Tinjauan Umum Spons
Spons (filum Porifera) adalah hewan multisellular (Metazoa) yang paling tua dan mempunyai struktur yang sangat sederhana. Susunan pada struktur spons tidak sama dengan filum yang lainnya, morfologi spons sangat mempengaruhi aspek biologi spons itu sendiri termasuk interaksinya dengan mikroorganisme (Simpson 1984).
Susunan sel-sel spons berbeda pada setiap lapisan strukturnya. Pada permukaan paling luar, atau yang biasa disebut dengan pinacoderm, dibentuk oleh sel-sel epitel yang disebut sebagai pinacocyte. Pori-pori (ostia) pada permukaan luar merupakan saluran yang menembus sampai pada bagian kanal interior. Bagian dalam spons, terdapat sebuah sel-sel berflagella (choanocyte) yang berasal dari sebuah ruang yang disusun oleh choanoderm dimana makanan disimpan. Flagel dari choanocyte akan bergerak untuk memompa air yang akan masuk melalui ostia, choanosyte juga akan menyaring keluar partikel-partikel makanan (termasuk bakteri dan mikroalga) dari air dan akan ditransfer ke mesohyl yang merupakan perluasan lapisan yang berhubungan dengan jaringan. Di dalam mesohyl partikel makanan akan dicerna dengan phagositosis oleh sel-sel spons lainnya yang disebut archaeosyte. Sel-sel totipotensi yang dapat berdiferensiasi menjadi tipe sel spons yang baru juga berada pada mesohyl yang padat dengan komunitas mikroorganisme. Setiapkali choanocyte menyaring air yang masuk, maka air juga akan dikeluarkan dari spons melalui osculum, diperkirakan lebih dari 24.000 liter air yang dipompakan oleh 1 kg spons perhari (Castro & Huber 2005).
Pertumbuhan spons juga memiliki tipe yang bermacam-macam dengan warna-warna yang menarik, seperti tipe encrusting, bercabang, cup dan massive dengan ukuran yang hanya beberapa millimeter hingga yang memiliki diameter lebih dari satu meter. Konstruksi struktur spons dibentuk oleh silika dan spikula kalkareus, komponen ini seringkali dibuat sebagai bahan dalam penyusunan taksonominya. Selain spikula dan silika, jaringan kolagen seperti spongin juga
memengang peranan dalam menyokong struktur pada spons (Castro & Huber 2005).
Spons yang berwarna orange cerah yaitu Jaspis johnstoni adalah spons dengan struktur yang rapuh, lembut dan padat. Spons ini dapat dijumpai pada permukaan karang sehingga dengan mudah dapat dikonsumsi oleh predator. Spons ini mempunyai kandungan senyawa bioaktif yang dapat membunuh predator, hasil penelitian Vanderloos (1997) mengidentifikasi senyawa tersebut adalah Jasplakinolide yang dapat menghambat pertumbuhan sel-sel kanker.
Asosiasi Spons dengan Bakteri
Interaksi antara spons dan bakteri terjadi dalam banyak bentuk. Untuk spons, mikroba yang berbeda dapat diartikan sebagai sumber makanan, patogen/parasit atau sebagai simbion mutualisme. Bakteri yang berasosiasi dengan spons dapat mencapai 40% dari jaringan spons dengan kepadatan 109sel bakteri per ml jaringan spons (Hofman et al. 2005). Berdasarkan sekuen 16S rRNA dan Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) hasil sensus oleh Taylor et al. (2007), bakteri yang berassosiasi dengan spons antara lain adalah Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroides, Chloroflexi, Cyanobacteria, Deinococcus-Thermus, Firmicutes, Gemmatimonadetes, Nitrospira, Planctomycetes, Poribacteria, Proteobacteria, Sphirochaetes dan Verrucomicrobia.
Sangat jelas keuntungan yang diperoleh spons dari sistem metabolisme simbionnya yaitu bakteri dan mikroba lainnya. Fotosintesis dan fiksasi nitrogen yang dilakukan oleh cyanobakteri kiranya merupakan faktor kunci mengapa spons dapat bertahan dalam kondisi lingkungan peraiaran yang miskin nutrisi (Ariilo et al. 1993). Seperti yang diungkapkan oleh Hoffman et al. (2006), yang menjelaskan bahwa bakteri anaerobik dapat mentransfer asam karboksilat pada spons Geodia baretti. Bakteri metanotropik dapat mensuplemen nutrisi pada spons tanpa proses filter feeding dalam habitat laut yang kaya akan metan (Facelet et al. 1995). Namun, mikroba simbion dapat pula dikonsumsi oleh spons, ini dilaporkan pertamakali pada awal 1970-an, bahwa simbion cyanobakteri ditemukan pada bagian intra dan ekstraseluler dari spons Synecoccus spp. (kelompok Cyanobakteria) juga dijumpai pada sel mesohyl dan bagian sel-sel
tertentu dari spons Ircinia virabilis asal Mediterania, yang merupakan sebuah sumber fotosintesis dan pemfiksasi karbon bagi spons (Yahel et al. 2006).
Bentuk asosiasi mikroba juga memberikan kontribusi dalam siklus nutrisi bagi kebutuhan spons inangnya. Sumber nutrisi spons berupa mikroalga dan zooplankton terdiri atas berbagai komponen makrokolekul. Mikroalga yang kaya akan karbon dan nitrogen serta zooplankton yang sebagian struktur tubuhnya terdiri atas kitin dapat dengan mudah dipecah oleh bakteri-bakteri pengahsil enzim protease dan kitinase sehingga menjadi molekul yang lebih kecil (Reiswig 1975). Keuntungan lain yang diperoleh oleh spons dari simbionnya yaitu bakteri adalah penambahan struktur yang lebih kaku akibat produksi mukus yang dihasilkan oleh mikroba. Dalam beberapa kasus senyawa-senyawa yang dihasilkan oleh mikroba simbion potensial digunakan sebagai prekusor untuk metabolisme biosintesis pertahanan spons dari patogen dan predator lainnya.
Penelitian tentang interaksi antara spons dan mikroorganisme, menunjukkan bahwa suatu mikroorganisme akan berasosiasi pada spesies spons tertentu. Hal ini telah dibuktikan melalui pengamatan dengan mikroskop maupun analisa genetik dan studi kultur yang bertujuan untuk isolasi antibiotik dari bakteri yang berasosiasi dengan spons yang berbeda-beda. Suberitas domuncula, misalnya menunjukkan hanya sedikit bakteri yang tampak pada bagian permukaan dalamnya, sementara spons Halichondria panicea dan Ircinia fascikulata menunjukkan bakteri yang berlimpah dengan variasi yang bermacam-macam. Ini dapat dilihat dengan mikroskop elektron yang juga menggambarkan tingginya keanekaragaman isolat bakteri dari spons-spons ini (Imhoff & Stohr 2003).
Spesies spons yang berasosiasi dengan bakteri spesifik dapat ditunjukkan dengan membandingkan komunitas bakteri yang berasosiasi dengan sampel yang berbeda dari spons Mediteranian yaitu Chondrilla nucula dari laut Adriatic dan laut Liguria. Sekuen DNA klon yang identik ditemukan dalam sampel spons dari lokasi yang berbeda. Menariknya, spons Thetya aurantium menunjukkan dua komunitas bakteri yang diperlihatkan dengan bentuk morfologi yang berbeda dari bagian eksterior dan interior sel, yang dapat dilihat dengan mikroskopik dan diperjelas dengan DGGE dan percobaan cloning gen 16S rRNA. Penemuan ini mendukung asumsi bahwa setidaknya bakteri yang ditemukan pada spons tertentu
adalah spesies khusus yang berasosiasi dengan kelompok porifera tersebut serta mempunyai bentuk adaptasi sepanjang proses evolusi pada lingkungan dimana spons berada (Imhoff & Stohr 2003).
Kesuksesan usaha dalam mengisolasi mikroorganisme penghasil senyawa bioaktif yang bersimbiosis dengan spons tergantung oleh beberapa faktor. Faktor yang paling signifikan yaitu bahwa mikroba dapat melakukan sistem metabolisme yang berbeda-beda tergantung kondisi lingkungannya. Banyak penelitian yang berhasil mengkultur bakteri yang berasal dari spons pada medium-medium yang sebelumnya dicampur dengan ekstrak dari jaringan spons. Meskipun demikian, bakteri yang dapat menghasilkan senyawa bioaktif yang diisolasi jumlahnya cukup rendah yaitu berkisar 0,06; 0,1; 0,15 dan 0,7 % dari total bakteri yang dapat dikultur dari spons Candidaspongia flabellata, Rhopaloides odorabile, Aplysinaaerophoba (Burja et al. 1999; Thoms et al. 2003)
Kebutuhan nutrisi mikroba yang bersimbiosis dengan spons sangat susah untuk dipenuhi bila dikultur dalam laboratorium. Bagaimanapun, ada beberapa bakteri yang dapat diisolasi tetapi sudah tidak dapat memproduksi senyawa-senyawa bioaktif lagi, kemungkinan bakteri-bakteri tersebut mengharuskan adanya perantara sistem metabolisme dari spons sebagai inangnya. Adapula beberapa isolat bakteri yang belum diketahui alasannya berhenti menghasilkan produk-produk senyawa bioaktif setelah dikulturkan beberapa waktu pada media buatan. Ini diduga karena adanya keterlibatan faktor genetik, dimana gen yang menyandikan senyawa bioaktif tersebut hilang karena akibat mutasi atau kehilangan penggerak elemen-elemen genetik yang mensintesis gen-gen tersebut (Proksch et al. 2002).
Potensi Senyawa Bioaktif dari Assosiasi Bakteri dengan Spons
Spons dianggap sebagai organisme yang potensial karena lebih dari 200 senyawa metabolit baru yang ditemukan setiap tahun, dibandingkan dengan organisme laut lainnya. Spons dianggap sebagai salah sumber substansi natural yang paling penting seperti antibiotik, antitumor, aktivitas antiviral, antiplasmodial, dan anti-inflammatory. Ini membuat spons sebagai sumber potensial dari produk baru dunia kedokteran. Bagaimanapun, dalam banyak kasus
hal ini tidak bisa membuktikan apakah sel-sel spons atau bakteri yang berasosiasi memproduksi substansi senyawa bioaktif (Blunt et al. 2006).
Meskipun awalnya penemuan senyawa bioaktif banyak ditemukan sebagai hasil ekstraksi dari jaringan spons tetapi arah penelitian sekarang ini lebih banyak dieksplorasi pada mikroorganisme yang bersimbiosis dengan spons. Hal tersebut lebih menguntungkan dibandingkan dengan mengisolasi dari inangnya (spons). Menurut West et al. (2002), senyawa makrosiklik lactone yaitu Peluruside A yang diisolasi dari demosphongia Mycale hentscheli di perairan New Zaeland menunjukkan potensi sebagai antikanker dan untuk mendapatkan 2 gram Peluruside A murni dibutuhkan 200 kg ekstrak spons, hal ini tentu saja dapat menghabiskan kekayaan laut bumi ini.
Kenyataanya, banyak kasus yang dapat menunjukkan bahwa bakteri yang berasosiasi yang memproduksi kandungan senyawa bioaktif dan bukan inangnya. Chondramide D yang dihasilkan oleh deltaproteobacterium Chondromyces crocatus memperlihatkan rumus struktur yang sama dengan senyawa Jaspamide yang berasal dari ekstrak spons Jaspis sp. (Taylor et al. 2007).
Spons yang bersimbiosis dengan Actinomycetes dari genus Micromonospora menghasilkan Manzamine yaitu alkaloid yang berpotensi sebagai antimalaria. Manzamine pertama diisolasi dari mikroba yang berasal dari spons yang tidak hanya berbeda spesies, tetapi juga secara geografis berbeda. Namun perkembangan sekarang, manzamine yang dihasilkan tidak selalu bergantung pada komunitas atau jenis mikrobanya. Manzamine yang diisolasi di Indonesia dihasilkan oleh bakteri yang bersimbiosis dengan spons 01IND 35 dan 01IND 52 (Naglaa et al. 2004).
Spons Hyatella sp. yang bersimbiosis dengan Vibrio sp. menghasilkan senyawa peptida yang bersifat antibakterial, sementara itu glycoglycerolipid dihasilkan oleh Halichondria panicea yang bersimbiosis dengan Microbacterium sp. yang berpotensi sebagai anti tumor (Miyashiro & Ikegami 1994; Wicke et al. 2000). Menurut Mitova et al. (2003), sebuah senyawa baru yaitu Cyclotetrapeptida dan dihasilkan oleh bakteri Pseudomonas sp. (IM1) yang diisolasi dari sebuah spesimen spons Ircinia muscarum dari teluk Naples (Italia). Hasil penelitianKim et. al., 2006,analisis filogenetik dari sekuen gen ketosynthase
(KS) strain Salinispora sp. (actinobacteria) diindikasikan memiliki sekuen gen polyketide synthase (PKS) yang sama dengan Amycolatopsis mediterranei penghasil Rifamycin B. Strains Salinispora diisolasi dari spons laut Pseudoceratina clavata. Pada penelitian lainnya, beberapa golongan Quinolon memiliki aktivitas antimikrobial dan cytotoksin dari Pseudomonas asosiasi dengan Homophinia sp. yang berasal dari lautan pasifik (Burja et al. 1999). Asosiasi antara spons Aplysina aerophoba dan A. cavernicola yang berada di laut Mediterania dengan 27 isolat bakteri yang belum teridentifikasi, menunjukkan bahwa beberapa isolat tersebut berpotensi untuk menghambat pertumbuhan bakteri-bakteri klinikal yang multiresisten seperti, Staphylococcus aureus dan S. epidermidis (Hentschel et al. 2001).
Arah penelitian yang semakin dikembangkan yaitu berfokus pada produksi substansi antibiotik dari bakteri yang bersimbiosis dengan spons. Bagaimanapun penambahan bakteri resisten menyebabkan beberapa masalah dalam dunia kedokteran dan menguatkan penelitian-penelitian baru untuk mencari kandungan senyawa aktif melawan patogen multiresisten.
Senyawa Antimikrob
Senyawa antimikroba adalah senyawa yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri yang dapat menghambat atau membunuh mikroorganisme lain. Kebanyakan senyawa antimikroba yang telah dipergunakan secara luas dikenal dengan nama antibiotik. Target penting dari antibiotik bakteri adalah ribosom (translasi), dinding sel, membran sitoplasma, proses repilikasi DNA dan transkripsi (Madigan et al. 2006).
Antibiotik yang menghambat sintesis protein pada tahap inisiasi adalah streptomycin sedangkan puromycin, chloramphenicol, cyckloheximide dan tetracyclin pada tahap elongasi. Antibiotik yang berperan pada transkripsi antara lain rifampin dan streptovaricin yang menghambat sintesis RNA yaitu dengan berikatan dengan sub unit β dari RNA polimerase, sedangkan aktinomycin menghambat sintesis RNA dengan menghentikan proses elongasi RNA. Antibiotik β-lactam seperti penicillin dan cephalosporin berpotensi untuk menghambat sintesis dinding sel salah satunya dengan menghasilkan penicillin binding protein (PBPs), (Madigan et al. 2006).
Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA)
Salah satu alternatif untuk mengetahui komposisi komunitas suatu lingkungan yaitu dengan mengembangkan teknik biologi molekular. Teknik ini mencakup penentuan variasi pola pita gen 16S rRNA setelah dipotong dengan beberapa enzim restriksi yang dapat dianalisis pada komunitas prokariot yang dijumpai pada habitat tertentu. Gen 16S rRNA adalah bagian dari DNA prokariot yang dapat ditemukan pada bakteri dan archaea. Gen ini mengkodekan rRNA, dimana rRNA merupakan bagian pembentuk dari ribosom. Huruf ”r” pada rRNA merujuk pada kata ribosomal, sedangkan struktur ribosom terdiri dari dua unit yaitu large subunit (LSU) dan small subunit (SSU). Pada bakteri SSU dikodekan oleh gen 16S rRNA sedangakn LSU dikodekan oleh gen gen 5S rRNA dan 23S rRNA (Snyder & Wendy 2002).
Gen 16S rRNA merupakan gen yang sangat stabil, karena susah temutasi meskipun dalam jangka waktu yang lama. Gen 16S RNA mengandung informasi yang dapat dijadikan sebagai biomarker terhadap suatu bakteri. Gen 16S rRNA terdiri dari daerah konservatif yang dapat dijumpai pada semua organisme dan daerah hypervariabel yang unik pada setiap organisme atau organisme yang memiliki hubungan kekerabatan yang dekat yang dapat digunakan untuk identifikasi (Moyer et al. 1994).
Analisis filogeni dari komunitas mikroba yang menggunakan Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) merupakan sebuah metode sederhana yang didasarkan pada adanya polimorfisme panjang fragmen gen 16S rRNA setelah dipotong dengan enzim restriksi. Istilah polimorfisme adalah hasil pemotongan gen 16S rRNA dari bakteri asal yang berbeda akan memberikan pola fragmen yang berbeda. Panjang fragmen ditentukan melalui proses elektroforesis gel agarose dengan penanda ukuran DNA (DNA marker) sebagai pembanding (Yogiara 2004). Sama halnya hibridisasi dan pelacakan DNA, ARDRA digunakan untuk menganalisis komunitas bakteri pada berbagai lingkungan. Meskipun ARDRA hanya memberikan sedikit atau sama sekali tidak ada informasi mengenai tipe mikroorganisme yang terdapat dalam suatu sampel, namun hasilnya dapat digunakan untuk mengetahui genotip secara cepat atau untuk
membandingkan suatu komunitas mikroorganisme pada kondisi lingkungan yang berbeda.
Pada penelitian Moyer et al. (1994) analisis 16S rRNA menggunakan kombinasi enzim restriksi tetramerik (situs pengenalan 4 basa DNA) untuk menghasilkan suatu pola pita DNA yang emadai sebagai satuan operasional taksonomi (operational taxonomic unit/OTU). Masing-masing OTU akan menjadi ciri dari kelompok 16S rRNA asal bakteri yang hidup dalam komunitas tertentu. Penggunaan enzim restriksi HhaI (isochizomer dengan Hinp1 I), RsaI dan BstUI sebagai enzim yang digunakan dalam studi keragaman mikrob menggunakan ARDRA, karena enzim tersebut dapat menghasilkan pola pita DNA yang relatif lebih beragam.
