UJI STABILITAS PRODUK NUKLEOTIDA BERTANDA [Y-
32P]ATP
DALAM PROTOTYPE PACKAGING
Wira Y Rahman
1, Endang Sarmini, Herlina, Triyanto, Hambali
1Pusat Teknologi Radioisotop dan Radiofarmaka (PTRR) - BATAN)
Gd 11 Kawasan PUSPIPTEK Serpong
Email: [email protected]
ABSTRAK
UJI STABILITAS PRODUK NUKLEOTIDA BERTANDA [γ-32
P]ATP DALAM PROTOTYPE PACKAGING. Dalam perkembangan biologi molekul, radionuklida dalam bentuk senyawa bertanda telah digunakan sebagai perunut deoxyribonucleic acid (DNA)/ribonucleic acid (RNA) untuk mendalami berbagai macam proses fisiologi dan patologi. Salah satu senyawa nukleotida bertanda fosfor-32 (32P) adalah [γ-32 P]-adenosine triphosphate {[γ-32P]-ATP} yang banyak digunakan dalam penelitian biologi molekul. Senyawa nukleotida bertanda [-32P]-ATP disintesis melalui reaksi enzimatis menggunakan H332PO4 dengan prekursor DL-glyceraldehyde 3-phosphate, adenosine di-phosphate (ADP) serta enzim glyseraldehid 3-phosphat dehydrogenase, 3-phosphogliserat posphokinase dan laktat dehidrogenase. Hasil sintesis tersebut perlu dilakukan uji stabilitas untuk mengetahui kondisi penyimpanan yang baik sehingga senyawa nukleotida bertanda [-32P]ATP tetap stabil serta aman dalam penyimpanannya. Pengujian dilakukan dengan mencuplik nukleotida bertanda [-32P]-ATP pada selang waktu tertentu, kemudian dianalisis menggunakan KLT PEI selulosa sebagai fasa diam dan larutan KH2PO4 0,5 M pH 3,5 sebagai fasa gerak. Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat kestabilan nukleotida bertanda [-32P]-ATP yang disimpan dalam prototype packaging dengan temperatur penyimpanan 2 - 8°C dan besarnya paparan radiasi diluar prototype packaging. Hasil uji stabilitas tersebut senyawa nukleotida bertanda [-32P]-ATP tetap stabil pada temperatur penyimpanan 2 - 8°C, selama 25 hari penyimpanan dan paparan diluar prototype packaging sebesar 2,94 µSv.
Kata kunci: reaksi enzimatis, uji stabilitas, prototype packaging
ABSTRACT
STABILITY TEST FOR NUCLEOTIDE MARKED WITH [Γ-32P]ATP STORED IN IT’S PROTOTYPE PACKAGING. In a development of molecular biology radionuclides in form of radiolabeled compounds have been widely used as deoxyribonucleic acid (DNA))/ribonucleic acid (RNA) tracer in order to explore a wide range of physiological and pathological processes. One of such nucleotide compoundsof phosphorus-32 (32P) is [γ-32P]-adenosine triphosphate {[γ-32P]-ATP} which has been widely used in the biotechnology research. Labelled nucleotide [γ-32P]ATP is synthesized using H3
32
PO4, with precursors of
DL-glyceral-dehide 3-phosphate, adenosine di-phosphate (ADP), and enzymes of glyceralDL-glyceral-dehide 3-phosphate dehydrogenase, 3-phosphoglycerate phosphokinase and lactate dehydrogenase. The stability test is imposed on the labelled nucleotide [γ-32P]ATP in order to study the best storage conditions that keeps the compound being stable and safe in its storage. The test was conducted by sampling of the nucleotide compound at specific intervals, and then analized by chromatography method using PEI cellulose as stationary phase and KH3PO4 0,5 M pH 3,5 as mobile phase. In this research, we observed the stability of labelled nucleotide [γ-32P]ATP which stored in it’s prototype packaging, with storage temperature about 2 – 8 0C, at the same time
we observed the radiation dose on the surface of the prototype packaging. The test result proved that the labelled nucleotide [γ-32P]ATP is stable for 25 days, if stored at 2 – 8 0C, and radiation dose on the surface of packaging is 2,94 μSv.
Key words: enzymatic reaction, stability test, prototype packaging
PENDAHULUAN
Radioisotop 32P merupakan radioisotop
pemancar β
dengan energi 1,71 MeV (Emax)
dan 0,6949 MeV (Eav), mempunyai waktu
paruh 14,26 hari. Radioisotop 32P dibuat dari
reaksi nuklir 32S(n,p)32P dengan menggunakan
sulfur alam sebagai bahan utamanya.
Pemanfaatan radioisotop 32P sudah sangat luas
baik untuk kesehatan, pertanian maupun di bidang biologi molekul. Dalam bidang kesehatan saat ini digunakan untuk terapi keloid, yaitu menghilangkan jaringan parut
yang terdapat pada permukaan kulit.
Radioisotop 32P digunakan dalam bidang
biologi molekul sebagai tracer atau pelacak pada DNA, dalam bidang patalogi untuk menentukan subtipe dari virus HPV, resistensi kuman tuberculosis terhadap rifampicyn, screening sampel darah apakah terkontaminasi HIV atau HCV. Sementara dalam bidang pertanian digunakan untuk melihat pergerakan pupuk dalam tumbuhan, sehingga pemupukan bisa lebih efisien[1,2,3,4].
Pada saat ini PTRR telah dapat membuat nukleotida rantai pendek ATP
bertanda radioaktif 32P, yaitu [γ-32P]ATP.
Proses sintesis nukleotida bertanda 32P dimulai
dari DL-gliseraldehid 3-fosfat, yang bereaksi
dengan asam fosfat (H3
32
PO4) menghasilkan
1,3–disfosfogliseraldehid. Senyawa
1,3-difosfogliseraldehid berubah menjadi asam 1,3-difosfogliserat dengan bantuan enzim gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase, kofaktor
ion Mg2+ serta koenzim NAD+ serta enzim
laktat dehidrogenase sabagai katalisator
Selama reaksi berlangsung molekul NAD+
akan berubah menjadi NADH. Senyawa 1.difosfogliserat akan berubah menjadi 3-fosfogliserat dengan bantuan enzim fosfo-gliserat kinase, pada saat yang bersamaan akan terjadi perpindahan gugus fosfat radioaktif ke
ADP membentuk AT32P, [γ-32P]ATP [3,4,5].
Pemisahan hasil sintesis dilakukan secara kromatografi kolom dengan menggunakan resin DEAE Sephadex yang telah dikondisikan
dengan 0,01 M Amonium bikarbonat
(NH4HCO3) dan larutan pengelusi NH4HCO3
dengan beberapa variasi konsentrasi[5,6,7,8]. Produk hasil sintesis ini perlu adanya kendali kualitas terhadap mutu produk, diantaranya kondisi penyimpanan yang aman
dan stabilitas produk dalam ruang
penyimpanan. Hal ini dilakukan untuk melihat
apakah ada proses penguraian [γ-32P]ATP
selama proses penyimpanan. Selain itu perlu
dilihat paparan radiasi dari radioisotop 32P
yang ditimbulkan dapat menembus bahan acrylic dan Pb. Sehingga bisa diketahui apakah
[γ-32P]ATP selama proses penyimpanan terurai
atau tidak dan prototype packaging yang digunakan untuk penyimpanan cukup aman untuk lingkungan disekitarnya [9,10].
Tujuan penelitian ini adalah melihat
kestabilan nukleotida bertanda [γ32P]ATP
selama penyimpanan pada temperatur 2 - 8°C dengan mencuplik pada waktu tertentu. Hasil cuplikan di analisa menggunakan KLT PEI Cellulose sebagai fasa diam dan larutan
KH2PO4 sebagai fasa gerak. Pada temperatur
penyimpanan tersebut diharapkan produk tetap stabil, sehingga pada saat digunakan nukleotida
bertanda [γ-32P]ATP tetap pada kondisi terbaik.
METODOLOGI
Bahan dan Alat yang Digunakan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah nukleotida bertanda
[γ-32
P]ATP hasil sintesis, kromatografi lapisan tipis (KLT) plastik polyethyleneimine (PEI) cellulose, KH2PO4 dari E.Merck.
Peralatan yang digunakan yaitu
prototipe packaging dari acrilyc dan Pb, Mini TLC Scanner (Bioscan AR-2000), survey meter Radiagem Canberra.
Cara Kerja
Nukleotida bertanda [γ-32
P]ATP hasil sintesis dikemas dan disimpan dalam prototype packaging (Gambar 1) pada temperatur 2-8°C, dan pada selang waktu tertentu dicuplik kemudian dianalisis kestabilannya dengan menggunakan KLT PEI Cellulose sebagai fasa
diam dan larutan KH2PO4 pH 3,5 sebagai fasa
gerak. Visualisasi radiokromatogram meng
-gunakan autoradiografi scanner.
Gambar 1. Prototype packaging yang digunakan sebagai penyimpan nukleotida bertanda
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebelum dilakukan uji stabilitas hasil sintesis senyawa nukleotida bertanda
[γ-32
P]ATP perlu diketahui kondisi awalnya terlebih dahulu. Hasil sintesis nukleotida
bertanda [γ-32P]ATP dianalisis kemurnian
radiokimianya menggunakan KLT PEI
Cellulose sebagai fasa diam dan KH2PO4 0,5
M pH 3,5 sebagai fasa gerak, kemudian ditentukan Rf-nya dengan Bioscanner. Hasil analisa diperoleh radiokromatogram seperti pada Gambar 2. Dari radiokromatogram terlihat kemurnian radiokimia nukleotida
bertanda [γ-32P]ATP sebesar 99,33 % dengan
Rf 0,212 (Rgn 1).
Gambar 2 Radiokromatogram nukleotida bertanda [γ-32P]ATP hasil sintesis
Nukleotida bertanda [γ-32P]ATP ini
kemudian disimpan di dalam lemari pendingin pada temperatur 2-8°C. Pada hari ke-5, 20 dan 25 dicuplik dan dianalisis untuk dilihat kestabilannya selama penyimpanan. Hasil analisa tersebut dapat dilihat pada Gambar 3 sebagai berikut :
Gambar 3. Hasil uji kestabilan nukleotida bertanda [γ-32P]ATP yang disimpan dalam prototype packaging pada temperatur 2-8°C
Dari pengamatan tersebut terlihat
bahwa nukloetida bertanda [γ-32P]ATP yang
disimpan dalam prototype packaging pada temperatur 2 - 8°C tetap stabil sampai hari ke-20 dan mulai turun sedikit kemurniannya pada hari ke-25, setelah dua kali waktu peluruhan
32
P (T½ = 14,3 hari). Ini mengindikasikan produk tetap stabil jika disimpan pada temperatur tersebut. Jika produk tidak stabil dapat diketahui dari hasil gramnya seperti terlihat pada
radiokromato-gram Gambar 4 dengan berkurangnya
kemurnian nukleotida bertanda [γ-32P]ATP
(78,44%) Rf 0,248 (Rgn 1) dan terlepasnya 32P
dari [γ-32P]ATP (21,56%) Rf 0,617 (Rgn 2).
Gambar 4. Radiokromatogram dari nukleotida bertanda [γ-32P]ATP yang tidak stabil
Dengan terlepasnya 32P dari nukleotida
bertanda [γ-32P]ATP menunjukkan bahwa
produk telah mulai rusak, terurai perlahan-lahan dan sudah tidak layak untuk digunakan. Sedangkan hasil pengukuran paparan setelah disimpan dalam prototype packaging dapat dilihat pada Gambar 5. berikut :
Gambar 5. Pengukuran paparan nukleotida bertanda [γ-32P]ATP dalam prototype packaging
Prototype packaging dirancang
menggunakan dua kontainer, yang pertama kontainer berbahan acrylic dan yang kedua ____________________________________________________________________________________________________________________
berbahan Pb seperti pada Gambar 1. Sebelum dimasukkan ke dalam kontainer acrylic
paparannya sebesar 6,60 µSv. Setelah
dimasukkan ke dalam kontainer acrylic diukur paparan menggunakan survey meter Radiagem Canberra terukur sebesar 3,80 µSv. Hal ini disebabkan karena bahan acrylic merupakan bahan dengan nomor atom yang lebih ringan dari nomor atom Pb. Bahan acrylic ini
digunakan untuk mengurangi efek
bremsstrahlung yang dihasilkan jika elektron berenergi tinggi menumbuk target logam
(kontainer Pb). Radioisotop 32P adalah
pemancar β
dengan energi 1,71 MeV (Emax)
dan 0,6949 MeV (Eav), dengan energi partikel
β
yang lebih besar akan menghasilkan radiasi bremsstrahlung yang lebih besar. Sedangkan, apabila semakin besar nomor atom bahan penyerap (semakin berat) akan menghasilkan radiasi sinar-X yang lebih besar. Ketika elektron berenergi tinggi itu menumbuk target logam dalam hal ini Pb, terjadi pengereman elektron baik secara tiba-tiba ataupun perlahan
yang akan menghasilkan sinar
X-bremsstrahlung, yang mempunyai energi maksimal sama dengan energi kinetik elektron 0,5 MeV. Sehingga akan terjadi peningkatan
energi yang mengakibatkan paparan
radioisotop 32P menjadi bertambah besar.
Dengan demikian, digunakannya kontainer acrylic dapat mengurangi efek bremsstrahlung tersebut. Hasil pengukuran nukleotida bertanda [γ-32
P]ATP setelah dimasukkan ke dalam kontainer acrilyc ditampilkan pada Gambar 5. Pada gambar ini diperoleh pengukuran pada prototype packaging sebesar 2,94 µSv. Hal ini menunjukkan bahwa kontainer acrylic sangat berpengaruh mengurangi efek bremsstrahlung. Sehingga paparan diluar prototype packaging dapat memenuhi persyaratan yang diizinkan yaitu 0,05 mSv.
Kemudian kontainer acrylic tersebut dimasukkan ke dalam prototype packaging Pb dan diukur paparannya. Hasil pengukuran paparan di luar prototype packaging Pb sebesar 2,94 µSv termasuk kategori aman untuk penyimpanan dan lingkungan, seperti terlihat
pada Gambar 5. Sesuai dengan yang
persyaratan yang diijinkan bahwa paparan di luar prototype packaging < 0,05 mSv.
KESIMPULAN
Dari uji kestabilan terlihat bahwa
senyawa nukleotida bertanda [γ-32P]ATP yang
disimpan dalam prototype packaging pada temperatur 2-8°C tetap stabil sampai hari ke
25, atau selama dua kali waktu paruh 32P (T½
= 14,3 hari) dan paparan diluar prototype packaging sebesar 2,94 µSv, termasuk kategori aman untuk penyimpanan dan lingkungan. DAFTAR PUSTAKA
1. IAEA TECDOC 1340, “Manual for Reactor Produced Radioisotopes”, IAEA January 2003.
2. Wira Y Rahman, Endang Sarmini, Herlina,
Abidin, Triyanto Dan Hambali,
“Pembuatan Radioisotop Fosfor-32 untuk
Sintesa ATP Bertanda 32P ([γ-32P]ATP)”,
Prosiding Seminar Nasional Penelitian dan
Pengelolaan Perangkat Nuklir 2012,
Yogyakarta
3. Sinta Sasika Novel, Ratu Safitri, Sri
Hartini Harijanto, Sukma Nusantara,
“Perbandingan Beberapa Metode
Molekuler dalam Uji DNA HPV (Human Papillomavirus)”, CDK 186/Vol. 38 No. 5/Juli-Agustus 2011.
4. Maria Lina R, Budiman Bela dan Andi Yasmon, Deteksi Mutasi Gen KATG
(MyobacteriumTuberculosis) dengan
Metode PCR (Polymerase Chain Reaction) Hibridisasi Dot Blot menggunakan Pelacak
Oligonukleotida Bertanda 32P, Jurnal
Aplikasi Isotop dan Radiasi, 2000.
5. F. Sakamoto, M. Izumo, K. Hashimoto, Y. Fuji, “Study of Optimum Condition for
Synthesis of [-32P]ATP with High
Specivic Radioactivity”, Journal of
Radioanalytical and Nuclear Chemistry, Vol. 239, No.2 (1999) 423-427.
6. Paul F. Schendel And Robert D. Wells,
“The Synthetic and Purification of [-32P]
Adenosine Triphosphate with High
Specific Activity”, The Journal of Biology Chemistry, Vol. 248, No. 23, Issue of December 10.
7. Wira Y Rahman, Endang Sarmini, Herlina, Abidin, Triyanto, Hambali, Abdul Mutalib
Dan Santi Nurbaiti “ Sintesa ATP Bertanda P-32 sebagai Perunut Biologi Molekul”,
Pertemuan Ilmiah Radioisotop,
Radiofarmaka dan Siklotron, 2010.
8. Wira Y. Rahman, Rohadi Awaludin, Endang Sarmini, Herlina, Triyanto, Rien Ritawidya, Abdul Mutalib & Santi Nurbaiti, A Modified Method for Synthesis
of [γ-32
P] Labelled Adenosine
Triphosphate, J Radioanal Nucl Chem, DOI 10.1007/s10967-014-3835-1, Vol.302 No. 3, Desember 2014.
9. PUSDIKLAT BATAN, “Dasar Fisika Radiasi”, Diklat Petugas Proteksi Radiasi. 10. Ayu Puspita Pradani, Bunawas, Johan A.E
Noor, Pengukuran Spektrum Dan Paparan Bremsstrahlung Dari Sumber Standar Beta
Sr-90/Y-90 Dan Kr-85,
http://www.e- jurnal.com/2015/03/pengukuran-spektrum-dan-paparan.html
TANYA JAWAB Pertanyaan
1. Apa kriteria stabil
2. Mengapa ketika tidak stabil P32 terpisah dari bahan AT?
Jawaban
1. Kriteria stabil adalah terlihat dari kemurnian radiokimia (gamma P-32) ATP > 95%. Ketika tidak stabil P32 terpisah dari bahan ATP.
2. Karena sudah terbentuknya P32 yang mengikat ADP, sehingga mengurangi kemurnian radionuklika P32 ATP. ____________________________________________________________________________________________________________________
![Gambar 2 Radiokromatogram nukleotida bertanda [γ- 32 P]ATP hasil sintesis](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123dok/4262446.3133907/3.892.124.790.117.1094/gambar-radiokromatogram-nukleotida-bertanda-γ-atp-hasil-sintesis.webp)
