Perbedaan Sekuens Asam Amino Epitop
Sel T Sitotoksik dan Sel T helper
Virus Campak Liar dan Virus Vaksin
Campak di Indonesia*
Made Setiawan,* Agus Sjahrurachman,** Fera Ibrahim,** Agus Suwandono***
*Rumah Sakit Penyakit Infeksi Prof. Dr. Sulianti Saroso, Jakarta,**Departemen Mikrobiologi Klinik Fakultas Kedeokteran Universitas Indonesia, Jakarta, *** Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan RI, Jakarta
Abstrak: Virus campak adalah virus anggota genus morbilivirus termasuk famili
paramyxovi-rus dengan genom RNA untai tunggal negatif. RNA dikemas dengan protein nukleokapsid (N). Protein N sangat penting untuk replikasi dan translasi RNA. Di samping itu, protein N juga berperan dalam merangsang antibodi protektif pada pejamu. Bila terjadi perbedaan sekuen amino pada epitop sel B dan sel T pada protein N akan mengakibatkan perbedaan spesifisitas amtibodi yang muncul. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan sekuens asam amino epitop sel B dan sel T pada protein N antara virus campak liar dan virus vaksin campak. Penelitian ini menganalisis gen virus menggunakan teknologi biologi molekuler dan bioinformatika. Perbedaan sekuens asam amino pada epitop sel T sitotoksik (52-59) ditemukan antara virus campak liar dan virus vaksin CAM-70, sedangkan antara virus campak liar dengan vaksin Schwarz dan Edmonston-wt tidak ditemukan perbedaan. Demikian juga, perbedaan sekuens asam amino epitop sel T helper ditemukan antara virus campak liar dan virus vaksin CAM-70, virus vaksin Schwarz dan Edmonston-wt. Disimpulkan bahwa terdapat perbedaan sekuens asam amino pada epitop sel B dan epitop sel T protein N antara virus campak liar dan virus vaksin.
Kata kunci: virus campak, protein epitop sel B, epitop sel T.
* Penelitian ini merupakan bagian dari Disertasi Doktor yang dipertahankan didepan Senat FKUI pada tanggal, 20 Agustus 2005 yang berjudul Analisis Genetik dan Antigenik Beberapa Virus Campak Liar dan Virus Campak di Indonesia.
Maj Kedokt Indon, Volum: 59, Nomor: 1, Januari 2009
Amino Acid Sequence Differences of Cytotoxic T-Cell and
Helper T-Cell Epitope of Wild-Type
Measles Virus and Vaccine Virus in Indonesia
Made Setiawan,* Agus Sjahrurachman,** Fera Ibrahim,** Agus Suwandono***
*Infection Diseases of Hospital Sulianti Saroso,
**Department of Microbiology Faculty of Medicine, University of Indonesia, Jakarta ***National Institute of Health Reseach and Development, Ministry of Health RI, Jakarta
Abstract: Measles virus is a negative single-strand RNA virus, a member of genus Morbillivirus
which belongs to Paramyxoviridae family. RNA is packed by nucleokapsid (N) protein. Nucle-oprotein is very important for RNA replication and translation. Moreover, nucleNucle-oprotein is in-volved in inducing the protective antibody in the hosts. When the differences amino acid of cytotoxic T-Cell and helper T-Cell occurs in nucleoprotein, leadding to the differences of antibody specificity to those epitope. The purpose of this research is to know the amino acid sequence differences of cytotoxic T-cell and Helper T-Cell epitope of nucleoprotein between the wild-type measles virus and the measles vaccine virus. This research is a laboratory-based research using biomoleculer and bioinformatic technology to analyse the virus gene. We found the amino acid sequence differences of cytotoxic T-cell epitope of N protein (52-59) between the wild-type measles virus and the CAM-70 vaccine virus. However, we did not find the differences between the wild-type measles virus with Schwarz vaccine and Edmonston-wt. On the other hand, we found the differences of Helper T-Cell epitope of N protein between the wild-type measles virus and CAM-70 vaccine virus, and between Schwarz vaccine virus and Edmonston-wt. The study concluded that there are amino acid sequence differences of B-cell epitope and T-cell epitope of N protein between the wild-type measles virus and the vaccine virus.
Keywords: Measles virus, B-cell epitope of N protein, T-cell epitope of N protein.
Pendahuluan
Virus campak adalah anggota genus morbilivirus dari famili paramyxovirus merupakan virus berselubung, di dalamnya mengandung genom RNA untai tunggal negatif (-). Genom RNA mengkode protein N, F, P/V/C, H, M, dan L.1,2
Bagian luar RNA virion dikemas dengan protein nukleokapsid menjadi partikel ribonukleoprotein yang berbentuk heliks atau nukleokapsid. Gabungan antara RNA dan protein N sangat stabil, karena nukleokapsid sangat tahan terhadap konsentrasi garam yang tinggi dan pencernaan enzim nuklease. Nukleoprotein merupakan salah satu komponen yang sangat penting untuk replikasi virus. Dalam replikasi virus, nukleoprotein bekerjasama dengan protein P (fosfoprotein) dan protein L (polimerase) untuk replikasi dan translasi RNA virus. mRNA nukleoprotein yang pertama ditranskripsi dari genom, dan antibodi terhadap protein N adalah yang terbanyak ditemukan dibandingkan dengan antibodi terhadap protein lain dari virus campak.3-5
Berdasarkan fungsinya, protein N dibagi menjadi tiga domain, yaitu situs pengikatan dengan protein P untuk mem-bentuk komplek enkapsidasi N-P, situs pengikatan dengan protein N yang lain untuk merakit nukleokapsid, dan situs pengikatan dengan RNA untuk memulai dan memperpanjang
pada saat merakit RNA. Apabila ada kelainan pada struktur protein N maka proses replikasi virus akan terganggu.6
Di samping itu, bila virus campak menginfeksi pejamu, maka sistem imun pejamu akan memberi respons terhadap protein N, dapat berupa respons imun seluler maupun respons imun humoral. Antibodi terhadap protein N dapat digunakan untuk mendiagnosis penyakit campak, karena ti-ter antibodi yang ditimbulkan relatif lebih tinggi dibandingkan dengan antibodi terhadap protein yang lain.7
Sampai saat ini sudah dikenal tiga epitop Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) pada protein N yaitu, asam amino 52-59, 81-88, dan 281-289.8 Epitop untuk sel T helper ada dua yaitu,
residu asam amino 57-98 dan 457-525.9,10 Juga telah diketahui
bahwa, terdapat perbedaan genetik dan sifat antigenisitas antara virus campak liar dan virus vaksin di Amerika Serikat.11
Ada tiga genotip virus campak liar yang beredar di Indonesia yaitu, G2, G3, dan D9, sedangkan jenis vaksin yang
banyak digunakan adalah vaksin CAM-70 dan Schwarz.12
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui perbedaan sekuens asam amino epitop sel B dan sel T pada protein N antara virus campak liar (genotype G2, G3, dan D9) dan virus vaksin campak (CAM-70 dan Schwarz) yang ada di Indonesia.
Metode
Isolat virus campak liar yang digunakan adalah isolat virus yang sudah ada di Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan RI, yang genotipnya sudah ditentukan oleh ICDC (Atlanta-USA) yaitu genotip G2, G3, dan D9. Genotip isolat ini juga ditentukan ulang di Indonesia dengan hasil yang sama.13 Sekuens gen N virus
vaksin Schwarz dan virus Edmonston-wt diambil dari bank gen.
Ekstraksi RNA virus dilakukan dengan menggunakan
QIAamp® Viral RNA Mini Kit dari QIAGEN (Katalog No.5204) dilakukan sesuai dengan petunjuk yang diberikan
oleh perusahaan. RNA diamplifikasi menggunakan mesin PCR dengan primer yang dibuat berdasarkan analisis sekuens referensi galur Edmonston-wt, substrain AIK-C (AB046218) NCBI.14 Program komputer yang digunakan adalah piranti
lunak Primer-3.
Reaksi Reverse transcriptase (reaksi transkripsi terbalik) dilakukan menggunakan kit SuperScriptTMIIIReverse
Tran-scriptase (Invitrogen) dengan cara sesuai dengan protokol
yang diberikan oleh perusahan. cDNA yang diperoleh dari reaksi Reverse Transcriptase diperbanyak dengan metode PCR menggunakan Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen). Primer yang digunakan adalah susunan primer seperti yang terdapat pada Tabel 1. Produk PCR dianalisis dengan elektroforesis gel yang dideteksi berdasarkan berat molekul atau panjangnya rantai nukleotida. Gen N mempunyai nukleotida DNA 1 685 pb. Untuk mendeteksi produk PCR ini digunakan agarose gel 2% dicampur dengan 10 ml (1 mg/ml)
ethidium bromide dengan voltage 100 volt, selama 40 menit.15
Gel divisualisasikan menggunakan dokumentasi gel dengan sinar ultraviolet.
Produk DNA dimurnikan dengan menggunakan kit (QIAGEN). Kit purifikasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah kit QIAquick Gel Extraction Purification (QIAGEN Cat. No.28704), yaitu produk PCR dijalankan pada
Low Melting Agarose terlebih dahulu sebelum dipurifikasi.
Cara yang dilakukan sesuai dengan protokol yang diberikan oleh perusahaan.
Untuk melakukan cloning hasil PCR, maka digunakan
TOPO TA Cloning kit buatan Invitrogen (Cat.
No.K4500-01). Cara melakukan reaksi sesuai dengan protokol yang diberikan oleh perusahaan. Ekstraksi plasmid dilakukan
Tabel 1. Primer Digunakan untuk PCR dan Sekuensing
Nama Primer Urutan Nukleotida Posisi
Primer N 1 Cag ggA CAA gAg CAg gAT TA 75-95 2 gTT CCT CAC CAC ATC CAA CC 751-770 Primer N 3 gAA ggT ggA TAA AgT ACA CCC AAC 688-711 4 CTT TgA TCA CCg TgT AgA AAT gAT 1358-1382 Primer N 5 CAC ATT ggC ATC TgA ACT Cg 1241-1260 6 CAA TgA Tgg Agg gTA ggC Ag 1714-1734
sesuai dengan protokol yang diberikan oleh perusahan
QIAGEN dengan menggunakan kit QIAprep® Spin Miniprep
(Cat. No. 27104). Filtrat dalam tabung mikrosentrifugasi diberi label dan disimpan untuk sequencing.
Sequencing dilakukan dengan Direct Sequencing dari
hasil PCR gen N. DNA disekuens dengan menggunakan
au-tomatic sequencer berdasarkan metode Sanger (dideoxy termination method) pada mesin automatic ABI PRISMÒ Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Primer
yang dipakai untuk mensekuens sama dengan primer pada tabel 1.
Gambar 1. Strategi Mensekuens Gen N dengan Primer Arah Berlawanan yang Tumpang Tindih
Data mentah hasil pembacaan komputer diperiksa ulang dengan membandingkan gambar elektroferogram dengan data sekuens yang telah ada (Edmonston-wt, CAM-70, Schwarz). Fragmen sekuens yang telah dikoreksi disambung satu sama lain, sehingga menjadi sekuens gen N yang lengkap, dengan bantuan software Genetyx dan Bioedit.
Masing-masing sekuens gen N yang diperoleh dibandingkan satu sama lain (antara ketiga gen virus liar, gen virus vaksin CAM70, Schwarz, dan Edmonston yang sebagian diperoleh dari data genebank NCBI di internet
http://www.ncbi.nlm. nih.gov). Sekuens asam amino
diperoleh dengan mendeduksi sekuens nukleotida hasil sekuensing virus campak liar dan virus vaksin CAM-70. Perbandingan sekuens asam amino dilakukan pada keenam galur virus menggunakan software Genetyx, Clustal W, dan
Bioedit. Software Bioedit dan Clustal W. Hasil
Epitop Spesifik CTL (cytotoxic T lymphocyte) pada Pro-tein N
Epitop spesifik CTL pada protein N adalah peptida dengan susunan asam amino 52-59, 81-88 dan 281-289. Apabila ketiga epitop pada G2, G3, dan D9 dibandingkan dengan Edmonston-wt, Schwarz, dan CAM-70, ternyata asam amino epitop 81-88 dan 281-289 adalah sama pada keenam galur virus, sedangkan asam amino epitop 52-59 berbeda. Asam amino 55 L (leusin) pada virus campak Edmonston, Schwarz, G2 dan D9, sedangkan G3 adalah W (triptopan).
Leader Gen N Gen P
I1 I2 13 14 15 16 > > > < < <
Maj Kedokt Indon, Volum: 59, Nomor: 1, Januari 2009
Asam amino 58 L (leusin) pada Edmonston, Schwarz, G2, G3 dan D9, sedangkan CAM-70 adalah S (Serin). Ketiga peptida ini sangat efisien untuk mensensitisasi sel, walaupun dalam konsentrasi yang sangat rendah. Akan tetapi, di antara ketiga peptida epitop tersebut, yang paling efisien adalah peptida 52-59.8
Epitop Sel T Helper
Terdapat dua epitop sel T helper yang sangat penting pada protein N, yaitu residu 57-98 dan 457-525.9,10 Bila kedua
epitop dibandingkan pada keenam galur virus, ternyata pada epitop asam amino 57-98 ditemukan perbedaan pada asam mino 58 S (serin) pada CAM-70, sedangkan pada galur yang lain (G2, G3, D9, Schwarz, dan Edmonston) adalah L (leusin). Perbedaan sekuens asam amino banyak ditemukan pada epitop asam amino 457-525. Perbedaan terletak pada asam
Gambar 2. Epitop CTL pada Protein N (bayang hitam) (52-59, 81-88, 281-289
amino 460, 462, 466, 470, 479, 481, 482, 504, 509, 511, 515, dan 521 (lihat Gambar 3).
Diskusi
Respons CTL adalah sangat penting untuk proses penyembuhan penyakit campak. Dalam proses penyem-buhan, respon CTL yang terpenting adalah terhadap protein N dibandingkan glikoprotein. Dikatakan bahwa respons CTL terhadap glikoprotein dapat meningkatkan kematian pada hewan coba, sedangkan terhadap protein N dapat me-nurunkan angka kematian. Berdasarkan hasil penelitian, pro-tein N dapat menginduksi CTL dua kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan glikoprotein.8
Cytotoxic T lymphocyte CD8+ antivirus campak sangat
penting pada saat dan sesudah terjadi infeksi akut. Protein N merupakan satu-satunya antigen pada virus campak, yang
Gambar 3. Epitop Sel T helper pada Protein N. (bayang hitam) (57-98, 457-525).
dapat merangsang respons CTL dengan sangat kuat.8 Dari
hasil analisis epitop 52-59 spesifik CTL pada protein N ternyata ditemukan perbedaan pada posisi asam amino 52, 55 dan 58. Asam amino 52 G (glisin) ditemukan pada genotip G3, sedangkan pada genotip G2, D9, CAM-70 dan Schwarz adalah L (leusin), asam amino 55 W (triptopan) pada genotip G3, sedangkan pada genotip G2, D9, CAM-70 dan Schwarz adalah L (leusin). Asam amino 58 S (serin) pada CAM-70, sedangkan pada genotip G2, G3, D9 dan Schwarz berupa L (leusin). Antara asam amino serin dan leusin merupakan asam amino dengan sifat yang berbeda. Serin termasuk kelompok asam amino hidrofilik yang tidak mengandung ion, sedangkan leusin termasuk kelompok asam amino hidrofobik. Epitop ini adalah paling efisien untuk mensensitisasi sel. Bila beberapa asam amino dari epitop ini mengalami perbedaan, maka kemampuan untuk mensensitisasi sel juga akan berbeda, sehingga kemampuan untuk menghancurkan virus juga berbeda.8
Sel T helper adalah sangat penting untuk merangsang sel B agar memproduksi antibodi dan meningkatkan fungsi CTL.16 Epitop spesifik sel T helper pada protein N terletak
pada asam amino 57-98.9,10 Dari hasil penelitian ini juga
ditemukan perbedaan sekuens asam amino pada epitop spesifik sel T helper tersebut. Perbedaan ditemukan satu lokasi pada posisi asam amino 58. Ke dua asam amino yang berbeda mempunyai sifat yang berbeda. Juga, ditemukan perbedaan susunan asam amino pada epitop 457-525. Perbedaan tersebut ditemukan pada 12 posisi. Dari 12 posisi perbedaan asam amino, 9 dengan sifat asam amino yang berbeda. Hal ini akan mengakibatkan terjadinya perbedaan sensitisasi terhadap sel T helper..
Kesimpulan
Dari hasil analisis sekuens nukleotida gen N dan asam amino protein N dapat disimpulkan adanya perbedaan sekuens asam amino pada epitop sel T sitotoksik (52-59) antara virus campak liar dan virus vaksin CAM-70, sedangkan antara virus campak liar dengan vaksin Schwarz dan Edmonston-wt tidak ditemukan perbedaan. Demikian juga, perbedaan sekuens asam amino epitop sel T helper ditemukan antara virus campak liar dan virus vaksin CAM-70, virus vaksin Schwarz dan Edmonston-wt.
Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih kami sampaikan kepada Bapak Dr I Nyoman Kandun MPH Dirgen P2M dan PLP Departemen Kesehatah RI yang telah memberikan dana untuk penelitian ini. Demikian juga ucapan terimakasih kami sampaikan kepada
bapak Harun, Joko, Bambang di LitbangKes, Diah Iskandriati, Joko Pamungkas, Uus Saefullah, Silmi di PSSP IPB Bogor, yang semuanya membantu kami sehingga penelitian ini dapat terselesaikan.
Daftar Pustaka
1 . Tyrell DIJ, Norrby F. Structural polypeptides of measles virus. J Gen Virol. 1978;39:219-29.
2 . Rima BK. The proteins of morbilli viruses. J Gen Virol. 1983;64:1205-19.
3 . Bellini WJ, Rota JS, Rota PA. Virology of measles virus. J Infect Dis. 1994;170(suppl.1):S15-23.
4 . Lamb RA, Kolakofsky D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM. Fields Viro-logy. 3rd ed. Philadelpia-New York: Lippincott-Raven; 1996.p.
1177-204.
5 . Griffin DE, Bellini WJ. Measles Virus. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM. Fields Virology. 3rd ed. Philadelpia-New York:
Lippincott-Raven; 1996.p.1267-312.
6 . Bankamp B, Horikami SM, Thompson PD, Huber M, Billeter M, Moyer SA. Domains of the Measles Virus N Protein Required for Binding to P Protein and Self-Asembly. Virology. 1996;216:272-7 .
7 . Grave M, Griffin DE, Johnson RT, Hirsch RL, Soriano L, Roedenbeck S, Vaisberg A. Development on antibody to measles virus polypeptides during complicated and uncomplicated measles virus infections. J Virol. 1984;49:409-12.
8 . Beauverger P, Chadwick J, Buckland R, Wild TF. Serotype-spesific and canine distemper virus cross-reactive H-2KK-restricted cy-totoxic T lymphocyte epitopes in the measles virus nukleo-protein. Virology. 1994;203:172-7.
9 . Rota JS, Wang ZD, Rota PA, Bellini WJ. Comparison of sequnces of the H, F, and N coding genes of measles virus vaccin strains. Virus Res. 1994;31:317-30.
10. Rota PP, Bloom AE, Vanehiere JA, Bellini WJ. Evolution of the nucleopreotien and matrix gene of wild-type strains of measles virus isolated from recent epidemics. Virology. 1994;198:724-30.
11. Tamin A, Rota PA, Wang Z, Heath JL, Anderson LJ, Bellini WJ. Antigenic analysis of current wild type and vaccine strains of measles virus. J Infect Dis. 1994;170:795-801.
12. Litbangkes Depkes RI. Laporan hasil pengamatan KLB di beberapa wilayah di Indonesia. (1998).
13. Litbangkes DepKes RI. Laporan hasil genotip virus campak yang dikirim oleh WHO. (2002).
14. Komase K, Suzuki N, Nakayama T, Miki K, Kawanishi R, Fukuda K. Genom sequence of measles virus. NCBI no. accession: AB046218 (2001).
15. Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM, and Strober W. Current Protocols in Immunology. Vol. I. National Institut of Health: John Wiley & Sons; 1996.p.8.0.1-8.15.24. 16. Flint SJ, Enquist LW, Krug RM, Racaniello VR, Skalka AM.
Prin-ciple of Virology, Moleculer Biology, Pathogenesis and Control. Washington D.C. ASM press, 2000.p.479-515.
