BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Avian Influenza-zoonosis Research Center (AIRC-Unair) laboratorium Avian Influenza BSL-2 dan Animal-BSL3 Universitas Airlangga Surabaya pada bulan Agustus 2011 sampai Agustus 2012.
4.3 Sampel Penelitian
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
1. Isolat virus Avian Influenza subtipe H5N1 yang telah menginfeksi manusia dimana isolat diperoleh dari Balitbangkes (Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan) Jakarta.
2. Shedding virus dari mamalia dan unggas yang diperoleh dari swab nasal, nasofaring, dan nasal wash.
4. 4 Bahan dan Alat Penelitian 4. 4. 1 Bahan penelitian
Bahan sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat virus avian influenza subtipe H5N1 untuk diinfeksikan pada hewan coba. Sampel yang digunakan untuk analisis mutasi protein adalah sampel swab nasal, nasofaring, dan
nasal wash dari hewan coba yang telah diinfeksi dengan isolat virus H5N1 asal manusia yang kemudian diinokulasi pada telur ayam berembrio (TAB).
Untuk menginfeksi hewan coba diperlukan bahan-bahan berupa ketaminedan PBS (Phosphat Buffer Saline) steril. Sedangkan untuk pengujian virus avian influenza yaitu PBS steril, RBC (Red Blood Cell) ayam dan marmut (Guinea pig), serum antibodi hasil vaksin H5N1 Reverse Genetic. Bahan untuk SGS-PAGE: Tris HCl (Nacalai tesque,inc), Bis Acrylamide (Nacalai tesque,inc), SDS (Sodium
Duodecyl Sulfate) (Nacalai tesque,inc), akuades, TEMED
(Tetrametylanethilenediamine) (Nacalai tesque,inc), APS (Bio-Rad, cat 161-0700), Broad Marker Protein (Bio-Rad).
Dalam penelitian ini menggunakan beberapa hewan percobaan yaitu ayam SPF (Spesific Pathogenic Free) yang ditetaskan didalam fasilitas kandang ABSL3 berumur 6-8 minggu. Selanjutnya monyet SPF dari spesies Macaca fascicularis
berumur 3-5 tahun dengan berat badan 3-5 kg yang diperoleh dari PT. Inquitex Bogor. Hewan lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah ferret yang diberi vaksinasi dengan vaksin H5N1 Reverse Geneticdan tidak divaksin.
4. 4. 2 Alat penelitian
Alat yang diperlukan untuk infeksi pada hewan coba yaitu BSC (Bio Safety Cabinet) II, mikropipet 200µl dan 1000µl, yellow tips, blue tips, tabung konikal 15ml, alat timbang berat badan, dan termometer. Sedangkan alat yang digunakan untuk koleksi isolat virus dan inokulasi pada TAB antara lain: botol BD + swab, egg candler, tabung 1,5ml (eppendorf), mikropipet 1000µl dan 200µl, spuit 1ml, sentrifuge.
Peralatan yang diperlukan untuk uji antisera hasil shedding virus antara lain: 96 well mikroplate U dan V, BSC II, mikropipet 25 µl dan 50 µl, yellow tips, blue
tips, reservoir, tabung konikal 15 ml dan 40 ml. Sedangkan alat yang digunakan untuk elektroforesis adalah OmniPAGE mini Cleaver Scientific ltd.
4. 5 Metode dan Prosedur Kerja
4. 5. 1 Infeksi virus avian influenza H5N1 asal manusia pada hewan percobaan. 4. 5. 1. 1 Monyet
Sebelum dilakukan infeksi pada monyet maka monyet harus dianestesi terlebih dahulu dengan menggunakan ketamine. Anestesi dilakukan dalam kandang jepit monyet melalui penyuntikan secara intra muskular. Monyet yang sudah dalam keadaan tidak sadar dikeluarkan dari dalam kandang untuk dilakukan penimbangan berat badan dan pengukuran suhu tubuh. Hewan dimasukkan ke dalam BSC II, infeksi dilakukan secara intranasal, intratrachea pada tonsil, intraocular pada konjungtiva kanan dan kiri dengan menggunakan mikropipet.
4. 5. 1. 2 Ayam
Pada saat infeksi virus AI subtipe H5N1 pada ayam, maka ayam dikeluarkan dari dalam kandang di ABSL3 dan dimasukkan ke dalam BSC II. Virus diinfeksikan pada ayam melalui inokulasi virus H5N1 secara intranasal dan intratrakea dengan menggunakan mikropipet. Setelah diinfeksi ayam dikembalikan ke dalam kandang.
4. 5. 1. 2 Ferret
Sebelum dilakukan infeksi maka ferret harus dianestesi terlebih dahulu dengan menggunakan ketamine dan xylasin. Anestesi dilakukan dalam BSC II secara intra muscular. Ferret yang sudah dalam keadaan tidak sadar dilakukan penimbangan berat badan dan pengukuran suhu tubuh. Infeksi dilakukan secara intranasal dan intratrakea dengan menggunakan mikropipet.
4. 5. 2 Teknik pengambilan sampel
Semua hewan dilakukan pengamatan selama enam jam pertama, enam jam kedua dan 24 jam setelah infeksi. Selanjutnya pengamatan dilakukan setiap 24 jam sekali meliputi kondisi umum dan gejala klinis yang muncul. Pengambilan swab nasal, nasofaring, dan nasal wash dilakukan pada setiap pengamatan sampai hari ke 14 setelah infeksi.
Sampel swab nasal, nasofaring, dan nasal wash yang diperoleh dimasukkan ke dalam medium transport dan disimpan dalam freezer-80°C sampai saat sampel siap dikerjakan atau langsung dilakukan preparasi sampel di dalam BSC II.
4. 5. 3 Preparasi sampel swab asal hewan percobaan
Sampel swab yang diperoleh di dalam medium transport dipreparasi di dalam BSC II dengan cara : sampel di vortex selama 15 detik, kemudian cotton swab
dikeluarkan dari dalam botol medium. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit, ambil bagian supernatan dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang selanjutnya dismpan dalam freezer -80°C sampai sampel siap dikerjakan.
4. 5. 4 Inokulasi virus
Supernatan hasil dari sentrifuge diinokulasikan pada TAB berumur 9-11 hari yang bersifat SPF (Specific Pathogenic Free) yang telah didesinfeksi dengan alkohol 70%. Kemudian TAB diberi tanda batas dengan pensil antara rongga hawa dan isi telur dengan bantuan egg candler. Pembuatan tanda “x” untuk lubang tidak boleh dekat dengan embrio dan tidak boleh pada tempat yang terdapat banyak pembuluh darah. Jarak pembuatan lubang kurang lebih 3-5 mm dari batas ruang hawa. TAB
yang sudah diberi tanda “x” diberi iodine kemudian dilubangi dengan alat pelubang steril. Supernatan diinokulasikan (0,2 ml/TAB) kemudian ditutup dengan parafin atau selotip kertas. TAB diinkubasikan pada inkubator 37°C selama empat hari. Setiap hari telur ayam bertunas ini diamati untuk dicandling embrionya. Embrio yang mati sebelum empat hari, dikeluarkan dari inkubator kemudian disimpan pada refrigerator
4°C. TAB yang belum mati setelah empat hari dimatikan dengan cara memindahkan TAB ke dalam freezer 4°C semalam atau TAB dimasukkan ke dalam freezer -5°C selama 2-3 jam kemudian dipindahkan pada lemari pendingin selama 1 jam.
Isolasi virus pada cairan allantois telur ayam berembrio (TAB) dan identifikasi dengan uji HA dan HI dilakukan berdasarkan prosedur baku (WHO, 2002). Kemudian TAB dibuka dan diambil cairan allantoisnya untuk diuji Hemaglutinasi (uji HA). Uji HA bertujuan untuk mendeteksi virus dan selanjutnya bila uji HA bernilai positif dilakukan pemanenan cairan allantois, untuk dilakukan identifikasi virus dengan uji HI (Ernawati dkk., 2007).
4. 5. 5 Uji hambatan hemaglutinasi (HI Test) antisera
Reaksi hambatan hemaglutinasi ini dapat digunakan untuk membantu diagnosis laboratorium dalam melakukan identifikasi virus. Selain itu juga dapat menentukan status kekebalan setelah vaksinasi atau sembuh dari penyakit dengan mengetahui titer antibodi atau antiserum.
Langkah-langkah dalam uji HI antisera seperti HI mikroteknik biasanya yaitu sebagai berikut : Menyediakan microplate “V” untuk sampel dari ayam, sedangkan sampel mamalia menggunakan microplateU. Kemudian lubangmicroplatediisi PBS 25 µl dari lubang no 1 sampai 12 pada baris B sampai baris H. Masukkan antigen
sebanyak 50 µl pada lubang no 1 sampai 12 pada baris A, kemudian dibuat pengenceran serial dengan cara mengambil 25 µl antigen dari lubang no 1 sampai 12 pada baris A kemudian dipindahkan ke lubang no 1 sampai 12 pada baris B dan dicampur hingga rata, dari lubang n0 1 sampai 12 pada baris B diambil 25 µl dan dipindahkan ke lubang no 1 sampai 12 pada baris C demikian seterusnya. Semua lubang ditambahkan dengan antiserum H5N1 23 HAU/25 µl sebanyak 25 µl, kecuali lubang no 1 sampai 12 pada baris H, kemudian microplate diletakkan di mechanical vibrator hingga antiserum dan antigen tercampur rata, kemudian diinkubasikan pada suhu 22 ºC -25ºC selama 30 menit. Setelah diinkubasi semua lubang ditambahkan
Red Blood Cell (RBC) ayam 0,6 % sebanyak 50 µl untuk sampel ayam sebangkan sampel mamalia menggunakan RBC marmut konsentrasi 0,75 %, kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 30 menit. Langkah terakhir diadakan penentuan titer HI dari sampel yang diperiksa. Hasil uji HI positif ditandai dengan adanya pengendapan eritrosit berbentuk titik di tengah.
4. 5. 6 Analisis profil protein dengan SDS-PAGE 10%
Membuat running gel 10% dengan reagen antara lain Acrylamide 5 mL, resolving Tris HCl (pH 6.8) 3,75 mL, akuades 5 mL, TEMED 15 µL, APS 10% 150 µL. Kemudian dimasukkan running gel10% lewat dinding sampai kira-kira 1 cm dari atas. Selanjutnya ditambahkan akuades ± 1 mL dan dibiarkan 25 menit. Kemudian membuat stacking gel dengan reagen antara lain (Acrylamide 0.66 mL, stacking Tris-HCl (pH 8.8) 0.8 mL, SDS 0.5 % 0.8 mL,TEMED 4µL, APS 10% 20 µL). Setelah gel membeku akuades dibuang dan dimasukkan stacking gel lewat dinding sampai
penuh. Combdimasukkan, dibiarkan selama 25 menit kemudian diambil. Selanjutnya cetakan gel diambil dan dimasukkan ke alat OmniPAGE mini Cleaver Scientific ltd
(Elektroforesa). Selanjutnya masukkan sampel yang telah diberi leamly buffer pada setiap sumuran gel sebanyak 10 µL, kemudian listrik dijalankan dengan V=125, mA=40 selama 100-150 menit. Setelah warna biru turun, alat dimatikan dan gel diambil kemudian diletakkan pada petridisk. Dilakukan pencucian I dengan fixing solution (metanol 50% + asam asetat 10% + H2O 40%) digoyang selama 2 jam kemudian larutan dibuang. Selanjutnya pewarnaan dengan comasie 0,05 gram + metanol 50ml + asam asetat 10ml + H2O 40 ml , digoyang selama 1-2 jam kemudian larutan dibuang. Pencucian II dengan fixing solution digoyang selama kurang lebih 1 menit kemudian larutan dibuang. Pencucian III dengandestaining solution(methanol 5ml + asam asetat 7ml + H2O 88ml) digoyang selama 2 jam kemuudian larutan dibuang. Pencucian IV sama dengan pencucian III selama 30 menit kemudian larutan dibuang diganti dengan akuades.
4. 5. 7 Analisis protein antigenik dengan western blot
Gel hasil SDS-PAGE pertama-tama direndam dan digoyang dalam transfer buffer (Tris base 4,55gram, glycine 21,6 gram, akuades sampai 500 ml kemudian ditambah methanol 15% sebanyak 150ml dan H2O sebanyak 100 ml sehingga volume total menjadi 750 ml ). Sebelumnya membrane nitrocellulose direndam dalam methanol selama kurang lebih 2 detik kemudian direndam dalam transfer buffer selama 15 menit. Kemudian gel, nitrocellulose, dan paper filter disusun dengan urutan dari bawah ke atas sebagai berikut: filter paper, gel, nitrocellulose, dan filter paper. Selanjutnya susunan gel, nitrocellulose dan filter paper diletakkan diantara
anode dan katode dengan V=125, mA=40 selama 1 jam. Setelah itu nitrocellulose
dipindah ke dalam petri dan direndam dengan skim milk selama kurang lebih 1-2 jam. Selanjutnya nitrocellulosedikeringkan dan ditambahkan first antibodydigoyang selama 1 jam, kemudian dicuci dengan PBS tween sebanyak 3 kali selama masing-masing 15 menit. Setelah itu diberi second antibodydan diinkubasi sambil digoyang selama kurang lebih 1 jam. Selanjutnya ditambahkan substrat sampai keluar warna, kemudian setelah keluar warna substrat diganti dengan akuades sampai jernih.
4. 5. 8 Diagram Alir Penelitian
Virus Avian Influenza H5N1 asal manusia
ayam ferret monyet
sheddingvirus Avian Influenza
Uji antisera dengan antiserum hasil vaksinasi vaksin H5N1Reverse Genetic
Analisis profil protein virus Avian Influenza H5N1
Analisis kesesuaian antibodi vaksin
Reverse Geneticdengan shedding
virus Avian Influenza H5N1
Antisera (+) Antisera (-)
