ISOLASI DNA TANAMAN
LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER
Oleh:
Litany Hyrra Rorasay
512011018
Fakultas Pertanian dan Bisnis Universitas Kristen Satya Wacana
I. PENDAHULUAN
DNA merupakan materi yang membentuk kromosom-kromosom dan juga merupakan informasi genetik yang tersimpan dalam tubuh makhluk hidup. Informasi genetik ini pada dasarnya merupakan kumpulan instruksi/perintah yang mengatur sel untuk bisa melakukan hal-hal tertentu. DNA singkatan darideoxyribonucleic acid, atau dalam Bahasa Indonesia disebut dengan Asam Deoksiribosa Nukleat atau ADN. Kata deoxyrybo mengacu pada nama gula yang terkandung dalam DNA, yaitu deoxyrybose (deoksiribosa) (Tohib, 2012).
Susunan kimia DNA adalah polimer berupa rantai panjang dari nukleotida. Perlu Kamu ingat bahwa satu nukleotida terdiri dari satu gugus fosfat, satu komponen gula pentosa (5-karbon), dan satu basa nitrogen. Satu-satunya pembeda tiap nukleotida ialah basa nitrogen. Hanya ada 4 kemungkinan basa yang terdapat pada tiap satu nukloetida DNA, yaitu adenine (A), guanine (G), thymine (T), ataucytosine (C). Variasi urutan dari keempat basa-basa tersebut membentuk suatu kode genetik pada sel. Mungkin hal ini dirasa aneh, hanya dengan 4 huruf yang terdapat pada DNA, suatu informasi genetik yang berbeda-beda dapat diwariskan pada keturunan makhluk hidup. Itu sebenarnya wajar saja, karena pada kromosom terdapat berjuta-juta nukleotida, maka sangat banyak kombinasi yang berbeda meskipun hanya berasal dari 4 huruf tersebut. James Watson dan Francis Crick memenangkan Nobel di tahun 1962 mengenai model penyatuan sturktur DNA. Bersama dengan Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins, mereka menyatakan bahwa struktur DNA merupakan dua untaian nukleotida yang disebut dengan double helix, dimana untaian tersebut tersusun secara spiral dengan posisi gula dan gugus fosfat terletak di sisi luar dan basa-basa nitrogen saling berpasangan di sisi dalam (menyambung kedua untaian tersebut).
DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.
Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit (Albert, 1994). Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.
II. TUJUAN
Tujuan melakukan praktkum biologi molekuler dengan pembahasan isolasi DNA
tanaman adalah untuk:
1. Mengetahui prinsip kerja dan terampil mekakukan isolasi DNA beberapa tanaman menggunakan metode yang dikembangkan oleh Doyle dan Doyle (1987) 2. Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi kuantitas dan kualitas DNA hasil isolasi.
III. ALAT DAN BAHAN A. ALAT
1. Mortar dan pestle
2. Microtube 2 dan 1,5 ml
4. Microtip
5. Waterbath
6. Icebath
7. Refrigrated centrifuge
8. Botol pereaksi
9. Gunting
10. Timbangan analitis
B. BAHAN
1. Daun jenis 3 tanaman yang sudah dibekukan dalam freezer selama 24 jam dan daun tanaman yang segar sebanyak 200 mg
2. Larutan buffer pengekstrak CTAB 20 ml
3. Larutan khloroform : isoamil Alkohol (24:1) (v/v)
4. Isopropanol (2-propanol)
5. Na-asetat 3M (pH 5,2)
6. Etanol 70% dingin
7. Larutan buffer TE (50 ml) (pH 8.0 yang mengandung RNA-se (bebas DNA-se)
8. Pasir kuarsa (Glass beads)
9. Tissue
IV. CARA KERJA
1. Daun nangka dan cabai dibekukan sebelumnya selama 24 jam sebelum dilakukan penelitian , sedangkan daun kemangi dibiarkan masih segar sesaat sebelum dilakukan penelitian. masing-masing tanaman ditimbang sebanyak 200mg
3. Hancurkan jaringan daun cabai dan daun kemangi tanpa ditambahn pasir kuarsa menggunakan mortar dan pestle yang sebelumnya sudah disterilisasi dan didinginkan terlebih dahulu
4. Larutan buffer CTAB 20 ml ditambahkan, kemudia daun digerus lagi sampai halus
5. Daun yang sudah hancur kemudian dipindahkan ke microtube 20 ml.
6. Dicampur menggunakan vortex selama 2-3 menit
7. microtube berisi daun kemudian dihangatkan dalam waterbath dengan suhu 65° C selama 45-60 menit. Tiap 15 menit bahan dikocok secara berselang.
8. Endapan yang munul kemudia dikurangi sampai batas 1 ml
9. Larutan CIAA ditambahkah sebanyak 1 ml, kemudian aduk pelan selama 5 menit
10. microtube disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4° C
11. Fase cair (supernatan) yang terbentuk pada bagian atas dipindahkan ke dalam microtube 1,5 ml yang baru dengan menggunakan micropipet P200 yang sudah diatur ikuran volumenya. Ukur supernatan yang telah diambil
12. Larutan isopropanol sebanyak 0,6 volume supernatan ditambahkan, dan larutan Na-asetat sebanyak 0.1 volume supernatan juga ditambahka
13. Capuran diaduk pelan
14. Campuran disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu ruang
15. Campuran dicuci dengan etanol dingin 70%
16. Spin dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit
17. Larutan etanol dibuang, lalu DNA dikeringanginkan
18. Keberadaan DNA dan warna DNA diamati
19. Larutan buffer TE ditambahkan disesuaikan dengan besarya pelet DNA yang diperoleh
V. HASIL PENGAMATAN
Keterangan: V = sebelum disentrifugasi V = sesudah disentrifugasi
VI. PEMBAHASAN
perlakuan sebelumnya pada hasil DNA yang akan didapatkan. Seharusnya ada perlakuan menumbuk daun tanaman dengan menambah nitrogen cair. Namun karena nitrogen cair sedang tidak ada stok, maka perlakuan ini ditiadakan.
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel. Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel. Sampel dari daun macam-macam jenis tanaman adalah sebanyak 200 gram. Tulang daun tidak boleh ikut dalam penelitian, maka membuang tulang daun sebelum ditimbang sangat diperlukan. Tulang daun tidak ikut ditumbuk karena DNA tanaman tidak ada pada tulang daun, melainkan pada jaringan klorofil daun. Larutan CTAB pertama-tama ditambahkan sebanyak 1 ml untuk membantu memudahkan proses penggerusan. Larutan buffer CTAB ini sebaiknya dihangatkan dulu sebelum digunakan untuk membantu dalam penggerusan DNA. Larutan CTAB bisa diletakkan di dalam waterbath untuk menjaga larutan buffer tetap hangat. Setelah daun digerus menjadi halus dan telah dipastikan bahwa daun sudah benar-benar hancur sampai dengan ke jaringannya, tuang ekstrak daun tersebut ke dalam microtube dengan volume 2 ml. Untuk mencuci mortar dan pestle dari ekstrak daun yang masih menempel, larutan CTAB sebanyak 1 ml bisa ditambahkan kembali sebelum ditambahkan lagi ke dalam microtube 2 ml yang sebelumnya sudah terisi ekstrak daun dan larutan CTAB sebanyak 1 ml. Ketika semua sudah dimasukkan dalam microtube, maka akan didapatkan ekstrak daun masing-masing tanaman pada microtube terisi penuh sebanyak 2 ml.
nukleat dan polisakarida asam yang menempel pada DNA. Tiap 15 menit dalam 45 menit proses perendaman, microtube diaduk perlahan untuk memisahkan DNA pada larutan ekstraksi tersebut. Setelah 45 menit, padatan di bagian bawah microtube dibuang, lalu ditambah dengan larutan buffer CIAA (Khloroform : Isoamil alkohol) 24 : 1. Larutan CIAA ini berfungsi untuk mendenaturasi protein, memisahkan fase organik dari fase aqueous (larut air/encer), untuk membersihkan DNA dan kortoran sisa protein dan polisakarida dari larutan dan mengurangi pembentukan busa selama ekstraksi. Padatan dibagian bawah yang dapat dibuang karena pada bagian bawah tersebut adalah asam nukleat dan polisakarida asam dari tanaman tersebut, sedangkan DNA berada di permukaan atas yang berwarna agak bening dibanding dengan padatannya. Microtube tersebut kemudian didinginkan pada icebath selagi menunggu proses sentrifugasi.
dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat.Proses presipitasikembali dengan etanol atau isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Keller dan Mark (1989) menerangkan bahwa pencucian kembali pellet yang dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan untuk menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi dengan isopropanol untuk menghilangkan residu garam (Ausubel et al., 2003). Jika DNA seperti lendir atau jelly di bawah larutan sudah tampak, dapat diartikan proses penumbukan berhasil menembus jaringan dengan baik sehingga DNA zang diperoleh cukup banyak. Sentrifugasi kembali pada kali ini dimaksudkan untuk membuat pelet DNA zang telah diperoleh, namun sebelum itu supernatan harus dibuang terlebih dahulu secara hati-hati jangan sampai DNA yang telah diperoleh ikut terbuang.
disentrifugasi didapatkan DNA daun nangka berwarna putih, DNA daun cabai berwarna putih dan DNA daun kemangi berwarna kekuningan yang menunjukkan bahwa DNA yang diperoleh belum cukup bersih.
Kelompok 2 menumbuk daun nangka segar tanpa ditambah pasir kuarsa, lalu daun cabai yang dibekukan dengan ditambah pasir kuarsa dan daun kemangi yang telah dibekukan ditumbuk tanpa ditambah pasir kuarsa. Sebelum disentrifugasi DNA yang berupa lendir atau jelly sudah tampak dari ketiga jenis tanaman tersebut dan semuanya berwarna putih. DNA yang diperoleh setelah sentrifugasi dari tanaman nangka dan tanaman cabai cukub banyak jumlahnya dan semua berwarna putih yang berarti DNA yang diperoleh bersih, sehingga larutan buffer TE yang ditambahkan masing-masing sebanyak 100 µl, dan tanaman kemangi sebanyak 200 µl.
Kelompok 3 menumbuk daun nangka yang dibekukan tanpa ditambah pasir kuarsa, lalu daun cabai segar tanpa ditambah pasir kuarsa dan daun kemangi yang telah dibekukan ditumbuk dengan ditambah pasir kuarsa. Sebelum disentrifugasi DNA yang berupa lendir atau jelly sudah tampak dan semuanya berwarna putih pada tanaman cabai dan kemangi, sedangkan pada tanaman nangka belum tampak. DNA yang diperoleh setelah sentrifugasi dari tanaman nangka dan tanaman cabai cukub banyak jumlahnya dan berwarna putih, sedangkan DNA tanaman kemangi setelah sentrifugasi berwarna kekuningan. Larutan buffer TE yang ditambahkan masing-masing sebanyak 100 µl, dan tanaman kemangi sebanyak 200 µl.
Kelompok 4 menumbuk daun nangka yang sudah dibekukan dengan ditambah pasir kuarsa, lalu daun cabai yang dibekukan tanpa ditambah pasir kuarsa dan daun kemangi yang telah dibekukan ditumbuk tanpa ditambah pasir kuarsa. Sebelum disentrifugasi DNA yang berupa lendir atau jelly sudah tampak dan semuanya berwarna putih. DNA yang diperoleh setelah sentrifugasi dari tanaman nangka cukub banyak jumlahnya dan semua berwarna putih, sehingga larutan buffer TE yang ditambahkan untuk DNA tanaman nangka sebanyak 100 µl, kemudian tanaman cabai dan tanaman kemangi sebanyak 200 µl.
Kelompok 6 menumbuk daun nangka yang dibekukan tanpa ditambah pasir kuarsa, lalu daun cabai segar tanpa ditambah pasir kuarsa dan daun kemangi yang telah dibekukan ditumbuk dengan ditambah pasir kuarsa. Sebelum disentrifugasi DNA yang berupa lendir atau jelly tampak DNA berwarna putih hanya pada tanaman cabai, sedangkan pada tanaman lainnya belum tampak. DNA yang diperoleh setelah sentrifugasi dari tanaman nangka dan tanaman cabai cukup banyak jumlahnya dan semua DNA dari ketiga jenis tanaman tersebut berwarna putih. Larutan buffer TE yang ditambahkan pada DNA tanaman nangka sebanyak 100 µl, DNA tanaman cabai sebanyak 150µl dan tanaman kemangi sebanyak 200 µl. Bila melihat hasil pengamatan dari tiap-tiap kelompok, pengaruh penambahan pasir kuarsa/glass beads atau dengan dibekukanterlebih dahulu dalam membantu pengoyakan DNA pada jaringan tumbuhan tidak terlalu berpengaruh signifikan. Pengoyakan DNA paling penting saat proses penumbukan dan penggerukan diatas mortar dan pestle. Proses ini harus dilakukan dengan seksama dan penuh perhatian ekstra agar jaringan dapat teroyak sempurna dan DNA berhasil diperoleh. Jadi penambahan pasir kuarsa dan nitrogen cair untuk membantu agar DNA yang diperoleh sebetulnya bisa menjadi lebih banyak. Namun jika pasir kuarsa maupun nitrogen cair tidak ada, DNA masih dapat diperoleh dengan jumlah yang kurang lebih sama dengan DNA yang ddihasilkan dari penumbukan yang menggunakan pasir kuarsa. Proses pencucian DNA untuk menghasilkan DNA yang bersih kebanyakan berhasil dilakukan oleh semua kelompok, namun kelompok 1 dan kelompok 3 memperoleh DNA tanaman kemangi berwarna agak kekuningan. Hal ini dapat disebabkan karena kurang bersihnya proses pencucian DNA dengan larutan buffer maupun dengan etanol, atau disebabkan dari jaringan tanaman tersebut yang kotor dan agak bandel untuk dibersihkan. DNA banyak ditemukan pada tanaman cabai kemudian tanaman nangka. Daun tanaman cabai dan tanaman nangka yang digunakan pada praktikum kemungkinan merupakan daun berumur optimal sehingga keberadaan DNA masih banyak. Berbeda dengan daun-daun yang masih muda atau sudah tua.
VII. KESIMPULAN
Pada hasil yang diperoleh dari praktikum isolasi DNA ini, dapat disimpulkan bahwa ketika praktikum berlangsung, prinsip-prinsip isolasi DNA selalu diterapkan. Prinsip-prinsip DNA tersebut adalah penghancuran dinding sel dengan cara menumbuk dan menggerus diatas mortar dan pestle, lalu penghilangan protein dan RNA menggunakan beberapa larutan buffer, pengendapan DNA atau presipitasi DNA dengan menambahkan larutan isopropanol dan Na-asetat pada sampel, dan terakhir adalah pemanenan DNA yaitu dengan diperolehnya
pelet DNA.
Melalui keempat prinsip isolasi DNA tersebut jika dilakukan dengan baik, akan menghasilkan kuantitas dan kualitas DNA yang baik. Dapat dikatakan baik jika DNA yang diperoleh banyak dan sudah tampak keberadaan sebelum sentrifugasi terakhir. Kemudian warna DNA yang baik adalah yang berwarna putih. Jika warna DNA selain berwarna putih, berarti DNA masih kotor akibat proses pencucian yang kurang bersih. Untuk mendapatkan DNA yang baik dan bersih memang tidak mudah dan diperlukan kesabaran dan kehati-hatian yang ekstra. Karena jika perlu proses pencucian DNA dilakukan 2-3 kali agar DNA yang dihasil benar-benar bersih dan baik.
VIII. DAFTAR PUSTAKA
Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techiques in Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ,USA.
Surzycky, R. 2000. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Inc., Belmont
Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada tanggal 2 Juli 2015, pada pukul 23.00 WIB.
