Identifikasi Mutasi Gen rpoB526 pada Mycobacterium tuberculosis yang
Diisolasi dari Pasien Tuberkulosis Paru RSUP Dr. Mohammad Hoesin
Palembang
Ella Amalia
1, Lina Wahyuni Hrp
2*, Yuwono
1, Subandrate
41. Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya 2. Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya
3. Departemen Biokimia Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya Jl. dr. Moh. Ali Komplek RSMH Palembang Madang Sekip, Palembang, 30126, Indonesia
*Email: linaw23r@gmail.com
Abstrak
Tuberkulosis masih menjadi masalah kesehatan utama di Indonesia. Hal yang paling mengancam dari tuberkulosis ini adalah munculnya strain M. tuberculosis yang resisten dengan obat antituberkulosis, seperti rifampisin. Resistensi rifampisin terjadi karena adanya mutasi gen rpoB pada M. tuberculosis, terutama pada posisi kodon 526. Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi mutasi gen rpoB526 yang berkaitan dengan resistensi rifampisin pada isolat
M.tuberculosis. Penelitian ini menggunakan 40 isolat Mycobacterium tuberculosis. Mutasi gen rpoB526 dideteksi dengan teknik Multiplex Allele Specific PCR. Dari 40 sampel didapatkan genotip wild type dan mutant pada gen
rpoB526, masing masing sebanyak 18 (45 %), dan 12 (30 %) sampel. Sedangkan sisa sepuluh sampel lainnya belum dapat ditentukan.Pada penelitian ini ditemukan 30 % isolat Mycobacterium tuberculosis yang mengalami mutasi pada gen rpoB kodon 526.
Kata kunci: Mycobacterium tuberculosis, rpoB526, Resistensi, Rifampisin
Abstract
Identification of rpoB526 Gene Mutation in Mycobacterium tuberculosis Isolated from Pulmonary Tuberculosis Patients RSUP Dr. Mohammad Hoesin Palembang. Tuberculosis remains a major public health problem in Indonesia. The most threatening aspect of tuberculosis is the emergence of anti-tuberculosis drug resistant strains of M. tuberculosis, such as rifampicin. Rifampicin resistant is due to rpoB gene mutations in M. tuberculosis, especially at position codon 526. This study was undertaken to identify rpoB526 gene mutation associated with rifampicin resistance in M. tuberculosis isolates. This study used 40 isolates of Mycobacterium tubeculosis. The mutation of rpoB526 gene was detected by Multiplex Allele Specific PCR technique. Of all the 40 samples, 18 (45%) and 12 (30%) samples were found to be wild type and mutant genotype, respectively. While another ten amplification samples cannot be interpreted. There were 30% Mycobacterium tuberculosis isolates that have a mutation in rpoB gene codon 526.
Key words: Mycobacterium tuberculosis, rpoB526, Resistance, Rifampicin
1. Pendahuluan
Tuberkulosis masih menjadi masalah kesehatan nasional di Indonesia. Data WHO menempatkan Indonesia sebagai negara dengan insiden TB terbanyak keempat setelah India, China, dan Afrika Selatan 1. Setiap tahunnya didapatkan
250.000 kasus baru TB dan ada sekitar 100.000 kematian karena TB yang terjadi di Indonesia 2.
▸ Baca selengkapnya: pertanyaan tentang mutasi gen
(2)Salah satu kasus resistensi obat antituberkulosis yang sering dilaporkan adalah resistensi terhadap rifampisin, yang merupakan obat antituberkulosis lini pertama yang sangat poten. Data mengenai resistensi rifampisin menjadi semakin penting, mengingat 90 % isolat yang resisten rifampisin juga resisten terhadap isoniazid 5,6.
Oleh karena itu, seringkali resistensi rifampisin diasumsikan sebagai marker terhadap MDR-TB, yaitu kondisi resistensi terhadap isoniazid dan rifampisin. Berbagai penelitian telah melaporkan bahwa resistensi rifampisin terjadi akibat adanya mutasi gen rpoB pada
Mycobacterium tuberculosis7,8.
Mutasi pada gen rpoB menyebabkan resistensi pada rifampisin. Sebanyak 96,1 % mutasi ditemukan pada segmen 81-bp kodon 507-533 yang disebut RRDR atau
Rifampicin Resistance Determining Region 9,10. Lokasi
mutasi rpoB paling sering terjadi pada kodon 516, 526, dan 531 10,11,12. Beberapa penelitian melaporkan mutasi
rpoB pada kodon 526 sebagai lokasi mutasi terbanyak yang ditemukan 13,14,15.
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif observasional yang dilakukan dari bulan Oktober 2014 sampai Januari 2015. Sampel yang gunakan berjumlah 40 sampel. Dua belas sampel dikumpulkan dari sputum pasien yang melakukan pemeriksaan BTA di laboratorium mikobiologi RSMH dan sisanya, sebanyak dua puluh delapan sampel, diperoleh dari koleksi DNA
Mycobacterium tuberculosis yang disimpan di laboratorium mikrobiologi RSMH Palembang.
Dilakukan ekstraksi DNA pada spesimen sputum yang telah dikumpulkan. Ekstraksi DNA dilakukan dengan teknik ekstraksi DNA-Chelex 100 yang menggunakan PBS, safonin, dan Chelex.
DNA yang telah diisolasi dilakukan amplifikasi IS6110 untuk mengkonfirmasi keberadaan strain
Mycobacterium tuberculosis, sebagai salah satu kriteria inklusi sampel. Primer yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada tabel 1. Reaksi amplifikasi dilakukan pada volume 25 µl dari 9 µl ddH2O, 10 µl Gotaq Green
dan masing-masing 0,5 µl untuk primer reverse dan
forward serta 5 µl DNA template. Adapun kondisi untuk
amplifikasi IS6110 diatur dengan suhu denaturasi awal 95°C selama 5 menit, satu siklus 95°C selama 20 detik, 45°C selama 360 detik dan 72°C selama 120 detik, diikuti 30 siklus dari suhu 95°C selama 20 detik, 62°C selama 60 detik dan 72°C selama 180 detik 15.
Selanjutnya dilakukan proses elektroforesis dan visualisasi untuk melihat apakah isolat dari spesimen sputum tersebut positif terhadap IS6110 dalam artian positif menunjukkan keberadaan strain Mycobacterium tuberculosis.
Sampel yang menunjukkan hasil positif IS6110, dilakukan pemeriksaan gen rpoB526 dengan teknik
Multiplex PCR. Sedangkan yang negatif, diekslusi. Amplifikasi gen rpoB526 menggunakan tiga primer. Tabel 1. Primer yang Digunakan untuk Amplifikasi IS6110
dan rpoB526 15,16.
Primer Sekuen Pita
F IS6110 5’-CTCGTCCAGCGC-CGCTTCGG-3’ 130 bp R IS6110 3’-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-5’
F rpoB526 5’-GTCGCC GCGATCAAGGA-3’ 249 bp 181 bp ddH2O, 10 µl Gotaq Green dan masing-masing 0,5 µl
untuk primer reverse, inner dan forward serta 5 µl DNA template. Reaksi PCR untuk identifikasi mutasi pada rpoB526 berlangsung dalam tiga tahap berulang dibawah kondisi berikut: denaturasi awal pada suhu 960C selama 3 menit, lalu 5 kali siklus pada suhu
950C selama 45 detik, 600C selama 1 menit, dan 720C
selama 30 detik. Lalu 5 siklus pada suhu 950C selama
40 detik, 590C selama 50 detik dan 720C selama 30
detik. Lalu 25 siklus pada 940C selama 50 detik, 550C
selama 40 detik dan 700C selama 30 detik, dengan
tahap elongasi terakhir pada suhu 720C Selama 3
menit 16.
3. Hasil
Gambar 1. Visualisasi pada Amplikon IS6110
Keterangan: Nomor 1-12 = Nomor sampel. M = DNA Marker 50 bp. K+ = Kontrol positif. IS6110 positif membentuk pita 130 bp.
Gambar 2. Visualisasi amplikon gen rpoB 526.
Keterangan: M = DNA Marker 50 bp. 28-40 = Nomor sampel. K- = kontrol negatif. Genotip Wild-type (249 bp dan 181 bp) pada sampel 28, 31, 33, 36, dan 38. Genotip mutant (249 bp) pada sampel 29, 30, 35, 37, 39, dan 40. Sampel not determined tidak membentuk pita atau pita yang dibentuk tidak spesifik pada sampel 32 dan 34.
Amplifikasi gen rpoB kodon 526 dilakukan pada keseluruhan sampel yang berjumlah empat puluh sampel. Dari 40 sampel, 18 sampel tergolong wild type
(WT), 12 sampel mutant (M). Sisanya, terdapat 10 sampel yang tidak dapat dianalisis. Delapan diantaranya adalah sampel non amplifikasi yang tidak membentuk pita atau band, sedang dua sampel lainnya membentuk pita-pita non spesifik yang tidak dapat diinterpretasi. Kesepuluh sampel yang tidak dapat dianalisis ini digolongkan kedalam kategori not determined (ND).
Gambar 2 menunjukkan hasil visualisasi amplikon gen rpoB526 yang telah dilakukan.
4. Pembahasan
Gen rpoB merupakan gen pada Mycobacterium tuberculosis yang mengkode pembentukan subunit β dari RNA polimerase dependen DNA. Subunit-β dari kompleks enzim RNA polimerase (RNAP) ini adalah lokasi dimana rifampisin, yang merupakan obat poten antituberkulosis lini pertama, bekerja aktif melawan perkembangan dan fase statik dari Mycobacterium tuberculosis. Dengan demikian, jika terjadi mutasi pada gen rpoB, maka struktur RNAP yang dibentuk akan mengalami perubahan konformasi yang dapat mempengaruhi binding site dan/atau afinitas obat. Akibatnya rifampisin tidak dapat bekerja pada tempat kerja obat. Hal ini menjadi landasan tentang mekanisme molekuler terjadinya resistensi rifampisin. Berbagai penelitian telah membuktikannya melalui laporan adanya mutasi gen rpoB pada 92,3 % - 98 % isolat klinis Mycobacterium tuberculosis dengan fenotip resisten terhadap rifampisin 7,8,11. Penelitian yang
dilakukan Wang et al melaporkan terdapat 98 % isolat resisten rifampisin yang memiliki mutasi pada gen
rpoB, dan 86,86 % dari isolat tersebut mengalami mutasi pada kodon 516, 526 dan 531 11. Mengenai
ketiga kodon ini, hampir semua laporan penelitian sepakat bahwa kodon 516, 526, dan 531 merupakan tiga kodon dengan lokasi mutasi rpoB yang paling sering ditemukan.
Pada penelitian ini, observasi difokuskan terhadap mutasi gen rpoB pada kodon 526. Amplifikasi gen rpoB
kodon 526 dilakukan pada keseluruhan sampel yang berjumlah empat puluh sampel. Dari 40 sampel, 18 sampel tergolong wild type (WT), 12 sampel mutant
(M). Sisanya, terdapat 10 sampel yang tidak dapat dianalisis. Delapan diantaranya adalah sampel non amplifikasi yang tidak membentuk pita atau band, sedang dua sampel lainnya membentuk pita-pita non spesifik yang tidak dapat diinterpretasi. Kesepuluh sampel yang tidak dapat dianalisis ini digolongkan kedalam kategori not determined (ND).
Penelitian yang dilakukan oleh Mokrousov et al, melaporkan dari 114 sampel, hanya 110 yang menunjukkan hasil amplifikasi yang dapat dianalisis, karena sisanya merupakan sampel nonamplifikasi 17.
Adanya sampel non amplifikasi berkaitan dengan banyak faktor. Sampel yang nonamplifikasi kemungkinan disebabkan karena sedikit atau tidak adanya fragmen DNA target yang teramplifikasi pada gen rpoB akibat adanya inhibitor polimerase pada spesimen tersebut atau adanya perubahan susunan nukleotida pada DNA target akibat mutasi yang menyebabkan primer tidak dapat menempel dengan baik
17,18. PCR merupakaan reaksi enzimatik, sehingga reaksi
pada PCR sensitif terhadap keberadaan inhibitor. Pada penelitian ini beberapa substansi dari sampel yang berpotensi sebagai inhibitor antara lain seperti, atau debris-debris sel, garam atau substansi lain yang terdapat pada sampel 19. Selain itu, amplifikasi juga
tergantung pada primer yang digunakan. Desain primer dengan panjang lebih atau sekitar 20 nukelotida sangat penting. Hal ini dimaksud untuk menurunkan kemungkinan terjadinya perfect match pada sisi genom lain. Primer yang tidak kuat ini dapat menimbulkan produk amplifikasi palsu 20.Oleh karena itu, desain
primer yang baik merupakan proses yang sangat krusial. Isolat pada penelitian ini menunjukkan adanya mutasi gen rpoB526 pada 30 % sampel. Berbagai laporan Isolat Pada penelitian ini didapat adanya mutasi gen rpoB526
pada 30 % sampel. Berbagai laporan menyatakan bahwa mutasi gen rpoB pada kodon 526 dan 516 hampir selalu menunjukkan fenotip yang resisten terhadap rifampisin terhadap rifampisin 14. Berdasarkan asumsi ini, maka
ada sekitar 30 % isolat Mycobacterium tuberculosis
yang resisten terhadap rifampisin. Angka ini kemungkinan bisa lebih besar atau lebih kecil karena adanya 10 sampel lain yang belum dapat dianalisis. kepatuhan masyarakat untuk mengikuti protokol pengobatan. Hayati melaporkan dalam penelitiannya sebesar 43 % pasien tidak patuh terhadap protokol pengobatan tuberkulosis 22. Ketidakpatuhan dalam pengobatan
merupakan faktor risiko utama berkembangnya kasus resistensi. Selain itu, pertimbangan bahwa Indonesia merupakan negara endemis tuberkulosis, serta sampel yang digunakan merupakan sampel dari pasien yang berobat di layanan kesehatan tersier, rumah sakit pusat rujukan provinsi, maka temuan hasil resistensi yang lebih tinggi dapat dipahami.
Disisi lain, persentase mutasi gen rpoB526 sebesar 30 % pada penelitian ini, sejalan dengan penelitian lain yang telah dilaporkan sebelumnya. Salah satunya adalah publikasi dari Li et al yang melaporkan persentase mutasi rpoB kodon 526 cukup tinggi. Penelitian dilakukan terhadap 84 spesimen sputum dengan suspek TB yang positif menunjukkan keberadaan gen rpoB
pada pemeriksaan PCR, dan hasil penelitian menunjukkan 51,2 % (n=43) sampel yang mengalami mutasi pada gen rpoB kodon 526 14.
Adanya persentase yang beragam ini bisa terjadi karena pengaruh strain yang diisolasi berasal dari wilayah yang berbeda dan periode waktu pengumpulan yang berbeda 17.
Selain itu, kemungkinan keterbatasan sampel dan bias juga
harus dipertimbangkan. Lebih lanjut, penyebab perbedaan Swis: WHO Document Production Services, 2013: 1-97.
2. Kartasasmita, CB. Epidemiologi tuberkulosis. Sari Pediatri 2009; 11(2):124-128.
3. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. Strategi nasional pengendalian TB di Indonesia 2010-2014. Jakarta, 2011: 1-80.
4. Makadia JS, Jain A, Patra SK, Sherwai BL, Khanna A. Emerging trend of mutation profile of rpob gene in MDR tuberculosis, North India. Ind J Clin Biochem, 2012; 27(4): 370-374.
5. Kapur V, Li LL, Iordanescu S, Hamrick MR, Wanger A, Kreiswirth BN, et al. Characterization by automated DNA sequencing of mutations in the gene (rpoB) encoding the RNA polymerase beta subunit in rifampin-resistant Mycobacterum tuberculosis strains from New York City and Texas. J Clin Microbiol 1994; 32(4):1095-1098.
6. Fan X, Hu Z, Xu F, Yan Z, Guo S, Li Z. 2003. Rapid Detection of rpoB gene mutations in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Shanghai by using the amplification refractory mutation system. J Clin Microbiol, 41(3):993-997. 7. Telenti A, Imboden P, Lowrie D, Cole S, Colston
MJ, Matter L, Schopfer K, Bodmer T. 1993. Detection of rifampicin-resistance mutations in
Mycobacterium tuberculosis. Lancet, 341: 647-650. 8. Suzuki Y, Katsukawa C, Inoue K, Yin Y, Tasaka H,
Ueba N, Maniko M. 1996. Mutations in rpoB gene of rifampicin resistant clinical isolates of
Mycobacterium tuberculosis in Japan. J Jpn Assoc Infect Dis 1996; 69:413-419.
rpoB mutations associated with rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis using denaturing gradient gen electrophoresis. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:2200-2209.
10.Sun A, Fan X, Li L, Wang L, An W, Yan J. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant
M.tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed Environ Sci 2009; 22:253-258. 11.Wang S, Zhao B, Song Y, Zhou Y, Pang Y, Ou X, Li
Q, Xia H, Zhao Y. Molecular characterization of the
rpoB gene mutations of Mycobacterium tuberculosis
isolated from China. J Tuber Res 2013; 1(1):1-8 12.Zakham F, Chaoui I, Enchchaoui AH, Chetioui F, et
al. Direct sequencing for rapid detection of multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis
strains in Morocco. Infect Drug Resist 2013; 6:208-212.
13.Paluch-Oles’ J, Koziol-Montewka M, Magrys’ A. Mutations in the rpoB gene of rifampin-resistant
Mycobacterium tuberculosis isolates from Eastern Poland. New Microbiologica 2009; 32: 147-152. 14.Li J, Xin J, Zhang L, Jiang L, Cao H, Li L. Rapid
detection of rpoB mutations in rifampin resistant
M.tuberculosis from sputum samples by denaturing gradient gel electrophoresis. Int J Med Sci 2012; 9:148-155.
15.Noviana H, Nurachman Z, Ramdani M, Noe A. Multiplex PCR for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis
Isolated from Bandung, Indonesia. Microbiol Indones 2007; 1(3):114-118.
16.Khosravi AD, Goodarzi H, Alavi SY. Detection of genomic mutations in katG, inhA and rpoB genes of
Mycobacterium tuberculosis isolates using
polymerase chain reaction and multiplex allele-specific polymerase chain reaction. Brazil J Infect Dis 2012; 16(1):57-62.
17.Mokrousov I, Otten, T, Vyshnevskiy B, Narvskaya O. Allele-specific rpoB pcr assays for detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in sputum smears. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47(7): 2331-2235.
18.Maria LR, Bela B, Yasmon A. Deteksi mutasi gen katG Mycobacterium tuberculosis dengan metode PCR (polymerase chain reaction) – hidbbridisasi dot blot menggunakan pelacak oligonukleotida bertanda
32P. Jurnal Ilmiah Aplikasi Isotop dan Radiasi 2009;
5:54-67.
19.Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol 2012; 113:1014-1026.
20.Strachan T, Read AP. Human molecular genetics, Edisi ke-2. New York: Wiley-Liss (Online), 1999. (http://www.ncbi.nlm.nih.giv/books/NBK7571 diakses tanggal 18 Januari 2015).
21.Syaifudin M, Rosilawati M, Irawan H, Bela B. Identifikasi Mycobacterium tuberculosis dan analisis mutasi gen rpoB dan katG penyebab resistensi ganda dengan teknik molekuler. Laporan Penelitian Balitbang BATAN. Jakarta, 2007:1-15.
