KUIS
• 1.Bagaimanakah cara untuk
mengetahui kelainan pada molekul DNA?
• 2.Apakah yang disebut DNA probe
dan apa syaratnya?
• 3.Apakah guna reporter dan dimana
meletakkannya ?
• 4.Apakah gunaanya PCR, dan
PERTEMUAN KE XIV
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
RT - PCR
• > Pengertian :
• adalah proses pembentukan cDNA dengan mRNA sebagai template.
• > Komponen yang diperlukan :
– 1. sampel mRNA
– 2. Enzim reverse transcriptase
– 3.dNTP
– 4. reaksi bufer
– 5. oligo dT
– 6. ion Mg++
– 7. primer DNA
Tahapan dalam pembuatan
cDNA
• 1.Isolasi RNA total dari jaringa atau
organ.
• 2. Elektrophoresis gel agarose untuk
memonitor keberhasilan isolasi RNA.
• 3.Sintesis cDNA dari mRNA melalui
proses RT- PCR.
• 4.Isolasi cDNA dari gel agarose.
Syarat untuk isolasi RNA total:
• 1. Kondisi lingkungan harus bebas dari RNase. • 2. Sampel yang akan diisolasi harus bebas dari
kontaminasi Rnase.
• 3. Alat-alat yang digunakan harus bebas
dariRNase( diautoklaf atau disemprot ethanol 70%).
2. Elektrophoresis RNA murni hasil
• pita mRNA (ditas/dibawah/diantara pita rRNA) •
•
• Pita mRNA diangkat
Nucleic acid Sequencing
(Sekuensing asam inti)
• Pengertian :
• Adalah cara untuk mengetahui atau
mengung kapkan kode-kode genetik dari suatu molekul DNA.
• Macam metode sekuensing:
1 metode Allen Maxam & Walter Gilbert (1977).
Metode Maxam - Gilbert
• 1. Fragmen DNA dimodivikasi dengan ujung yang berbeda:
– a. Diberi ujung G, dengan bantuan enzim dimetil sulfat.
– b. Diberi ujung A & G, dengan bantuan asam formiat.
– c. Diberi ujung C & T, dihidrolisis dengan hidrosin.
– d. Pada sub. C, diberi medium dengan kadar garam tinggi yang akan menghalangi reaksi dengan T sehingga akan terbentuk fragmen dengan ujung C saja.
• 2. FragmenDNA yang akan disequencing dilabel pada ujung 3’
dengan zat radioaktif (P32).
• 3. Kemudian masing –masing fragmen dengan ujung yang
berbeda dimasukkan dalam elektrophoresis:
• a. Sumur I berisi fragmen DNA dengan ujung G
Hasil elektrophoresis Maxam-Gilbert
• G A & G C & T
T
• C • G G • A
• T
Metode Sanger
• Metode ini memanfaatkan kemampuan 2 sifat
dari DNA polimerase (Fragmen Klenow), yaitu:
• 1. Mampu mensintesis DNA dari dNTP
• 2. Ketidak mampuannya untuk membedakan
dNTP dengan ddNTP.
• Catatan:
- dNTP kehilangan oksigen pada OH di C2
pentose
Prosedure sequencing
Sanger
• 1.Empat tabung masing-masing diisi dengan
dATP + ddATP (sedikit); (perband: 50 : 1)
• dCTP + ddCTP “ • dGTP + dd GTP “ • dTTP + ddTTP, “
• Dengan demikian pada masing-masing
tabung yang berisi DNA dengan ujung sama , akan terjadi reaksi yang akan
Metode Sanger (lanjut)
• Jika yang dirangkai oleh DNA
polimerase adalah dNTP, maka akan terbentuk rangkaian DNA .
• Jika yang dirangkai oleh DNA
polimerase adalah ddNTP maka akan menjadi terminal dan proses
Metode Sanger (lanjut)
• Berdasarkan pemikiran tersebut diatas , maka metode sequencing menurut Sanger dapat dilakukan pada 4 tabung reaksi yang
terpisah, yang masing-masing mengandung :
• 1. dATP + ddATP (sedikit)
• 2. dCTP + ddCTP (sedikit)
• 3. dGTP + ddGTP (sedikit)
• 4. dTTP + ddTTP (sedikit)
• Dengan cara tersebut diatas maka pada tiap tabung akan
dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang panjangnya tidak sama , tetapi pada ujung 3’ dari tiap fragmen DNA mengan dung basa –N yang sama
• Selanjutnya dilakukan pemisahan dengan elektrophoresis dengan gel poliakrilamit, sehingga terdapat pemisahan fragmen-fragmen DNA dari tiap tabung.
• Contoh :
• 1.Pada tabung satu ada empat fragmen DNA dengan ujung A
• 2. pada tabung dua ada dua fragmen DNA dengan ujung C
• 3. Pada tabung tiga ada empat fragmen DNA dengan ujung G
Penyusunan
fragmen-fragmen DNA
• Setelah diketahui hasil pemisahan
berdasar kan ukuran fragmen DNA pada gel poliakrilami de, lalu dilakukan
pengurutan fragmen mulai dari yang
paling pendek dan berakir pada fragmen yang paling panjang.
• Hasil penyusunan fragmen-fragmen itu
meru pakan hasil sequencing.
• Adapun struktur DNA yang dicari adalah
KUIS
• 1. Apakah beda PCR dengan RT-PCR
• 2. Apakah tujuan dilakukan RT-PCR?
3. Bagaimanakah cara memperoleh template asam inti utuk RT-PCR
Mutasi
• Pengertian :
• - Mutasi adalah perubahan materi genetik yang
memberi bentuk alternative pada tiap gene.
• Beberapa keuntungan akibat mutasi bagi organisme: • 1. dapat beradaptasi terhadap lingkungan
• 2. memungkinkan terjadinya diversitas genetik dalam
populasi.
• 3. mencegah terjadinya kepunahan bagi suatu jenis
organisme.
• 4. dapat memperbaiki sifat dari suatu jenis organisme.
• Beberapa kerugian akibat mutasi:
• 1. dapat menimbulkan kelainan-kelainan akibat mutasi
• A. Mutasi gene :
>karena adanya perubahan struktur gene.
• B. Mutasi chromosome:
>mutasi yang disebabkan oleh
adanya perubahan struktur,
ukuran , atau jumlah chromosome.
A. Mutasi gene
• Sebab terjadinya mutasi
• A. 1 Faktor fsis ( sinar, suhu, dsb)
• 2. Faktor kimia ( cholkisin, zat antibiotik, dsb).
• B. Mekanisme mutasi dapat terjadi karena:
1. adanya kesalahan saat terjadi replikasi DNA 2. hilangnya basa-N pada gene (delisi)
3. tambahan /sisipan basa-N pada gene (insersi).
4. penggantian basa-N pada gene /DNA (substitusi) 5. adanya perubahan struktur basa–N pada gene
Macam mutasi gene
• 1. Point mutation;
– karena perubahan salah satu basa-N pada gen – a. Missense mutation
– b.Nonesense mutation.
– c. Samesense mutation. (Silent mutation)
2. Frameshift mutation;
* Mutasi akibat insersi atau delisi suatu basa-N pada suatu gene sehingga menyebabkan berubahnya seluruh kodon pada
rangkaian nukleotida berikutnya.
3. Tautomeri mutation;
Point mutation
• a. Missense mutation:
– Mutasi akibat terjadinya penggantian (substitusi) satu basa-N pada kodon, sehingga menyebabkan terjadinya perubahan kodon dan perubahan polipeptida yang
dihasilkan.
– Hb.S pada penderita Sickle Cell Anaemia
– 1 2 3 4 5 6 7
– Val – His - Leu - Thr – Pro - Val - Glu
Sifat-sifat Sickle cell anaemia (Hb.S)
• 1. Eritrosit mudah pecah
• 2. eritrosit tidak mudah bergerak
dalam kapiler darah.
• 3. Afnitas Hb terhadap oksigen
rendah, sehingga penderita
mengalami gejala seperti penderita anaemia.
• 4. Eritrosit berbentuk cresent ( sickle
= sabit)
b. Nonsense mutation
• Mutasi yang disebabkan adanya substitusi basa-N
yang menyebabkan terbentuknya kodon terminasi (UAG, UGA atau UAA), sehingga pada saat proses
translasi akan dihasilkan protein yang pendek.
• Akibatnya protein tidak berfungsi dan kehilangan sifat
biologisnya.
• Contoh:
• Varian β globin, yang dikenal sebagai Mc.Kees
c. Samesense mutation (Silent mutation:
• Mutasi yang menyebabkan terjadinya
perubahan basa-N pada kodon, tetapi tidak merubah janis asam amino yang dikode.
• Contoh:
• Perubahan kodon GGA akibat
substitusi menja di kodon GGC tidak akan merubah jenis asam amino
2.
Frameshift mutation
• Mutasi yang disebabkan oleh adanya insersi(sisipan) atau hilangnya(delisi) basa dari suatu kodon yang mengakibatkan berubahnya seluruh kodon pada rangkaian berikutnya.
• Contoh:
• Pada varian α globin abnormal : (terjadi delisi) yang dikenal sebagai Hb. Wayne I
• No.kodon 138 139 140 141 142 147
• Normal UCC AAA UAC CGU UAA -
• Ser Lys Tyr Arg stop
• Mutasi UCC AAU ACC GUU AAG UAA
3. Mutasi akibat Tautomeri
• Tautomeriadalah berpindahnya atom H
pada basa –N secara spontan ,sehingga menyebab kan terbentuknya isomer dari basa-N tersebut.
• Adenine dan Cytosine dari struktur amino
dapat berubah menjadi struktur imino (sebagai isomernya)
• Guanine dan Thymine dari struktur keto
Perubahan
Mutasi (lanjut)
• Struktur imino dari Adenosine dapat
berikatan dengan struktur amino dari Cytosine.
• Struktur imino dari Cytosine dapat
berikatan dengan struktur amino dari Adenine.
• Struktur enol dari Guanine dapat
berikatan dengan struktur keto dari Thymine.
• Struktur enol dari Thymine dapat
Mutasi chromosome (lanjut)
• 2. Mutasi karena perubahan struktur chromosome. – a. Inversi ( pembalikan gene ) pada chromosome.
– b. Translokasi (berpindah lokasi): gene berpindah lokasi
pada chromosome yang sama maupun chromosome yang berbeda.(yang homologe maupun tak
homologe).
– C. Insersi (tambahan gene pada chromosome)
3. Mutasi karena perubahan jumlah chromosome. Peristiwa ini dapat terjadi karena peristiwa non
disjunction.
Peristiwa ini dapat berupa monoploidi (N), Triploidi (2N +1) atau poliploidi ( untuk 3 N ke atas)
Mutasi Perubahan jumlah gonosome
• a. Mutasi karena perubahan jumlah gonosome – 1. Turner syndrome,
• Monosomi sex chromosome X pada wanita,
sehingga jumlah chromosomenya 44. X0 = (45).
• Sifat penderita ini adalah :
* Ovarium rudimenter * mandul
2. Kleinefelter Syndrome,
Trisomi pada gonosome laki-laki dengan jumlah chromosome 44 XXY = 47.
* Sifat penderita ini adalah : * Testis tidak tumbuh.
* aspermia * mandul
Mutasi Perubahan Jumlah autosome
• Tambahan jumlah autosome
• 1. Edward Syndrom :( 2N + 1) -> 47. XX atau
• 47. XY, trisomi , pada autosome no. 16, 17 , atau no. 18.
• 2. Patau Syndrome : (2N +1) -> 47.XX atau
47.XY, trisomi pada autosome no. 13, 14, atau no.15. ( jarang terjadi
• 3. Down Syndrome : (2N + 1) -> 47.XX atau 47.XY
• trisomi pada autosome No. 21
Perubahan jumlah chromosome (lanjut)
• b. Perubahan jumlah autosome:
1. Edward Syndrome : ( 2N + 1),
Pada chromosome no. 16, 17 , atau 18.
– Ciri-ciri:
* tengkorak lonjong,
* dada pendek dan lebar, * telinga rendah
2. Patau Syndrome
• Ciri-ciri:
* kepala kecil * mata kecil
* telinga rendah dan buruk.
* Sumbing dan bercelah pada langit-langit
* polidaktili
3. Down Syndrome
• Ciri – ciri:
* mata sipit danbiasanya juling. * tubuh pendek
* kaki pendek
* Kepala agak bundar
* bibir tebal dan agak menggelambir; * mulut suka menganga
* leher pendek dan besar. * telinga kecil
* telapak tangan gemuk dan pendek. * jari kelingking bengkok ke dalam . * gigi tak teratur
* kulit kasar dan kering * otak kecil
Fragile-X syndrome
• Mutasi pada X chromosome dengan sisipan berulang(insersi) trinukleotida (CGG) pada gene FMRI.
• > emosi tidak terkendali
• > muka lonjong
• > kaki fat
• > laki-laki seperti perempuan dengan muka lomjong.
• Catatan :
• Normal dengan : 6 – 54 CGG
• Premutasi dengan : 54 – 200 CGG
