensi S. aureus ... 13
2.4.4KlasifikasiS. aureus ... 14
2.4.5 Patogenesis ... 14
2.4.6Molekuler Patogenesis ... 15
2.5Respon Imunitas karena infeksi S. aureus ... 17
2.5.1 Respon imunitas seluler ... 17
2.5.2 Mekanisme Respon Imunitas ... 18
2.6 Daun Ungu ... 21
2.6.1 Taksonomi Daun Ungu ... 21
2.6.2Deskripsi ... 22
2.6.3Khasiatdan Kandungan Kimia Daun Ungu ... 23
2.6.4 Kandungan Kimia Aktif ... 23
2.6.5Respon Imunitas Kandungan Kimia Aktif ... 24
2.7 Mencit ... 26 2.7.1 Taksonomi Mencit ... 26 2.8 Penentuan Dosis ... 26 2.9Kerangka Teori ... 28 2.10Kerangka Konsep ... 29 2.11Hipotesis ... 29
BAB III METODE PENELITIAN ... 30
3.1 Ruang Lingkup Penelitian ... 30
3.2 Rancangan Penelitian... 30
3.3 Tempat dan Waktu Penelitian ... 32
3.4 Populasi dan Sampel ... 33
3.4.1 Populasi ... 33
3.4.2 Sampel ... 33
3.5 Kriteria Inklusi, Eksklusi dan Drop Out ... 33
3.5.1 Kriteria Inklusi ... 33
3.5.2 Kriteria Eksklusi ... 34
3.5.3Kriteria Drop Out ... 34
3.6 Variabel Penelitian ... 34
3.6.1 Variabel Bebas ... 34
3.6.2 Variabel Tergantung ... 34
3.7 Definisi Operasional Variabel ... 35
3.8Analisis Data ... 35
3.9 Alat, Bahan, dan Reagen Penelitian ... 37
3.10 Prosedur Pembuatan Ekstrak ... 40
3.10.1 Determinasi Daun Ungu ... 40
3.10.2 Pengeringan dan Penyiapan Sampel ... 40
3.10.3 Pembuatan Ekstrak Daun Ungu ... 41
3.11Perhitungan Dosis ... 41
3.12Mikrobiologi ... 43
3.12.1 Pembuatan Standar Kekeruhan Larutan ... 43
3.12.2 Prosedur kultur dan Pengenceran Suspensi Bakteri Uji ... 43
3.12.3 Pemeriksaan Bakterimia ... 44
3.13Cara Euthanasi Hewan Coba ... 44
3.14Prosedur Pengumpulan Data ... 45
3.14.1 Persiapan Sebelum Penelitian ... 45
3.14.2 Perlakuan Terhadap Mencit ... 46
3.14.3 Prosedur Pembuatan Kultur Makrofag ... 47
3.14.4 Prosedur Pemeriksaan Kadar TNF-α ... 49
3.14.5 Prosedur Pemeriksaan Kadar NO ... 52
3.15 Alur Kerja Penelitian ... 54
3.16 Etika Penelitian ... 55
BAB IV HASIL PENELITIAN ... 56
4.1 Perbandingan Kadar TNF-α antar Kelompok Perlakuan ... 58
4.2 Perbandingan Kadar NO antar Kelompok Perlakuan ... 59
4.3 Uji Korelasi Kadar TNF-α dan NO ... 61
BAB V PEMBAHASAN ... 62
5.1 Kadar TNF-α ... 62
5.2 Kadar NO ... 65
5.3 Hubungan antara Kadar TNF-α dan Kadar NO ... 66
5.4 Keterbatasan Penelitian... 68 SIMPULAN……….. ... 69 SARAN……….. ... 69 DAFTAR PUSTAKA……….. ... 70 LAMPIRAN……….. ... 77 xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Orisinalitas Penelitian ... 5
Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia Daun Ungu ... 23
Tabel 3. Rancangan Eksperimental ... 32
Tabel 4.Definisi Operasional Variabel ... 35
Tabel 5. Pemeriksaan Bakteri S. aureus pada Kultur Darah ... 57
Tabel 6. Uji LSD Kadar TNF-α ... 59
Tabel 7. Uji Mann-Whitney Kadar NO ... 61
Tabel 8. Uji Korelasi Spearman Kadar TNF-α dan NO ... 61
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Sintesis Nitrit Oksida ... 9
Gambar 2.Staphylococcus aureus ... 12
Gambar 3. Struktur Dinding Sel S. aureus ... 13
Gambar 4. Mekanisme Respon Imunitas Bakteri Intraseluler... 19
Gambar 5. Respon imunitas nonspesifik dan spesifik ... 20
Gambar 6. Daun Ungu ... 22
Gambar 7. Desain Rancangan Penelitian ... 30
DAFTAR GRAFIK
Halaman
Grafik 1. Rerata Kadar TNF-α dari supernatan Kultur Makrofag Peritoneal.. ... 58
Grafik 2. Rerata Kadar NO dari supernatan Kultur Makrofag Peritoneal ... 60
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Hasil Pengukuran Kadar TNF-α ... 77
Lampiran 2. Hasil Pengukuran Kadar NO ... 80
Lampiran 3. Hasil analisis statistik Kadar TNF-α ... 83
Lampiran 4. Hasil analisis statistik Kadar NO ... 87
Lampiran 5. Hasil analisis Korelasi Spearman Kadar TNF-α dan NO ... 95
Lampiran 6. Pembuatan Suspensi Ekstrak daun Ungu ... 97
Lampiran 7. Perhitungan Sel pada Kultur Sel Makrofag Peritoneal ... 98
Lampiran 8. Pembuatan Larutan Standar untuk Penetapan Kadar NO ... 99
Lampiran 9. Dokumentasi ... 100
Lampiran 10. Surat Keterangan ... 103
1. Surat Keterangan Ethical Clearance
2. Surat Keterangan Pemeliharaan Hewan Coba 3. Surat Keterangan Determinasi Tanaman Daun Ungu. 4. Surat Keterangan Pembuatan Ekstrak Daun Ungu
5. Surat Keterangan Selesai Melaksanakan Pengujian Penelitian di Unit Layanan Penelitian Pra-Klinik dan Pengembangan Hewan
Percobaan (LP3HP)LPPT UGM.
6. Surat Keterangan Selesai Melaksanakan Pengujian Penelitian TNF-α dan NO di LPPT UGM.
DAFTAR SINGKATAN
APC : Antigen Presenting Cell BA : Blood Agar
BAP : Blood Agar Plate BH4 : Tetrahydrobiopterin CD : Cluster of Differentiation CHIP : Chemotaxis Inhibitory Protein
Eap : Extracellular adherence protein (Eap) FAD : Flavin Adenin Dinukleotida
FBS : Foetal Bovine Serum FMN : Flavin Mono Nukleotida HIB : Heart Infusion Broth
ICAM : Intercelluler adhesion molecule IFN-γ : Interferron Gamma
IL : Interleukin
iNOS : inducible Nitric Oxide Synthase KHM : Konsentrasi Hambat Minimal LPS : Lipopolisakarida
LTB : Leukotrien B
MHC : Major Histocompatibility Complex
MRSA : Methicillin Resistant Staphylococcus aureus xviii
NK : Natural Killer
NADPH : Nicotinamide Adenin Dinucleotida NO : Nitrit Oksida
NOS : Nitric Oxide Synthase PAF : Platelet Activating Factor PBS : Phosphat Buffer Saline PRMB : Phenol Red Mannitol Broth RNI : Reactive Nitrogen Intermediate RPMI : Roswell Park Memorial Institute ROI : Reactive Oxigen Intermediate TCR : T Cell Receptor
Th : Sel T Helper TLR : Toll Like Receptor TNF-α : Tumor Necrosis Factor α TNFR : Tumor Necrosis Factor Receptor
Abstrak
Latar Belakang: Ekstrak daun Ungu (Gratophyllum pictum L.) mengandung
senyawa fitokimia aktif seperti alkaloid, tannin dan flavonoid yang mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus.Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan efektivitas pemberian ekstrak daun Ungu dalam menurunkan kadar TNF-α dan NO pada mencit Swiss yang diinfeksi dengan S. aureus.
Metode: Penelitian ini adalah Post Test Only Randomized Control Group
Designdengan menggunakan mencitSwiss sebanyak 30 ekor yang dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan yaitu K(-) mencit sehat; K(+) mencit yang diinfeksi S. aureus; P1, P2, P3 diinfeksi S.aureus dan diberi ekstrak daun ungu 75, 150, 300 mg/kgBB/ hari selama 7 hari. Pengukuran kadar TNF-α dan NO dari supernatan kultur makrofag peritoneal dilakukandengan menggunakan ELISA dan microplate reader.
Hasil: Rerata kadar TNF-α kelompok K(-), K(+), P1, P2, P3 secara berurutan
300,29;550,29; 390,34; 517,67; dan 327,55 pg/ml. Uji One Way ANOVA menunjukkan ada perbedaan bermakna pada kelima kelompok perlakuan (p= 0,001), uji Post Hoc LSD kelompok P1 dan P3 berbeda bermakna dengan kelompok K(+) dengan p = 0,013 dan p = 0,001. Rerata kadar NO kelompok K(-), K(+), P1, P2, P3 secara berurutan adalah 1,32 ; 3,56 ; 2,50 ; 2,64 ; 1,56 µM/ml.Hasil uji Mann-Whitney menunjukkan bahwa kadar NO berbeda bermakna antara kelompok K(+) dengan P3 dengan p=0.037. Hasil uji korelasi Spearman terdapat korelasi positif antara TNF α dan NO dengan hasil bervariasi pada setiap kelompok perlakuan (rs=0,143 – 0,657).
Simpulan: Pemberian ekstrak daun Ungu dosis 300mg/kgBB/hari selama 7 hari
secara bermakna dapat menurunkan kadar TNF-α dan NO pada mencit Swiss yang diinfeksi S. aureus.
Kata kunci : Ekstrak daun Ungu, Staphylococcus aureus, TNF-α, NO.
Abstract
Background: Extract of Gratophyllum pictum L. leaves containactive
phytochemical compounds such as alkaloids, tannins and flavonoids, which have antibacterial activity against Staphylococcus aureus. This study aims to prove the effectiveness of extract of G. pictum L.to reduce the level of TNF-α and NO in Swiss mice infected with S. aureus.
Methods: The study was a Randomized Post Test OnlyControl Group design by
using 30 Swiss mice thatwere divided into 5 groups, consist of : K (-) normal mice ; K(+) mice were infected with S. aureus ; P1 , P2 , P3 were infected with S. aureus and given extract of G. pictum leaves 75, 150, and300 mg/kgBW/day for 7 days . The measurement of TNF-α and NOlevel were done from peritoneal macrophages culture supernatant byusing ELISA and microplate reader .
Results: Mean levels of TNF-α group K ( - ) , K ( + ) , P1 , P2 , P3 were 300.29 ;
550.29 ; 390.34 ; 517.67 ; 327.55 pg / mlrespectively. One Way ANOVA test showedthere was significant differences between all treatment groups (p= 0.001), LSD Post Hoc test revealedP1 and P3 groups different significantly with K(+) with p= 0.013 and p = 0.001. Mean levels of NO group K (-), K (+), P1, P2, P3 were 1.32; 3.56 ; 2.50 ; 2.64 ; 1.56 µM / mlrespectively.Mann-Whitney Test showed that levels of NO significantly different between K(+) with P3 with p=0,037.Spearman correlation test results are positive correlation between TNF-α and NO with the variation results on each treatment groups (rs 0,143 – 0,657 ).
Conclusion: Extract G. pictum leaves 300 mg/kgBW/day for 7 days can
significantly reduce levels of TNF-α and NO in Swiss mice infected by S. aureus.
Keywords : Extract of Gratophylum pictum leaves,Staphylococcus aureus, TNF-α, NO .
