TESIS
PEMBERIAN SEL PUNCA CD34
+DARAH TEPI MANUSIA SECARA SUBKUTAN MENINGKATKAN
JUMLAH SEL FIBROBLAS DAN KOLAGEN PADA KULIT TIKUS JANTAN WISTAR YANG DIPAJAN
SINAR ULTRA VIOLET B
MOCHAMAD SYAIFUDIN
PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2015
ii
TESIS
PEMBERIAN SEL PUNCA CD34
+DARAH TEPI MANUSIA SECARA SUBKUTAN MENINGKATKAN
JUMLAH SEL FIBROBLAS DAN KOLAGEN PADA KULIT TIKUS JANTAN WISTAR YANG DIPAJAN
SINAR ULTRA VIOLET B
MOCHAMAD SYAIFUDIN NIM 1290761013
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR
2015
i
iii
TESIS
PEMBERIAN SEL PUNCA CD34
+DARAH TEPI MANUSIA SECARA SUBKUTAN MENINGKATKAN
JUMLAH SEL FIBROBLAS DAN KOLAGEN PADA KULIT TIKUS JANTAN WISTAR YANG DIPAJAN
SINAR ULTRA VIOLET B
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister
Pada Program MagisterProgram Studi Ilmu Kedokteran Biomedik Program Pascasarjana Universitas Udayana
MOCHAMAD SYAIFUDIN NIM 1290761013
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR
2015
iv
Lembar Pengesahan
TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL 4 Agustus 2015
Pembimbing I Pembimbing II
Prof.Dr.dr.Wimpie I. Pangkahila, SpAnd,FAACS Dr.dr. Ida Sri Iswari, Sp.MK.,M.Kes
NIP : 194612131971071001 NIP :196105051990022001
Mengetahui Ketua Program Studi
Magister Ilmu Biomedik Program Pascasarjana Universitas Udayana
Dr.dr. Gde Ngurah Indraguna Pinatih, M.Sc, Sp.GK NIP : 195805211985031002
Direktur
Program Pascasarjana UniversitasUdayana,
Prof. Dr.dr.A.A. Raka Sudewi, Sp.S.(K) NIP. 195902151985102001
iii
v
Tesis ini Telah Diuji dan Dinilai Pada tanggal : 4 Agustus 2015
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Direktur Program Pasca Sarjana Universitas Udayana No : 1969/ UN 14.4/ HK/ 2015 Tanggal : 1 Juli 2015
Panitia Penguji Tesis adalah:
Ketua : Prof. Dr. dr. Wimpie I. Pangkahila, SpAnd, FAACS Anggota :
1. Dr.dr. Ida Sri Iswari, Sp.MK,M.Kes 2. Prof. dr. IGM. Aman, Sp.FK
3. Prof. dr. N. Tigeh Suryadhi, MPH,Ph.D 4. Dr. dr.Basuki Supartono, Sp.OT, MARS
vi
PERNYATAAN ORISINALITAS TESIS
Saya yang bertanda tangan di bawah ini menyatakan dengan sebenar – benarnya bahwa sepanjang sepengetahuan saya di dalam tesis dengan judulPEMBERIAN SEL PUNCA CD34+ DARAH TEPI MANUSIA SECARA SUBKUTAN MENINGKATKAN JUMLAH SEL FIBROBLAS DAN KOLAGEN PADA KULIT TIKUS JANTAN WISTAR YANG DIPAJAN SINAR ULTRA VIOLET B.
Tidak terdapat karya ilmiah yang pernah diajukan orang lain untuk memperoleh gelar akademik di suatu perguruan tinggi dan tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah dituliskan atau diterbitkan orang lain, kecuali yang secara tertulis dikutip dalam naskah ini disebutkan dalam sumber kutipan dan daftar pustaka.
Apabila ternyata dalam naskah Tesis ini dapat dibuktikan ada unsur plagiasi, saya bersedia Tesis ini digugurkan dan gelar akademik yang saya peroleh dibatalkan, serta diproses sesuai dengan perundang – undangan yang berlaku (UU No. 12 Tahun 2003 pasal 25 ayat 2 dan pasal 70).
Denpasar, Agustus 2015 Mahasiswa,
MOCHAMAD SYAIFUDIN NIM. 1290761013
PS : Magister Ilmu Biomedik Program Pasca Sarjana Universitas Udayana v
vii
UCAPAN TERIMA KASIH
Assalamu’alaikum warrahmatullahi wabarakatuh.
Segala puji dan syukur yang sedalam-dalamnya penulis panjatkan kepada Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-NYA sehingga penulis dapat menempuh pendidikan Program Magister Ilmu Biomedik Kekhususan Kedokteran Anti Penuaan (Anti Aging Medicinee) dan menyelesaikan tesis yang berjudul PEMBERIAN SEL PUNCA CD34+ DARAH TEPI MANUSIA SECARA SUBKUTAN MENINGKATKAN JUMLAH SEL FIBROBLAS DAN KOLAGEN PADA KULIT TIKUS JANTAN WISTAR YANG DIPAJAN SINAR ULTRA VIOLET B.
Selama penelitian ini, penulis mendapat banyak pengalaman sangat berharga yang dapat memperkaya wawasan dan menjadi pengalaman berharga dalam proses pembelajaran hidup penulis, baik dari segi ilmiah maupun aspek nilai sosial dan agama. Semua ini tidak lepas dari peran serta orang – orang di sekitar penulis. Pada kesempatan yang sangat berbahagia ini perkenanlah peenulis menghaturkan rasa hormat, penghargaan dan terima kasih yang sebesar – besarnya kepada :
1. Prof. Dr.dr. Wimpie I. Pangkahila, SpAnd, FAACS, selaku Pembimbing Tesis I, yang telah banyak memberikan waktu, dorongan semangat, perhatian yang besar, masukan ilmu yang berharga demi tercapainya kemajuan penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
2. Dr.dr. Ida Sri Iswari, Sp.MK.,M.Kes, selaku Pembimbing Tesis II, yang telah banyak memberikan waktu, dorongan semangat, perhatian serta
viii
masukan ilmu yang berharga demi tercapainya kemajuan penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
3. Prof. dr. IGM. Aman, Sp.FK, selaku Penguji Tesis, yang telah meluangkan banyak waktu, arahan khususnya metodologi penelitian dan statistik serta perbaikan demi tercapainya kemajuan penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
4. Prof. dr. N. Tigeh Suryadhi, MPH. Ph.D, selaku Penguji Tesis, yang telah meluangkan banyak waktu, arahan dan perbaikan demi tercapainya kemajuan penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
5. Dr.dr.Basuki Supartono, Sp.OT, MARS, selaku Penguji Tesis, yang telah meluangkan banyak waktu, arahan khususnya pengertian dan pemahaman sel punca CD34+ serta perbaikan demi tercapainya kemajuan penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
6. Dr. I. Gusti Kamasan Nyoman Arijana, M.Si.Med,yang telah banyak membantu dan mengarahkan pekerjaan histologi PA pada laboratorium histologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana demi tercapainya kemajuan penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
7. Drs. Ketut Tunas, yang telah banyak membantu dan membimbing dalam analisis data statistik sehingga tesis ini bisa menunjukkan hasil yang lebih sempurna.
8. I Gede Wiranatha, S.Si, yang telah membantu dan memberikan bimbingan di dalam pekerjaan persiapan dan pelaksanaan hewan coba di Animal Lab Unit Bagian Farmapologi FK Udayana sehingga tercapainya kemajuan penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
vii
ix
9. Latifah, Amd.Kep, yang telah membantu pekerjaan laboratorium sel punca CD34+ mulai dari pengambilan sampel darah tepi hingga proses separasi sel punca CD34+sehingga tercapainya kemajuan penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
10. Niswatin, AMAK, yang telah membantu pekerjaan laboratorium sel punca CD34+ mulai dari pengambilan sampel darah tepi hingga proses separasi sel punca CD34+ hingga tercapainya kemajuan penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
11. Kepada seluruh dosen yang telah memberikan kuliah penulis, memberikan ilmu dan ketrampilan di Program Pascasarjana ini, kami haturkan terima kasih yang tulus dan penghargaan yang setinggi – tingginya.
12. Istriku tersayang Farida Usmandita, atas pengorbanan, doa, kesetiaan dan perjuangan dalam mendampingi penulis hingga tercapainya kemajuan penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
13. Anak – anakku tercinta Itmamul Wafa, Atina Izzah Ar Rahma, Fathiyah Mu’azzaroh, Mochamad Wildan dan Sayyidah Thalia Adenia, yang selalu memberi dukungan dan kasih sayang, menyemangati sekaligus memberi inspirasi penulis demi tercapainya kemajuan penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
14. Teman seperjuangan dari angkatan ke VII Program Magister Ilmu Biomedik Kekhususan Anti-Aging Medicine, yang telah memberikan dukungan sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini.
x
15. Kepada seluruh staf administrasi program pascasarjana jurusan anti-aging medicine yang selalu memberikan bantuan dan kerjasamanya tidak
mengenal lelah, baik sewaktu kuliah hingga selesainya tesis ini.
Kepada semua pihak yang namanya tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah mendukung serta memberikan doanya, penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga.
Semoga Allah SWT selalu melimpahkan rahmat-Nya kepada semua pihak yang telah membantu dalam pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini.
Akhir kata, semoga penelitian sel punca CD34+ ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan sumbangsih aplikasi klinis di masa yang akan datang. Amin ya Robbal ‘alamin.
Denpasar, Juli 2015 Penulis
ix
xi
Abstrak
PEMBERIAN SEL PUNCA CD34+ DARAH TEPI MANUSIA SECARA SUBKUTAN MENINGKATKAN JUMLAH SEL FIBROBLAS DAN KOLAGEN PADA KULIT TIKUS JANTAN WISTAR YANG DIPAJAN
SINAR ULTRA VIOLET B.
Kulit adalah organ terluas dari tubuh manusia yang setiap hari mengalami proses penuaan oleh karenapajanan sinar ultraviolet matahari dengan menurunnya jumlah sel fibroblas dan kolagen. Sel punca CD34+dapat berdiferensiasi menjadi sel fibroblas dan kolagen. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui pemberian sel punca CD34+ darah tepi manusia secara subkutan meningkatkan jumlah sel fibroblas dan kolagen pada kulit tikus jantan wistar yang dipajan sinar ultraviolet B.
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental menggunakan metode penelitian Randomized Posttest Only Control Group Design. Dua kelompok tikus jantan wistar masing–masing 18 ekor dipajan ultra violet selama 4 minggu.
Kelompok pertama diberikan injeksi secara subkutan dengan cairan PBS (Phosphate Buffered Saline), sedangkan kelompok kedua diberikan injeksi sel punca CD 34+secara subkutan.Setelah 4 minggu dibuat sediaan histologi patologi – anatomi kulit tikus untuk dilihat jumlah sel fibroblas dan kolagen pada kedua kelompok tersebut.
Hasil dari penelitian ini adalahterjadi regenerasi jumlah sel fibroblas dan kolagen. Uji t – independent pada jumlah sel fibroblas menunjukkan bahwa nilai t
= 5,53 dan nilai p = 0,001, berarti rerata jumlah sel fibroblas pada kedua kelompok sesudah diberikan perlakuan berbeda secara bermakna (p<0,05). Uji t – independent pada jumlah kolagen menunjukkan bahwa nilai t = 7,05 dan nilai p = 0,001, berarti rerata jumlah kolagen pada kedua kelompok sesudah diberikan perlakuan berbeda secara bermakna (p < 0,05).Hal ini terjadi karena pemberian sel punca CD 34+ darah tepi manusia secara subkutan bersama jaringan mikro perancah dan sinyal molekul keratinocytes stem cells (KSCs) dan sinyal molekul lain yang ada dalam lapisan dermal kulit tikus bisa tumbuh menjadi sel fibroblas dan kolagen.
Pemberian sel punca CD 34+ darah tepi manusia secara subkutan dapat meningkatkan jumlah sel fibroblas dan kolagen pada kulit tikus jantan wistar yang dipajan sinar ultraviolet B. Perlu dilakukan uji klinik sebelum dilakukan pada manusia.
Kata kunci : sel punca CD34+, sel fibroblas, kolagen, degenerasi kulit, regenerasi kulit.
xii
Abstract
THESUBCUTANEOUS INJECTION OF CD34+HUMAN PERIPHERAL BLOOD STEM CELL COULD INCREASED AMOUNT OF FIBROBLASTS AND COLLAGENS IN THE SKIN OF MALE WISTAR
RATS THAT EXPOSED TO ULTRAVIOLET B
Skin is the largest humanorgan which is skin ageing process to exposed with ultraviolet B of the sun, can decrease amount of fibroblasts and collagens.The CD34+ human peripheral blood stem cell can differentiate to become fibroblasts and collagens. The aim of this research is to know that thesubcutaneous injection of CD34+human peripheral blood stem cell could increased amount of fibroblasts and collagens in the skin of male Wistar rats that exposed to ultraviolet B.
This research is experimental research using the research method of Randomized Posttest Only Control Group Design. Two groups of male Wistar rats for each group divided to eighteen male Wistar rats were exposed with ultraviolet Bfor 4 weeks. The once group was administered with subcutaneous injection containing PBS (Phosphate Buffered Saline), whereas the second group was administered with the subcutaneous injection CD34+ stem cells followed for 4 weeks.After four weeks, it was made the histology pathology – anatomy rats skin have been seen the amount of fibroblasts and collagens for the both of groups.
There was a regeneration of the number of fibroblasts and collagens.
Independent t-test to the number of fibroblasts showed that the value of t=5.53 and p=0.001, it meant that the average of the number of fibroblast in both groups after treatment was significantly different (p<0.05). Independent t-test to the number of collagens showed that the value of t=7.05 and p= 0.001, meant that the average of the number of collagens in both groups after treatment was significantly different (p<0.05). It happened because the subcutaneous injection of CD34+human peripheral blood stem cell with the scaffold and signaling molecule keratinocytes stem cells (KSCs) and the others regenerated to become fibroblasts and collagens.
The subcutaneous injection of CD34+human peripheral blood stem cell could increased amount of fibroblasts and collagens in the skin of male Wistar rats that exposed to ultraviolet B. It needs to do trial clinic before doing it to the human.
Key words: Stem cells CD34+, fibroblast, collagen, skin regeneration.
xi
xiii
DAFTAR ISI
Halaman
SAMPUL DALAM ... i
PRASYARAT GELAR ... ii
LEMBAR PENGESAHAN ... iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI ... iv
PERNYATAAN ORISINALITAS TESIS ... v
UCAPAN TERIMA KASIH ... vi
ABSTRAK ... x
ABSTRACT ... xi
DAFTAR ISI ... xii
DAFTAR TABEL ... xvi
DAFTAR GAMBAR ... xvii
DAFTAR SINGKATAN ... xviii
DAFTAR LAMPIRAN ... xix
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Rumusan Masalah ... 6
1.3 Tujuan Penelitian ... 7
1.3.1 Tujuan Umum ... 7
1.3.2 Tujuan Khusus ... 7
1.4 Manfaat Penelitian ... 7
1.4.1 Manfaat Metodologis ... 7
1.4.2 Manfaat Teoritis ... 7
xiv
1.4.3 Manfaat Aplikatif ... 8
BAB II KAJIAN PUSTAKA ... 9
2.1 Penuaang (Aging) ... 9
2.2 Kulit ... 10
2.2.1 Penuaan Kulit Kronologis ... 12
2.2.2 Penuaan Kulit Biologis (Photoaging) ... 15
2.2.3 Fibroblas ... 19
2.2.4 Kolagen ... 21
2.3 Sel Punca (Stem Cell) ... 25
2.3.1 Sel Punca Hematopoietik ... 27
2.3.2 Sifat Plastis Sel Punca Hematopoietik ... 27
2.3.3 Sel Punca CD34+ ... 29
BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN ... 32
3.1 Kerangka Berpikir ... 32
3.2 Kerangka Konsep ... 33
3.3 Hipotesis Penelitian ... 33
BAB IV METODE PENELITIAN ... 35
4.1 Rancangan Penelitian ... 35
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian ... 35
4.2.1 Lokasi Penelitian ... 35
4.2.2 Waktu Penelitian ... 36
4.3 Populasi dan Sampel ... 36
4.3.1 Populasi ... 36 xiii
xv
4.3.2 Kriteria Sampel ... 36
4.3.3 Besar Sampel ... 36
4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel ... 37
4.4 Variabel ... 37
4.4.1 Klasifikasi Variabel ... 37
4.4.2 Definisi Operasional Variabel ... 38
4.4.3 Hubungan Antar Variabel ... 40
4.5 Alat dan Bahan Penelitian ... 40
4.5.1 Alat Penelitian ... 40
4.5.2 Bahan Penelitian ... 41
4.6 Prosedur Penelitian ... 42
4.6.1 Pada Hewan Tikus ... 42
4.6.2 Pada Manusia ... 43
4.7 Alur Penelitian ... 53
4.8 Analisis Data ... 54
BAB V HASIL PENELITIAN ... 55
5.1 Hasil Penelitian ... 55
BAB VI HASIL DAN PEMBAHASAN ... 62
6.1 Subyek Penelitian ... 62
6.2 Distribusi dan Homogenitas Data Hasil Penelitian ... 62
6.3 Pengaruh Pemberian Suspensi Sel Punca CD34+ ... 62
BAB VII SIMPULAN DAN SARAN ... 68
7.1 Simpulan ... 68
7.2 Saran ... 68
xvi
DAFTAR PUSTAKA ... 69 LAMPIRAN ... 76
xv
xvii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Anatomi Kulit ... 11
Gambar 2.2 Efek Radiasi UV ... 16
Gambar 2.3 Histologis Photodamage, Pewarnaan HE ... 18
Gambar 2.4 Fibroblas ... 19
Gambar 2.5 Sifat Plastis Sel Punca Hematopoietik ... 28
Gambar 2.6 Skin Tissue Engineering ... 30
Gambar 2.7 Alur kerja sel punca CD34+ untuk regenerasi sel fibroblas dan kolagen. ... 31
Gambar 3.1 Kerangka Konsep Penelitian ... 33
Gambar 4.1 Skema Rancangan Penelitian In Vivo ... 35
Gambar 4.2 Kerangka Hubungan Antar Variabel ... 40
Gambar 4.3 Skema Alur Penelitian ... 53
Gambar 5.1 Perbandingan Jumlah Sel Fibroblas antara Kelompok Kontrol dengan Kelompok Perlakuan ... 57
Gambar 5.2 Perbandingan Jumlah Kolagen antara Kelompok Kontrol dengan Kelompok Perlakuan ... 58
Gambar 5.3 Jumlah Sel Fibroblas pada Jaringan Dermis Tikus Jantan Wistar dengan Pengecatan HE ... 59
Gambar 5.4 Jumlah Kolagen pada Jaringan Dermis Tikus Jantan Wistar dengan Pengecatan Picro-Sirius Red ... 59
xviii
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 2.1 Manifestasi histologis penuaan kulit kronologis
(YaarM,2006 ) ... 11 Tabel 5.1 Hasil Uji Normalitas Data Jumlah Sel Fibroblas dan
Kolagen Sesudah Perlakuan ... 55 Tabel 5.2 Homogenitas Data Jumlah Sel Fibroblas dan Kolagen antar
Kelompok Perlakuan ... 56 Tabel 5.3 Perbedaan Rerata Jumlah Sel Fibroblas antar Kelompok
Sesudah Diberikan Suspensi Sel Punca CD34+ ... 56 Tabel 5.4 Perbedaan Rerata Jumlah Kolagen antar Kelompok
Sesudah Diberikan Suspensi Sel Punca CD34+ PBS ... 57 Tabel 5.5 Gambaran histo PA kulit tikus kelompok kontrol dan
perlakuan ... 60
xvii
xix
DAFTAR SINGKATAN
1. ABC = ATP-binding cassette 2. ADM = Adrenomedulin
3. BFGF = Basic Fibroblast Growth Factor 4. BMI-1 = Polycomb Group Protein 1 5. bESCS = Multipotent Epitelial Stem Cells 6. CKS/14/15 = Cytokeratins 5/14/15
7. DC = Dendritic Cell
8. EDTA = Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid 9. EGFR = Epidermal Growth Factor Receptor
10. FB = Fibroblast
11. GM – CSF = Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor 12. HE = Hematoxillin Meyer
13. HGF = Hepatocyte Growth Factor 14. HLA – G5 = Human Leukocyte Antigen G5 15. IGF – 1 = Insuline Like Growth Factor-1 16. IL – 6 = Interleukin 6
17. INOS = Inducible Nitric Oxide Synthase 18. IRF6 = Interferon Requlatery factor 6
19. KC = Keratinocyte
20. KCl = Kalium Chloride 21. KCSs = Keratinous Stem Cells 22. LIF = Leukemia Inhibitory Factor
23. M – CSF = Macrophage Colony Stimulating Factor 24. MCP – 1 = Monocytes Chemoatractant Protein – 1 25. MMP = Matriks Metalo Proteinase
26. MNC = Mono Nuclear Cell 27. NaCl = Natium Chloride 28. NFKB = Nuclear Factor – KB 29. NK = Natural Killer
30. PBS = Phosphate Buffered Saline 31. PGE – 2 = Prostaglandin E2
32. P63 = Imunohistokimia p63 33. ROS = Reactive Oxygen Species 34. SCF = Stem Cell Factor
35. SDF – 1 = Stromal Derived Factor – 1 36. TGF – β = Transforming Growth Factor – β 37. Treg = T Cell Regulatory
38. UV-B = Ultra violet B
39. VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor
xx
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Uji Normalitas Data Jumlah Sel Fibrolas dan Kolagen ... 76
Lampiran 2 Uji t-independent Data Jumlah Sel Fibrolas dan Kolagen antara Kelompok Kontrol dengan Kelompok Perlakuan .... 77
Lampiran 3 Hasil Jumlah Sel Fibrolas per tiga lapangan pandang pembesaran 400 kali pada kelompok kontrol... 78
Lampiran 4 Hasil Jumlah Sel Fibrolas per tiga lapangan pandang pembesaran 400 kali pada kelompok perlakuan ... 80
Lampiran 5 Hasil prosentase jumlah kolagen pada tiga lapangan pandang pembesaran 400 kali pada kelompok kontrol ... 82
Lampiran 6 Hasil prosentase jumlah kolagen pada tiga lapangan pandang pembesaran 400 kali pada kelompok kontrol ... 84
Lampiran 7 Prosedur Hasil Penelitian ... 86
Lampiran 8 Keterangan Kelaikan Etik (Ethical Clearance) ... 90
Lampiran 9 Persetujuan Tindakan (Indormed Concern) ... 91
Lampiran 10 Persetujuan Setelah Penjelasan, Donor Stem Cell Sukarelawan ... 93
xix
