ISOLASI mRNA EXON-2 GEN Pun1
PADA Capsicum frutescens L. KULTIVAR CAKRA HIJAU
Shelly Zairina, Dwi Listyorini, Eko Sri Sulasmi Universitas Negeri Malang
E-mail: [email protected]
ABSTRAK: Sekuen utuh DNA gen Pun1 dari Capsicum frutescens L. kultivar Cakra
Hijau hasil penelitian-penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa gen Pun1 terdiri dari dua exon yang dipisahkan oleh satu intron. Pada exon-2 terdapat kodon stop yang menentukan berakhirnya proses sintesis protein yang dikode oleh gen tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan dan mengetahui sekuen exon-2 mRNA gen Pun1 dari C.
frutescens kultivar Cakra Hijau, serta mengetahui similiratasnya dengan sekuen exon-2
gen Pun1 pembanding. Isolasi mRNA gen Pun1 dilakukan dengan mengikuti protokol isolasi RNA Tri Reagent dan kemudian diamplifikasi dengan teknik Reverse
Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) menggunakan primer forward
5'-GAA GGT GGC AGA AGA ATC AG-3' dan reverse 5'-TTA GGC AAT 5'-GAA CTC AAG GA-3'. Amplifikasi dengan teknik RT-PCR menghasilkan fragmen exon-2 sepanjang 591 bp dengan 10 basa lebih pada ujung 5' upstream dan 2 basa lebih pada ujung 3' downstream dari kodon stop. Sekuen cDNA exon-2 memiliki tingkat similaritas sebesar 97% terhadap DNA exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar Shuanla, tingkat similaritas sebesar 98% terhadap DNA exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar BG2814-6 dan tingkat similaritas sebesar 91% terhadap DNA exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar Cakra Hijau.
Kata kunci: Pun1 exon-2 mRNA, Capsicum frutescens L. Kultivar Cakra
Hijau, Pun1 exon-2 cDNA
ABSTRACT: Complete sequence of Pun1 gene from Capsicum frutescens L. cultivar
Cakra Hijau which had been isolated in previous studies swowed that Pun1 gene consists of two exons separated by an intron. Exon-2 is marked by stop codon that determines the end process protein synthesis encoded by that gene. This study aimed to know the sequence of exon-2 Pun1 gene and observe its similarity with exon-2 of the references cultivars. Isolation of mRNA Pun1 gene was done according to Tri Reagent RNA isolation protocol and amplified by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) techniques using forward primers 5'-GAA GGT GGC AGA AGA ATC AG-3' and reverse primers 5'-TTA GGC AAT GAA CTC AAG GA-3'. Exon-2 amplification produced a 591 bp fragment with 10 additional bases upstream of 5' end and 2 bases downstream of the stop codon. Exon-2 cDNA of C. frutescens cultivar Cakra Hijau displays 97%, 98%, and 91% similarity with exon-2 of Pun1 DNA of C. frutescens cultivar Shuanla, C. frutescens cultivar BG2814-6, and C. frutescens cultivar Cakra Hijau respectively.
Keywords: Pun1 exon-2 mRNA, Capsicum frutescens L. cultivar Cakra Hijau, Pun1
exon-2 cDNA
Capsicum frutescens kultivar Cakra Hijau merupakan kultivar lokal yang mampu beradaptasi dengan baik di dataran rendah maupun tinggi, tahan terhadap hama dan penyakit, serta memiliki rasa buah yang pedas (Rukmana, 2002). Tingkat kepedasan pada Capsicum frutescens kultivar Cakra Hijau diakibatkan adanya senyawa kapsaisin yang dalam proses biosintesisnya dikode oleh gen Pun1. Kapsaisin merupakan hasil metabolit sekunder dari tanaman yang bersifat
alkaloid dan memiliki karakter pedas. Kapsaisin ini dihasilkan oleh jalur metabolisme yang diaktivasi oleh enzim Capsaicin Synthase (CS). Kapsaisin disintesis dan terakumulasi dalam sel epidermal plasenta (Stewart et al., 2005; Stewart et al., 2007; Pandhair et al., 2005; Reyes-Escogido et al., 2011).
Sekuen DNA gen Pun1 yang telah berhasil diisolasi adalah sepanjang 1084 bp dari bagian upstream hingga bagian tengah ketiga (Habibi et al., 2012; Manggabarani, 2013; Sari, 2014). RNA atau asam ribonukleat adalah asam nukleat berantai tunggal yang tersusun atas monomer-monomer nukleotida dengan gula ribosa genetik (Campbell et al., 2010). Salah satu bentuk RNA adalah messenger RNA (mRNA) yang merupakan hasil transkripsi DNA yang membawa kode-kode genetik untuk rangkaian asam-asam amino yang menyusun suatu protein (Yuwono, 2012).
Messenger RNA (mRNA) yang telah matang tidak memiliki urutan intron yang biasanya terdapat pada DNA. Intron adalah urutan non-koding yang dapat mengganggu proses penerjemahan kedalam bentuk protein, karena intron merupakan pasangan basa yang tidak mengkode apapun (Old & Primrose, 2003). mRNA dalam prosesnya akan mengalami proses penyambungan (Splicing) yaitu proses pemotongan daerah intron dan penyambungan semua ekson menjadi satu urutan gen utuh (Fatchiyah, 2011). mRNA dapat diubah menjadi copy DNA (cDNA) dengan bantuan enzim reverse transcriptase. mRNA akan digunakan sebagai template dalam sintesis cDNA tersebut (Yuwono, 2012).
Pada fragmen DNA gen Pun1 Capsicum frutescens kultivar Shuanla yang sering digunakan acuan penelitian gen Pun1 Capsicum frutescens kultivar Cakra Hijau diketahui terdapat dua exon yang dipisahkan oleh intron pada bagian tengah dari fragmen totalnya (Deng et al., 2010). Exon merupakan daerah koding yang memiliki arti dan dapat ditranslasi menjadi protein (Agoes, 2005). Pada fragmen mRNA bagian exon-2 terdapat kodon stop sebagai kodon penentu berakhirnya proses sintesis protein dan menentukan bagian ujung akhir dari gen Pun1 pada Capsicum frutescens kultivar Cakra Hijau. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan dan mengetahui sekuen exon-2 mRNA gen Pun1 dari C. frutescens kultivar Cakra Hijau, serta mengetahui similiratasnya dengan sekuen exon-2 gen Pun1 pembanding.
METODE
Sampel berupa plasenta dan jaringan septum interlokularis dari buah Capsicum frutescens kultivar Cakra Hijau yang bibitnya diperoleh dari Balai Pengkajian Teknologi Pertanian (BPTP) Karangploso, Malang. Isolasi mRNA dilakukan dengan mengikuti protokol isolasi RNA Tri Reagent. mRNA yang telah diperoleh dari hasil isolasi diamplifikasi dengan teknik Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). menggunakan primer forward 5'-GAA GGT GGC AGA AGA ATC AG-3' dan reverse 5'-TTA GGC AAT GAA CTC AAG GA-3'. RT-PCR dilakukan dalam 40 siklus dengan reverse transcription 50oC selama 30 menit, initial PCR activation step 95oC selama 15 menit, denaturasi 94oC selama 1 menit, annealing 54oC selama 1 menit, ekstensi 72oC selama 1 menit, dan ekstensi akhir 72oC selama 10 menit. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan gel agarose 1,5%. Sampel cDNA hasil amplifikasi disekuensing dengan mesin sekuenser Big Dye Transluminator pada ABI 3130 genetic analyzer di Laboratorium 1st Base, Malaysia. Hasil sekuensing dianalisis dengan DNA Baser, BLAST, SIXFRAME, dan ClustalX.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengecekan hasil RT-PCR dengan menggunakan elektroforesis menghasilkan pita dalam keadaan multibanded dengan terbentuk 2 pita, yaitu pada posisi 200 bp dan pada posisi diantara 500 bp sampai 600 bp (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil elektroforesis. 1 Kb: Marker DNA 1 Kb; 2: produk hasil RT-PCR (exon-2) 1000 bp
250 bp
Berdasarkan sekuen DNA gen Pun1 dari Capsicum frutescens kultivar Shuanla dan Capsicum frutescens kultivar BG2814-6 diketahui bahwa sekuen exon-2 dari gen Pun1 adalah sepanjang 585 bp, sehingga dari dua pita yang terbentuk, pita pada posisi diantara 500 bp sampai 600 bp merupakan pita dari cDNA exon-2 gen Pun1 dari Capsicum frutescens kultivar Cakra Hijau. Terbentuknya multibanded terjadi karena sintesis cDNA prematur akibat sampel RNA yang digunakan untuk proses RT-PCR terlalu lama pada suhu ruang. Sampel RNA harus selalu berada pada suhu yang sangat dingin untuk menghindari denaturasi RNA (Qiagen, 2010).
Hasil sekuensing cDNA exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar Cakra Hijau dianalisis dengan menggunakan beberapa program analisis. Analisis cDNA exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar Cakra Hijau dengan menggunakan DNA Baser menghasilkan sekuen konsensus sepanjang 591 bp (Gambar 2).
10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TTTTGAAAGGGGGGCCAGAGAATCAGGAGTAAAAAATCCAACAAGAACTGAAGTTGTTAGCGCTCTTCTTTTCAATGTGC
90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AACAAAGGCATCATCATCAATGCTACCATCAAAGTTGGTTCACTTCTTAAACATACGTACTATGATCAAACCTCGTCTAC
170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CACGAAATGCCATTGGAAATCTCTCGTCTATTTTCTCCATAGAAGCAACTAACATGCAGGACATGGAGTTGCCAACGTTG 250 260 270 280 290 300 310 320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTTCGTAATTTAAGGAAGGAAGTTGAGGTGGCATACAAGAAAGACCAAGTCGAACAAAATGAACTGATCCTAGAAGTAGT 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGAATCAATGAGAGAAGGGAAACTGCCATTTGAAAATATGGATGGCTATAAGAATGTGTATACTTGCAGCAATCTTTGCA 410 420 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AATATCCATACTACACTGTAGATTTTGGATGGGGAAGACCTGAAAGGGTGTGTCTAGGAAATGGTCCCTCCAAGAATGCC 490 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TTCTTCTTGAAAGATTACAAAGCTGGGCAAGGCGTGGAGGCGCGGGTGATGTGCACAAGCAACAAATGTCTAATGACGCA 570 580 590
....|....|....|....|....|....|.
ATGAGGAACTCCTTGAGTTATTTGCCTAAAA
Gambar 2 Sekuen konsensus cDNA exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar Cakra Hijau
Tingkat similaritas dan query coverage sekuen cDNA exon-2 gen Pun1 pada C. frutescens kultivar Cakra Hijau dibandingkan dengan exon-2 gen Pun1 dari kultivar pembanding dengan menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) menunjukkan bahwa cDNA exon-2 memiliki tingkat
similaritas sebesar 97% dan query coverage sebesar 99% terhadap exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar Shuanla (Gambar 3 A), tingkat similaritas sebesar 98% dan query coverage sebesar 99% terhadap exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar BG2814-6 (Gambar 3 B) dan tingkat similaritas sebesar 91% dan query coverage sebesar 99% terhadap exon-2 DNA gen Pun1 C. frutescens kultivar Cakra Hijau (Gambar 3 C).
Gambar 3 Hasil analisis BLAST antara cDNA exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar Cakra Hijau dengan DNA exon-2 gen Pun1 dari kultivar pembanding: A. C. frutescens kultivar Shuanla; B. C. frutescens kultivar BG2814-6; C. C. frutescens kultivar Cakra Hijau
Hasil analisis dengan SIXFRAME menunjukkan 6 kerangka pembacaan (frame) dan diketahui bahwa frame 1 (Gambar 4) merupakan ORF yang ditandai dengan pembacaan satu kodon stop yang berada di ujung akhir dari cDNA exon-2 gen target. G A R E S G V K N P T R T E V V S A L L 1 ggggccagagaatcaggagtaaaaaatccaacaagaactgaagttgttagcgctcttctt 60 F N X A T K A S S S M L P S K L V H F L 61 ttcaatngtgcaacaaaggcatcatcatcaatgctaccatcaaagttggttcacttctta 120 N I R T M I K P R L P R N A I G N L S S 121 aacatacgtactatgatcaaacctcgtctaccacgaaatgccattggaaatctctcgtct 180 I F S I E A T N M Q D M E L P T L V R N 181 attttctccatagaagcaactaacatgcaggacatggagttgccaacgttggttcgtaat 240 L R K E V E V A Y K K D Q V E Q N E L I 241 ttaaggaaggaagttgaggtggcatacaagaaagaccaagtcgaacaaaatgaactgatc 300 L E V V E S M R E G K L P F E N M D G Y 301 ctagaagtagtagaatcaatgagagaagggaaactgccatttgaaaatatggatggctat 360 A B C
K N V Y T C S N L C K Y P Y Y T V D F G 361 aagaatgtgtatacttgcagcaatctttgcaaatatccatactacactgtagattttgga 420 W G R P E R V C L G N G P S K N A F F L 421 tggggaagacctgaaagggtgtgtctaggaaatggtccctccaagaatgccttcttcttg 480 K D Y K A G Q G V E A R V M X H K Q Q M 481 aaagattacaaagctgggcaaggcgtggaggcgcgggtgatgntgcacaagcaacaaatg 540 S N X X R N E E L L E L F A * 541 tctaatgnnnnacgcaatgaggaactccttgagttatttgcctaa 585
Gambar 4 Kerangka pembacaan hasil analisis SIXFRAME cDNA exon-2 gen Pun1 C.
frutescens kultivar Cakra Hijau. M: kodon start atau asam amino metionin; *: kodon stop
Pada sekuen cDNA exon-2 gen Pun1 Capsicum frutescens kultivar Cakra Hijau (Gambar 5) terdapat 10 basa lebih pada ujung awal cDNA exon-2 dan 2 basa lebih pada ujung 3' downstream dari kodon stop (Gambar 5; garis hitam). Kodon stop mulai pada basa ke 587.
10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TTTTGAAAGGGGGGCCAGAGAATCAGGAGTAAAAAATCCAACAAGAACTGAAGTTGTTAGCGCTCTTCTTTTCAATGTGC
90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AACAAAGGCATCATCATCAATGCTACCATCAAAGTTGGTTCACTTCTTAAACATACGTACTATGATCAAACCTCGTCTAC
170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CACGAAATGCCATTGGAAATCTCTCGTCTATTTTCTCCATAGAAGCAACTAACATGCAGGACATGGAGTTGCCAACGTTG 250 260 270 280 290 300 310 320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTTCGTAATTTAAGGAAGGAAGTTGAGGTGGCATACAAGAAAGACCAAGTCGAACAAAATGAACTGATCCTAGAAGTAGT 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGAATCAATGAGAGAAGGGAAACTGCCATTTGAAAATATGGATGGCTATAAGAATGTGTATACTTGCAGCAATCTTTGCA 410 420 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AATATCCATACTACACTGTAGATTTTGGATGGGGAAGACCTGAAAGGGTGTGTCTAGGAAATGGTCCCTCCAAGAATGCC 490 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TTCTTCTTGAAAGATTACAAAGCTGGGCAAGGCGTGGAGGCGCGGGTGATGTGCACAAGCAACAAATGTCTAATGACGCA 570 580 590
....|....|....|....|....|....|.
ATGAGGAACTCCTTGAGTTATTTGCCTAAAA
Gambar 5 Sekuen cDNA exon-2 utuh (warna kuning) dengan rincian beberapa basa lebih. Garis hitam ( ): basa lebih pada cDNA exon-2; (*): kodon stop
Pensejajaran sekuen cDNA exon-2 gen Pun1 dengan DNA exon-2 gen Pun1 pembanding dilakukan dengan menggunakan program analisis ClustalX. Kelebihan basa pada cDNA exon-2 dipotong untuk memperoleh sekuen utuh cDNA exon-2 hingga kodon stop. Hasil pensejajaran dengan gen Pun1 pembanding menunjukkan adanya persamaan dan perbedaan sekuen gen Pun1 (Gambar 6).
10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C. frutescens cv. BG2814-6 GTGGCAGAAGAATCAGGAGTAAAAAATCCAACAAGGGCAGAAGTTGTTAGCGCTCTTCTT C. frutescens cv. Shuanla GTGGCAGAAGAATCAGGAGTAAAAAATCCAACAAGGGCAGAAGTTGTTAGCGCTCTTCTT C. frutescens cv. C.Hijau DNA TTGGCAGAAGAATCAGGAGTAGAAAACCCAACAAGGGCAG-AGTTGTTAGCGCTCTTCTT C. frutescens cv. C.Hijau RNA GGGGCCAGAGAATCAGGAGTAAAAAATCCAACAAGAACTGAAGTTGTTAGCGCTCTTCTT Clustal Consensus ***...*************.**** ********..*:* ******************* 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C. frutescens cv. BG2814-6 TTCAAATGTGCAACAAAGGCATCATCATCAATGCTACCATCAAAGTTGGTTCACTTCTTA C. frutescens cv. Shuanla TTCAAATGTGCAACAAAGGCATCATCATCAATGCTACCATCAAAGTTGGTTCACTTCTTA C. frutescens cv. C.Hijau DNA TTCAA-TGTGCAACAAAGGCATCATCATCAATGCTACCATCAAAGTTGGTTCACTTCTTA C. frutescens cv. C.Hijau RNA TTCAA-TGTGCAACAAAGGCATCATCATCAATGCTACCATCAAAGTTGGTTCACTTCTTA Clustal Consensus ***** ****************************************************** 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C. frutescens cv. BG2814-6 AACATACGTACTATGATCAAACCTCGTCTACCACGAAATGCCATTGGAAATCTCTCGTCT C. frutescens cv. Shuanla AACATACGTACTATGATCAAACCTCGTCTACCACGAAATGCCATTGGAAATCTCTCGTCT C. frutescens cv. C.Hijau DNA AACATACGTACAATGATCAAACCTCGTCTACCCCGAAATACCATTGGAAATATCTTGTCC C. frutescens cv. C.Hijau RNA AACATACGTACTATGATCAAACCTCGTCTACCACGAAATGCCATTGGAAATCTCTCGTCT Clustal Consensus ***********:********************.******.***********.*** *** 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C. frutescens cv. BG2814-6 ATTTTCTCCATAGAAGCAACTAACATGCAGGACATGGAGTTGCCAACGTTGGTTCGTAAT C. frutescens cv. Shuanla ATTTTCTCCATAGAAGCAACTAACATGCAGGACATGGAGTTGCCAACGTTGGTTCGTAAT C. frutescens cv. C.Hijau DNA ATGTTCTCCACAGCAGCAACTAACGAGCAGGACATTGAGTTGCCAAGTTTGGTTCGTAAT C. frutescens cv. C.Hijau RNA ATTTTCTCCATAGAAGCAACTAACATGCAGGACATGGAGTTGCCAACGTTGGTTCGTAAT Clustal Consensus ** ******* **.**********.:********* ********** ************ 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C. frutescens cv. BG2814-6 TTAAGGAAGGAAGTTGAGGTGGCATACAAGAAAGACCAAGTCGAACAAAATGAACTGATC C. frutescens cv. Shuanla TTAAGGAAGGAAGTTGAGGTGGCATACAAGAAAGACCAAGTCGAACAAAATGAACTGATC C. frutescens cv. C.Hijau DNA TTGAGGAAGGAAGTTGAGGTGGCGTACAAGAAAGACCAAGTCGAACAAAATGAACTGATC C. frutescens cv. C.Hijau RNA TTAAGGAAGGAAGTTGAGGTGGCATACAAGAAAGACCAAGTCGAACAAAATGAACTGATC Clustal Consensus **.********************.************************************ 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C. frutescens cv. BG2814-6 CTAGAAGTAGTAGAATCAATGAGAGAAGGGAAACTGCCATTTGAAAATATGGATGGCTAT C. frutescens cv. Shuanla CTAGAAGTAGTAGAATCAATGAGAGAAGGGAAACTGCCATTTGAAAATATGGATGGCTAT C. frutescens cv. C.Hijau DNA CTAGAAGTAGTAGAATCCATAAGAAAAGGTAAAATGCCTTTTGAAAATAAGGATGGATAT C. frutescens cv. C.Hijau RNA CTAGAAGTAGTAGAATCAATGAGAGAAGGGAAACTGCCATTTGAAAATATGGATGGCTAT Clustal Consensus *****************.**.***.**** ***.****:**********:******.*** 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C. frutescens cv. BG2814-6 GAGAATGTGTATACTTGCAGCAATCTTTGCAAATATCCATACTACACTGTAGATTTTGGA C. frutescens cv. Shuanla GAGAATGTGTATACTTGCAGCAATCTTTGCAAATATCCGTACTACACTGTAGATTTTGGA C. frutescens cv. C.Hijau DNA CAGAATGTTTATATTTGCAGTAATCTTTGCAAATACCCATACGACACTGTAGATTTTGGA C. frutescens cv. C.Hijau RNA AAGAATGTGTATACTTGCAGCAATCTTTGCAAATATCCATACTACACTGTAGATTTTGGA Clustal Consensus ******* **** ****** ************** **.*** ***************** 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C. frutescens cv. BG2814-6 TGGGGAAGACCTGAAAGGGTGTGTCTAGGAAATGGTCCCTCCAAGAATGCCTTCTTCTTG C. frutescens cv. Shuanla TGGGGAAGACCTGAAAGAGTGTGTCTAGGAAATGGTCCCTCCAAGAATGCCTTCTTCTTG C. frutescens cv. C.Hijau DNA TGGGGAAGACCTGAAAGTGTGTGTATAGCAAATGGTCCCTTCAAGAATGCCTTCTTCTTG C. frutescens cv. C.Hijau RNA TGGGGAAGACCTGAAAGGGTGTGTCTAGGAAATGGTCCCTCCAAGAATGCCTTCTTCTTG Clustal Consensus ***************** ******.*** *********** ******************* 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C. frutescens cv. BG2814-6 AAAGATTACAAAGCTGGGCAAGGCGTGGAGGCGCGGGTGATGTTGCACAAGCAACAAATG C. frutescens cv. Shuanla AAAGATTACAAAGCTGGGCAAGGCGTGGAGGCGCGGGTGATGTTGCACAAGCAACAAATG C. frutescens cv. C.Hijau DNA AAAGATTACAAAGCTGGGCGAGGTGTGGAGGCGCGGGTGATGTTGCACAAGCAACAAATG C. frutescens cv. C.Hijau RNA AAAGATTACAAAGCTGGGCAAGGCGTGGAGGCGCGGGTGATG-TGCACAAGCAACAAATG Clustal Consensus *******************.*** ****************** ***************** 550 560 570 580
....|....|....|....|....|....|....|....|....| C. frutescens cv. BG2814-6 TCTGAATTTGAACGCAATGAGGAACTCCTTGAGTTCATTGCCTAA C. frutescens cv. Shuanla TCTGAATTTGAACGCAATGAGGAACTCCTTGAGTTCATTGCCTAA C. frutescens cv. C.Hijau DNA TCTGAATTTGAACGCAATGAGGAACTCTTTGAATTTATTGCCTAA C. frutescens cv. C.Hijau RNA TCTAATG----ACGCAATGAGGAACTCCTTGAGTTATTTGCCTAA Clustal Consensus ***.*: **************** ****.** :********
Gambar 6 Alignment antara sekuen cDNA exon-2 dengan sekuen DNA exon-2 dari ketiga pembanding. (*): basa nukleotida yang sama (conserve); (.)/(:): basa nukleotida yang berbeda; (-): basa nukleotida yang hilang
Pensejajaran susunan asam amino sekuen cDNA exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar Cakra Hijau dengan sekuen DNA gen Pun1 dari spesies pembanding dengan ClustalX menghasilkan sekuen sepanjang 195 asam amino
yang diakhiri oleh kodon stop (TAA) (Gambar 7). Pada hasil pensejajaran asam amino ini diketahui terdapat beberapa perbedaan asam amino.
10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C. frutescens cv. BG2814-6 VAEESGVKNPTRAEVVSALLFKCATKASSSMLPSKLVHFLNIRTMIKPRL C. frutescens cv. Shuanla VAEESGVKNPTRAEVVSALLFKCATKASSSMLPSKLVHFLNIRTMIKPRL C. frutescens cv. C.Hijau DNA LAEESGVENPTRAXVVSALLFXCATKASSSMLPSKLVHFLNIRTMIKPRL C. frutescens cv. C.Hijau RNA GARESGVKNPTRTEVVSALLFXCATKASSSMLPSKLVHFLNIRTMIKPRL Clustal Consensus :*.****.****.********X****************************
60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C. frutescens cv. BG2814-6 PRNAIGNLSSIFSIEATNMQDMELPTLVRNLRKEVEVAYKKDQVEQNELI C. frutescens cv. Shuanla PRNAIGNLSSIFSIEATNMQDMELPTLVRNLRKEVEVAYKKDQVEQNELI C. frutescens cv. C.Hijau DNA PRNTIGNILSMFSTAATNEQDIELPSLVRNLRKEVEVAYKKDQVEQNELI C. frutescens cv. C.Hijau RNA PRNAIGNLSSIFSIEATNMQDMELPTLVRNLRKEVEVAYKKDQVEQNELI Clustal Consensus ***.***..*.**..***.**.***.************************ 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C. frutescens cv. BG2814-6 LEVVESMREGKLPFENMDGYENVYTCSNLCKYPYYTVDFGWGRPERVCLG C. frutescens cv. Shuanla LEVVESMREGKLPFENMDGYENVYTCSNLCKYPYYTVDFGWGRPERVCLG C. frutescens cv. C.Hijau DNA LEVVESIRKGKMPFENKDGYQNVYICSNLCKYPYDTVDFGWGRPESVCIA C. frutescens cv. C.Hijau RNA LEVVESMREGKLPFENMDGYKNVYTCSNLCKYPYYTVDFGWGRPERVCLG Clustal Consensus ******.*.**.****.***:***.*********.**********.**.. 160 170 180 190 ....|....|....|....|....|....|....|....|....| C. frutescens cv. BG2814-6 NGPSKNAFFLKDYKAGQGVEARVMLHKQQMSEFERNEELLEFIA* C. frutescens cv. Shuanla NGPSKNAFFLKDYKAGQGVEARVMLHKQQMSEFERNEELLEFIA* C. frutescens cv. C.Hijau DNA NGPFKNAFFLKDYKAGRGVEARVMLHKQQMSEFERNEELFEFIA* C. frutescens cv. C.Hijau RNA NGPSKNAFFLKDYKAGQGVEARVMXHKQQMSNXXRNEELLELFA* Clustal Consensus ***.************.**************.*******.*..* Gambar 7 Pensejajaran sekuen asam amino antara cDNA exon-2 dengan DNA exon-2
dari ketiga pembanding. *: asam amino yang sama (conserve); (.)/(:): asam amino yang berbeda; ( X ): asam amino yang tidak terbaca; (*): kodon stop
Pada hasil pensejajaran asam amino selain diketahui perbedaan beberapa asam amino yang terbentuk juga diketahui beberapa asam amino yang tidak terbaca. Perbedaan pada asam amino yang terbentuk dan adanya beberapa asam amino yang tidak terbaca dapat terjadi karena adanya perbedaan basa nukleotida (Luscombe et al., 2001) serta adanya delesi pada sekuen cDNA hasil penelitian. Delesi pada cDNA exon-2 berada pada basa ke 66, 523, 548, 549, 550, dan 551 (Gambar 6).
Perbedaan basa yang terjadi antara sekuen cDNA exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar Cakra Hijau dengan sekuen DNA exon-2 gen Pun1 pada C. frutescens kultivar Shuanla dan C. frutescens kultivar BG2814-6 dapat terjadi
karena ketiganya berasal dari kultivar yang berbeda. Tanaman yang berasal dari kultivar yang berbeda akan memiliki perbedaan pula pada materi genetiknya (Ma et al., 2015). Selain itu, C. frutescens kultivar Cakra Hijau merupakan kultivar hasil persilangan dari dua spesies yang berbeda, sehingga mungkin terjadi
perbedaan basa pada DNA tanaman. Perbedaan sekuen cDNA exon-2 gen Pun1 hasil penelitian dengan sekuen DNA exon-2 gen Pun1 pada C. frutescens kultivar Cakra Hijau dapat terjadi karena mutasi berupa delesi, transversi, transisi, dan insersi yang mungkin terjadi pada sekuen cDNA. Perbedaan basa juga dapat disebabkan oleh pengaruh adaptasi lingkungan dan distribusi geografi yang berbeda (Ma et al., 2015;Foerstner et al., 2005).
Perbedaan basa nukleotida antara sekuen DNA exon-2 dan sekuen cDNA exon-2 mungkin karena beberapa faktor, yaitu benih yang didapatkan dari BPTP belum tentu merupakan biji dari buah dalam satu individu yang sama, sehingga terjadi perbedaan basa pada DNA tanaman. Faktor lain adalah kedua sampel ditanam pada waktu, tempat, dan keadaan lingkungan yang berbeda. Keadaan lingkungan dapat mempengaruhi kandungan basa Guanine dan Cytosine (GC) serta komposisi asam amino dari suatu protein (Foerstner et al., 2005). Peluang besar terjadinya perkawinan dan persilangan bebas di alam dari beberapa tanaman juga berpengaruh.
PENUTUP Kesimpulan
Isolasi mRNA exon-2 gen Pun1 pada C. frutescens kultivar Cakra Hijau menghasilkan sekuen cDNA sepanjang 591 bp dengan 10 basa lebih pada ujung 5' upstream dan 2 basa lebih pada ujung 3' downstream dari kodon stop. Sekuen cDNA exon-2 memiliki tingkat similaritas sebesar 97% terhadap exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar Shuanla, tingkat similaritas sebesar 98% terhadap exon-2 gen Pun1 C. frutescens kultivar BG2814-6 dan tingkat similaritas sebesar 91% terhadap exon-2 DNA gen Pun1 C. frutescens kultivar Cakra Hijau.
Saran
Penelitian mengenai DNA dan RNA harus dilakukan dengan menggunakan sampel dari satu tanaman atau individu yang sama. Selain itu, dibutuhkan penelitian lebih lanjut mengenai kemungkinan perkawinan dan persilangan bebas di alam, terutama pada C. frutescens kultivar Cakra Hijau, serta penelitian dalam tingkat ekspresi gen dan sintesis kapsaisin.
DAFTAR RUJUKAN
Agoes, Suhartati, & Suryadi. 2005. Simulasi Identifikasi Daerah Coding Pada Deoxyribonucleic Acid Dengan Menggunakan Discrete Fourier Transform. JETri. 4 (2): 45-60.
Campbell, N.A., J. B Reece. & L. G. Mitchell. 2010. Biologi Edisi kedelapan. Jakarta: Erlangga.
Deng, M. H., Wen, J. F., Zou, X. X. & Zhu, H. S. 2010. Clone and Sequence Analysis of Acyltransferase (Pun1) Gene in Pepper. NCBI: Unpublished. Fatchiyah, Arumingtyas, E. L., Widyarti, S. & Rahayu, S. 2011. Prinsip Dasar
Analisis Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.
Foerstner, K. U., Mering, C. V., Hooper, S. D. & Bork, P. 2005. Environment Shape The Nucleotide Composition of Genomes. European Molecular Biology Organization. 6 (12): 1208-1213.
Habibi, M., Manggabarani, A. M., Sulasmi, E. S. & Aljabari, S. 2012. AT3 (Acyltransferase) Gene Isolation from Capsicum frutescens cv. Cakra Hijau. Journal of Tropical Life Science. 3 (2): 83-86.
Luscombe, N.M., Laskowski, R. A. & Thornton, J. M. 2001. Amino Acid –Base Interactions: A Three-Dimensional Analysis of Protein-DNA Interactions at An Atomic Level. Nucleic Acids Research, 29 (13): 2860-2874.
Ma, Y., Dai, X., Xu, Y., Luo,W., Zheng, X., Zeng, D., Pan, Y., Lin, X., Liu, H., Zhang, D., Xiao, J., Guo, X., Xu, S., Niu, Y., Jin, J., Zhang, H., Xu, X., Li, L., Wang, W., Qian, Q., Ge, S. & Chong, K. 2015. COLD1 Confers Chilling Tolerance in Rice. Cell. 160: 1209-1221.
Manggabarani, A. M. 2013. Isolasi Fragmen Bagian Depan dan Tengah Kedua Gen Acyltransferase (AT3) dari C. frutescens cv. Cakra Hijau. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: FMIPA UM.
Old, R.W. & Primrose, S.B. 2003. Prinsip-prinsip Manipulasi Gen. Terjemahan Herawati Susilo & A.D. Corebima. 2003. Jakarta: Universitas Indonesia Press.
Qiagen. 2010. Qiagen® OneStep RT-PCR Kit Handbook. Texas: Qiagen.
Reyes-Escogido, M. L. R., Mondragon, E. G. G. & Tzompantzi, E. V. 2011. Chemical and Pharmacological Aspects of Capsacin. Molecules.16: 1253-1270.
Rukmana, R. 2002. Usaha Tani Cabai Rawit. Yogyakarta: Kanisius.
Sari, S. K. 2014. Isolasi Fragmen Tengah Ketiga Gen Pun1 Dari Capsicum frutescens L. Kultivar Cakra Hijau. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: FMIPA UM.
Stewart, C. Jr., Kang, B. C., Liu, K., Mazourek, M., Moore, S. L., Yoo, E. Y., Kim, B. D., Paran, I. & Jahn, M. M. 2005. The Pun1 Gene for Pungency in Pepper Encodes a Putative Acyltransferase. The Plant Journal. 42: 675-688.
Stewart, C. Jr., Mazourek, M., Giulia M. S., Mary O C. & Molly J. 2007. Genetic Control of Pungency in C. chinense Via the Pun1 Locus. Journal of Experimental Botany. 58: 979-991.
Yuwono, T. 2012. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
