Artikel diterima: 29 Agustus 2018 294 Diterima untuk diterbitkan: 25 September 2018
Diterbitkan: 31 Oktober 2018
PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DAN UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK DAUN AFRIKA (Vernonia amygdalina Del.) PADA MENCIT JANTAN DDY Christine Meidiawati*, Ummu Mastna Zuhri, Sesilia Andriani Keban,
Wiwi Winarti1
Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila Email: christinemeidiawati@gmail.com
ABSTRAK
Salah satu tanaman berkhasiat antifertilitas yang banyak tumbuh adalah daun afrika (Vernonia amygdalina Del). Tanaman ini secara empiris untuk mengobati berbagai penyakit, namun belum ada data ilmiahnya. Penelitian ini bertujuan memperoleh ekstrak etanol 70% daun Vernonia amygdalina Del. yang aman digunakan dalam dosis tertentu terhadap hewan uji mencit DDY. Penapisan fitokimia dilakukan berdasarkan pustaka Farnsworth dan Departemen Kesehatan Republik Indonesia tahun 2000. Penetapan kadar flavonoid total menggunakan metode kolorimetri aluminium klorida dan alkaloid total dengan metode kompleks bromocresol green. Uji keamanan I yang dilakukan adalah uji toksisitas akut (LD₅₀) dengan metode Weil C.S. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak daun Afrika mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, kuinon, dan steroid/triterpenoid. Kadar flavonoid totalnya adalah 1,27%, sedangkan uji keamanan I ditemukan bahwa ekstrak etanol 70% daun Afrika memiliki LD50 yang lebih besar dari 16 g/kg BB termasuk dalam kategori praktis tidak toksik.
Kata kunci: Vernonia amygdalina Del., flavonoid, toksisitas akut ABSTRACT
One of the plants that is efficacious as an antifertilitas that grows is Vernonia amygdalina Del. This plant empirically has been to treat various diseases, but have no scientific data. Aims of this research is to obtain a ethanol 70% extract of leaves of Vernonia amygdalina Del. which safely for use to test animals mice DDY. Phytochemical screening carried out based on the literature from Farnsworth and the Ministry of Health of the Republic of Indonesia (2000). Determination of total flavonoid using the colorimetric method of aluminum chloride and total alkaloid with complex methods bromocresol green. Safety testing I which is conducted is acute toxicity test (LD₅₀) by the method of Weil C.S. The results showed that the Africa leaf extract contains alkaloids, flavonoids, saponins, tannins, quinones, and steroids/triterpenoids. It was found that the levels of total flavonoids was 1.27%, while for safety testing I are found that the 70% ethanol extract of Africa leaves has a LD50 greater than 16 g / kg that are categorized practically non-toxic.
295 PENDAHULUAN
Pertambahan penduduk di Indonesia setiap tahun terus meningkat. Berdasarkan laporan data statistik Indonesia, hal ini tidak lepas dari tingginya angka kelahiran bayi yang mencapai 4,5 juta/tahun (BPS, 2013). Program KB telah berjalan lama, namun kesadaran masyarakat akan pentingnya program ini masih rendah. Sebanyak 95% penduduk Indonesia telah mengetahui program KB, tetapi yang mengikuti program KB hanya 61%. Beberapa alasan yang membuat enggan mengikuti program KB karena khawatir efek sampingnya, prosedur penggunaan yang rumit, dan jarang membutuhkan tenaga ahli untuk menggunakannya (Harnowo, 2012).
Salah satu cara mencegah kehamilan yang umum digunakan masyarakat yakni penggunaan obat antifertilitas. Obat antifertilitas yang umum tersedia di Indonesia berupa pil dosis tinggi yang mengandung estrogen 50 – 150 mcg dan progesteron 1 – 10 mg, pil dosis rendah yang mengandung estrogen 30 – 50 mcg dan progesteron 1 mg, serta pil mini yang mengandung
progesteron kurang dari 1 mg. Ketiga jenis obat antifertilitas tersebut memiliki kekurangan masing-masing, diantaranya memerlukan kedisiplinan dari pemakai, mengurangi ASI pada pil yang mengandung estrogen, meningkatkan resiko infeksi klamidia, kembalinya kesuburan agak lambat (gangguan siklus kesuburan), dan tidak dianjurkan pada wanita berumur di atas 30 tahun karena akan mempengaruhi keseimbangan metabolisme tubuh. Selain itu, obat antifertilitas ini juga memiliki efek samping, diantaranya pendarahan, tekanan darah tinggi, retensi cairan, perubahan berat badan, anemia, tromboemboli, rambut rontok, depresi, pusing dan sakit kepala. Penggunaan obat antifertilitas oral umumnya memiliki kontraindikasi dengan pengguna yang memiliki penyakit hipertensi, diabetes, dan hiperkolesterolemia, sehingga tidak semua orang dapat menggunakan obat antifertilitas (MedlinePlus, 2012; Petitti, 2003; Donna & Siri, 2006; Pramilla & Malcolm, 2008).
Mengingat masih adanya kekurangan dan efek samping yang ditimbulkan akibat penggunaan obat
296 antifertilitas oral, maka saat ini
banyak peneliti yang terdorong menemukan sumber bahan antifertilitas yang berasal dari tanaman. Salah satu tanaman yang banyak tumbuh di lingkungan sekitar kita adalah Vernonia amygdalina Del. Tanaman ini merupakan pohon kecil yang tumbuh di daerah Afrika tropis. Di beberapa bagian barat Afrika, tanaman ini dikenal dengan sebutan “bitter-leaf” karena rasa daunnya yang pahit. Di Indonesia, tanaman ini juga dikenal dengan sebutan daun Afrika Selatan. Daun dari tanaman ini banyak digunakan sebagai sayuran dan obat berbagai penyakit seperti diabetes, kolesterol tinggi, dan hipertensi. Walaupun penggunaan tanaman ini secara empiris sudah banyak dilakukan, namun belum diperkuat oleh data ilmiah.
Senyawa yang dikandung oleh tanaman Vernonia amygdalina Del. meliputi: antrakuinon (+++), tanin terlarut (++), tanin terkondensasi (+), flavonoid (+), alkaloid (+++), alkaloid indol (+), alkaloid steroid (+++), saponin (+++), glikosida (++), dan terpenoid (+++) (Sani dkk., 2012). Berdasarkan kandungannya
maka tanaman ini mengandung saponin untuk sintesis hormon steroid dan digunakan sebagai estrogen kontraseptif. Alkaloid steroid sangat mirip dengan saponin yang digunakan sebagai bahan dasar sintesis beberapa hormon steroid untuk bahan kontrasepsi oral (Robinson dkk., 2009). Sementara flavonoid diketahui dapat merangsang pembentukan estrogen pada mamalia dan strukturnya ada keserupaan keruangan dengan hormon estrogenik. Struktur yang analog dengan hormon ini akan mengikat diri pada reseptor dan bekerja menghambat reseptor tersebut (Koeman, 1983). Senyawa tanin yang terkandung di dalam daun Afrika dapat menghambat pertumbuhan sel dan bersifat sitotoksik pada sel yang mengalami pembelahan cepat seperti pada proses oogenesis (Robinson dkk., 2009; Wahyuni, 2002). Oleh karena itu diperkirakan bahwa tanin bersifat sitotoksik terhadap sel ovum. Berdasarkan uraian di atas dan uji pendahuluan yang telah dilakukan diketahui dosis ekstrak yang dapat mengurangi jumlah kelahiran yaitu 250 mg/200 g dan 500 mg/200 g berat
297 badan tikus dan diharapkan dari
penelitian ini akan ditemukan nilai LD₅₀ dan diuji keamanan dari dosis tersebut.
METODE PENELITIAN
Bahan yang digunakan adalah daun Afrika (Vernonia amygdalina Del ), aquades, etanol 70%, dapar fosfat, asam klorida 1%, kloroform P, ammonia 25%, asam klorida pekat, pereaksi Dragendroff LP, pereaksi Mayer LP, serbuk magnesium P, asam klorida pekat, amil alkohol P, asam klorida 2 N, besi (III) klorida 1% P, pereaksi Stiassny (campuran formaldehida LP dan asam klorida pekat 2 : 1), natrium asetat P, natrium hidroksida 1 N, eter P, asam sulfat pekat, ammonia 10% P, petroleum eter P, asam klorida encer P, asam nitrat 10%, Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), aseton P, CMC Na 0,1%, larutan formalin 10%, mencit jantan (DDY) berumur ± 2 bulan dengan berat badan 15-30 gram, dan pakan mencit.
Alat-alat yang digunakan adalah Spektrofotometer serapan atom, maserator kinetik, lemari pendingin, penangas air, oven, tanur,
inkubator, vakum rotavapor, mikropipet, desikator, blender, seperangkat alat gelas, ayakan 4/18, cawan petri, cawan penguap, botol timbang, krus porselen, penjepit besi, labu alas bulat, penjepit kayu, spatula, batang pengaduk, kertas saring, kapas, kertas saring bebas abu, coloni counter, sonde, syringe, timbangan analitik, kandang mencit, timbangan mencit, mikroskop, Karl Fischer, ph meter.
Pembuatan Ekstrak Etanol 70% serbuk daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.) dilakukan sebanyak 1000 g serbuk daun Afrika diekstraksi secara maserasi kinetik menggunakan etanol 70% lalu disaring. Remaserasi dilakukan 13 kali dari maserat berwarna hijau kehitaman pekat sampai tidak berwarna. Filtrat yang terkumpul dipekatkan dengan rotavapor (Frank, 1995).
Penapisan fitokimia terhadap serbuk dan ekstrak kental daun Afrika dilakukan berdasarkan metode yang tercantum dalam Phytochemical Screening Farnsworth. Identifikasi dilakukan untuk golongan alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, kuinon,
298 steroid/triterpenoid, minyak atsiri,
dan kumarin.
Penetapan kadar flavonoid total menggunakan metode kolorimetri aluminium klorida. Ditimbang 1 gram ekstrak kental ke dalam labu takar 10 mL, ditambahkan 4 mL air suling, ditambahkan 0,3 mL NaNO2 5% lalu didiamkan selama 5 menit. Ditambahkan 0,3 mL AlCl3 10% lalu didiamkan selama 5 menit, ditambahkan 2 mL NaOH 1 M dan ditambahkan aquadest sampai volume 10 mL. Serapan diukur pada λ 510 nm. Kadar dihitung dengan menggunakan kurva baku Kuersetin (Sigma Aldrich).
Penetapan kadar alkaloid total menggunakan metode Kompleks Bromocresol Green. Ditimbang 1 mg ekstrak kental, dilarutkan dalam DMSO, ditambahkan 1 mL HCl 2 N, kemudian disaring. Larutan kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah dan ditambahkan 5 mL larutan BCG (69,8 mg BCG dalam 3 mL NaOH 2 N diencerkan dengan aquadest sampai 1 L) dan 5 mL larutan Buffer fosfat pH 4,7. Campuran tersebut diekstraksi dengan 1, 2, 3, dan 4 mL kloroform. Fase kloroform kemudian
diambil dan dicukupkan volumenya menjadi 10 mL. Serapan diukur pada λ 470 nm. Kadar alkaloid total dihitung dengan menggunakan kurva baku Atropin.
Uji toksisitas akut dilakukan dengan memberikan ekstrak daun Afrika dosis tunggal tertentu kemudian diamati gejala toksis dan kematian yang terjadi selama 24 jam untuk melihat pengaruh pemberian ekstrak daun Afrika. Tahap I digunakan 4 kelompok mencit yang terdiri atas 5 ekor mencit jantan pada masing-masing kelompok. Dosis satu kelompok dengan kelompok lainnya memiliki kelipatan dua, yaitu kelompok 1 menerima 16 g/kg BB mencit, kelompok 2 menerima 8 g/kg BB mencit, kelompok 3 menerima 4 g/kg BB mencit, dan kelompok 4 menerima 2 g/kg BB mencit.
Uji toksisitas akut (LD₅₀) ekstrak standar daun Afrika dilakukan dengan metode Weil C.S dengan menggunakan mencit jantan galur DDY sebagai hewan percobaan melalui jalur pemberian oral dan jumlah kematian dihitung setelah 24 jam. Perhitungan nilai LD₅₀ dilakukan dengan menggunakan tabel
299 biometrik dari Weil (Weil, 1952).
Selama penelitian dilakukan pengamatan selain jumlah kematian mencit yakni perubahan perilaku, perubahan fisik, penurunan nafsu makan dan minum, penurunan aktivitas motorik. Perubahan fisik yang diamati seperti kerusakan bulu (rontok) dan kulit (pucat, kemerahan, melepuh, udem). Perubahan perilaku yang diamati seperti gerakan menjilat, menggaruk, tremor, menggeliat.
HASIL DAN PEMBAHASAN Jumlah ekstrak kental daun Afrika diperoleh sebanyak 287,49 gram, DER 5,22 dan persentase rendemen yang dihasilkan sebesar 19,17%. Semakin tinggi nilai rendemen menandakan bahwa bahan baku berpeluang dimanfaatkan lebih besar. Rendemen ekstrak dihitung berdasarkan perbandingan berat akhir ekstrak yang dihasilkan dengan berat awal dikalikan dengan 100%. Rendemen yang dihasilkan cukup tinggi karena pelarut yang digunakan adalah etanol 70% yang dapat melarutkan senyawa fitokimia lebih maksimal karena mengandung 30% air yang membantu proses ekstraksi
sehingga sebagian senyawa ada yang tertarik ke dalam etanol dan ada pula yang tertarik dalam air. DER (Drug Extract Ratio) merupakan simplisia yang digunakan dengan ekstrak yang diperoleh (Sani dkk., 2012).
Hasil pengukuran serapan dan penetapan kadar flavonoid total dapat dilihat pada tabel 1. Kadar flavonoid total yang diperoleh dari proses ekstraksi menggunakan pelarut etanol 70% sebesar 1,27%. Hal ini menunjukkan bahwa selama proses ekstraksi, pelarut mampu menyari kandungan flavonoid yang terdapat dalam serbuk simplisia daun Afrika.
Penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak sebagai senyawa yang memiliki aktivitas biologis. Hasil penapisan fitokimia dari ekstrak daun Afrika (Vernonia amygdalina Del..) dapat dilihat pada tabel 2.
Berbeda dengan flavonoid, penetapan kadar alkaloid total memberikan hasil yang negatif. Absorbansi sampel tidak terukur. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh terikatnya alkaloid pada steroid sehingga menjadi tidak terdeteksi.
300 Untuk melihat pengaruh
pemberian ekstrak daun Afrika salah satunya dilakukan dengan melihat kematian yang terjadi pada setiap kelompok mencit yang kemudian dapat digunakan untuk perhitungan LD50. Setelah 24 jam pemberian ekstrak daun Afrika secara per oral
dengan dosis 40, 80, 160, 320 mg/20g tidak ada satupun mencit yang mati pada masing-masing kelompok. Sehingga penelitian ini tidak dilanjutkan ke tahap 2 karena pada dosis tertinggi tidak ada mencit yang mati yang dikategorikan sebagai praktis tidak toksik.
Tabel 1. Hasil pengukuran serapan dan penetapan kadar flavonoid total Sampel
Bobot sampel
(mg)
Serapan sampel Serapan BP Kadar flavonoid total (%) Dengan AlCl3 Tanpa AlCl3 Dengan AlCl3 Tanpa AlCl3 Ekstrak 1 30,7210 0,1281 0,0146 0,4700 0,0876 1,25 Ekstrak 2 30,7146 0,1284 0,0109 1,29 Ekstrak 3 30,7129 0,1276 0,0132 1,26 Rata-rata kadar flavonoid total (%) 1,27 Tabel 2. Hasil penapisan fitokimia serbuk simplisia dan ekstrak daun Afrika
No. Identifikasi Hasil ekstrak daun Afrika
1. Alkaloid + 2. Flavonoid + 3. Saponin + 4. Tanin + 5. Kuinon + 6. Steroid/triterpenoid +/+ 7. Minyak atsiri - 8. Kumarin -
Keterangan: (+) memberikan reaksi yang positif (-) memberikan reaksi yang negatif Pengamatan dilakukan pada
jam ke 1, 3, 6 dan 24 jam. Pada kelompok 1, 2 dan 3 kondisi mencit terlihat normal tidak terjadi perubahan perilaku maupun perubahan fisik. Pada kelompok 4 jam ke 3 terjadi penurunan aktivitas motorik pada beberapa mencit seperti
gerakan yang minimal dan melambat, tetapi tidak terjadi perubahan fisik seperti bulu rontok dan kulit rusak. Pada kelompok 4 jam ke 6 ada mencit yang mengalami penurunan nafsu makan dan minum serta penurunan aktivitas motorik seperti diam dan menyendiri. Pada kelompok 4 jam ke
301 24 seluruh mencit tetap bertahan,
tidak ada satu pun yang mati dan tidak terjadi perubahan fisik pada seluruh mencit hanya ada mencit yang mengalami penurunan aktivitas motorik seperti bingung dan gelisah. Pengamatan tersebut dapat dilihat pada tabel 3.
Hasil penelitian ini menggunakan metode Weil C.S.
selama 24 jam setelah pemberian ekstrak daun Afrika tidak ada satu pun mencit yang mati pada setiap kelompoknya. Daun Afrika pada penelitian ini memiliki LD50 lebih dari 16 g/kg BB, dimana hasil tersebut masuk dalam kategorikan praktis tidak toksik (Loomis, 1978
Tabel 3. Tabel pengamatan uji toksisitas akut
Kelompok Jam ke- Kerusakan Bulu Kerusakan Kulit Penurunan aktivitas motorik Penurunan nafsu makan dan minum Keterangan I 1 - - - - Keadaan aktivitas motorik normal 3 - - - - 6 - - - - 24 - - - - II 1 - - - - Keadaan aktivitas motorik normal 3 - - - - 6 - - - - 24 - - - - III 1 - - - - Keadaan aktivitas motorik normal 3 - - - - 6 - - - - 24 - - - - IV 1 - - - - - 3 - - √ - Gerakan melambat 6 - - √ √ Diam dan menyendiri 24 - - √ - Gelisah dan bingung
302 KESIMPULAN
Hasil uji penapisan fitokimia dari ekstrak etanol 70% daun Afrika memberikan hasil positif untuk senyawa golongan alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, kuinon, dan steroid/triterpenoid. Kadar flavonoid total yang diperoleh adalah 1,27%, sedangkan untuk alkaloid total tidak dapat diukur serapannya dengan menggunakan metode kompleks bromo cresol green. Uji toksisitas akut menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun Afrika memiliki LD50 lebih dari 16 g/kg BB, sehingga masuk dalam kategorikan praktis tidak toksik.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih peneliti ucapkan teruntuk Universitas Pancasila yang telah memberikan dana untuk penelitian ini, dan kepada Fakultas Farmasi Universitas Pancasila yang telah menyediakan sarana dan prasarana.
REFERENSI
Badan Pusat Statistik. Data Statistik Indonesia : Fertilitas. 2013. Diambil dari http://www.datastatistik-indonesia.com/portal/index.php ?option=com_content&task= view&id=300&Itemid=300&li mit=1&limitstart=2. Diakses pada tanggal 20 April 2014. Donna S., Siri L.K. (editor), 2006,
The Handbook of Contraception: A Guide for PracticalManagement, New Jersey: Humana Press Inc; 13-73.
Frank C. 1995. Toksikologi Dasar Asas, Organ Sasaran dan Penelitian Resiko. Edisi II. Diterjemahkan oleh Edi Nugroho. Jakarta: UI Press. h. 85-93
Harnowo, PA. 2012. 95% Orang Indonesia Tahu KB Tapi Enggan Ikut Programnya.
Diambil dari
http://health.detik.com/read/20 12/04/16/150253/1893499/763/ 95-orang-indonesia-tahu-kb-tapi-enggan-ikut-programnya. Diakses pada tanggal 20 April 2014.
Koeman, J.H. 1983. Pengantar Umum Toksokologi. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Loomis TA. Toksikologi dasar. Edisi
III (Drs. Imono Argo Donatus, Penerjamah). Semarang: IKIP Semarang Press; 1978.
MedlinePlus. 2012. Estrogen and Progestin (Oral Contraceptives). The American Society of Health-System Pharmacists. Diambil dari http://www.nlm.nih.gov/medlin eplus/ druginfo/ meds/a601050.html. diakses pada tanggal 20 April 2014.
303 Petitti, DB. 2003. Combination
Estrogen–Progestin Oral Contraceptives. New England J Med. 349(15):1443-1448. Diambil dari www.nejm.org. Diakses pada tanggal 20 April 2014.
Pramilla, S., Malcolm, P. 2008, Atlas Of Contraception Second Edition, United Kingdom : Informa Health Care; 39-48. Robinson B, Gesham L, Izevbigie E,
Cameron JA (2009). Vernonia amygdalina extracts inhibit the growth of estrogen receptor poositive/negative human breast carcinoma cells in vitro. FASEB J., 23:965.19.
Sani Ali A, Alemika Emmanuel T, Abdulraheem Rafat O, Abdulkareem SS, Abdulraheem Ramat B, Ilyas Mohammed. 2012. A study review of documented phytochemistry of Vernonia amygdalina (family Asteraceae) as the basis for pharmacologic activity of plant extract. Journal of Natural Sciences Research. 2(7): 6. Wahyuni, A. 2002. Pengaruh
Solasodin terhadap Diameter Tubulus Seminiferus dan Gambaran Sel-sel Spermatogenik Mencit (Mus musculus) Dewasa. Jurnal Kedokteran YARSI. 10 (2): 56-65.
Weil CS. 1952. Tables for convenient calculation of median effective dose (LD₅₀ or ED₅₀) and instructions in their use. Biometrics, p.249 – 263.
